Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Клеточный lymphocytotoxicity (ХМЛ), анализы могут быть использованы для тестирования аутореактивных ответы и изучение механизмов смерти клеток в пробирке. Тем не менее, с использованием живых-клеточной конфокальной микроскопии изображений с флуоресцентными красителями, типа и кинетики гибели клеток, а также путей использованы может быть изучен более детально.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, J., Grieshaber, S., Mathews, C. E. Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (52), e2724, doi:10.3791/2724 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Подготовка клетки

  1. Культуры клеток-мишеней: Культура мыши бета клеточных линий, NIT-1 и NIT-4, было описано выше 1,2 в DMEM с добавлением 10% FBS, 0,02% BSA, Номера для незаменимая аминокислота, 15 мм HEPES, 16.5мм Glocose и пенициллина / стрептомицина. Для 51 Cr маркировки, семенами клеток в плоскодонных 96-луночного планшета для культуры в 5х10 4 клеток / лунку в 200 мкл культуральной среды. Для микроскопии экспериментов, семенные клетки в 8-а-Так Лаборатории II патрон 5x10 покровного стекла на 4 на камеру в 500 мкл культуральной среде, и позволяют выращивать в течение 48 часов до использования в цитотоксичности экспериментов.
  2. Управление Т-клеток линии культуры: Используйте Jurkat клеточной линии (АТСС, CD3 + лимфоцитов человека клеточной линии) в качестве отрицательного контроля. Культуры клеток в Jurkat RPMI1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1,5 г / л бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES и 1,0 мМ пирувата натрия.

2. Сбор и активации эффекторных аутореактивных CD8 + Т-клеток

NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] и NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] были приобретены у лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME) и разводят в нашей мыши объекта. F1 гибридное потомство от вязки из NOD-AI4a с NOD-AI4b [NOD-AI4a / B] развития диабета в 3-5 недель. Все мыши были размещены в конкретный возбудитель, свободных средств и утверждается животных соответствующие учреждения по уходу и использованию комитета.

  1. Эвтаназии 3-4 недельных NOD-AI4a / б мышей использованием CO 2.
  2. Сбор селезенки от мышей. Эвтаназии мышей готовы с этанолом брызг и возбуждено по хирургической капотом. Селезенки удаляются и положить в ледяной буфером HBSS немедленно.
  3. Сбор клеток селезенки использованием 7 мл стеклянного гомогенизатора. Два-три селезенки каждого ставятся в 5 мл холодной HBSS и гомогенизировали с 7 мл стеклянного гомогенизатора. Гомогенат собирают и центрифугируют при 1200rpm в течение 5 минут при температуре 4 ° С с использованием Sorvall RT7 + центрифуги. Сотовые гранулы собираются.
  4. Удаление эффекта красных клетках крови с использованием гипотоническая обработка раствором. Пеллеты относятся с 5 мл гипотонического раствора / селезенки на льду в течение 5 минут, затем нейтрализуют добавлением равного объема HBSS. Сбор клетки центрифугированием, как описано выше, и ресуспендируют в 50 мл HBSS. Pass приостановлено клетки через клеточные сито и считать использование гемоцитометра с окрашиванием TrypanBlue.
  5. Активация клеток. Ресуспендируют клеток 5х10 6 / мл и активации с использованием 3-х дневный культуры с 0,1 мкМ AI4 mimotope (амино YFIENYLEL последовательность кислота) и 25 ед / мл ИЛ-2 в RPMI1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1,5 г / L бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES и 1,0 мМ пирувата натрия.

3. 51 Cr релиз анализа для изучения CML

  1. Этикетка клетки цель: добавить 51 Cr с клетками-мишенями на 1 мкКи / лунку и культуры в течение 3 часов, и промыть 3 раза культуральной среде.
  2. Приостановить эффекторных клеток в RPMI 1640, как указано в шаге 2,5, так что конечный объем в каждую лунку добавляют 200 мкл.
  3. После последней промывки меченых клеток-мишеней, добавляют активированный эффекторные клетки к клетке-мишени культур на желаемом эффекторных до цели (E: T) коэффициентов. Мы обычно используем E: T отношений на 0,4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 и 50:1.
  4. Добавьте свежие изменение RPMI 1640 среде (см. шаг 2.5) до 6 скважин клеток-мишеней в качестве спонтанного лизиса контроль.
  5. Сотрудничество культуры эффекторов и клеток-мишеней в течение 16 часов.
  6. Сбор супернатант в 6x50 мм Известь стеклянные трубки
  7. Lyse клетки путем добавления 100 мкл 2% SDS и пипетки несколько раз мягко.
  8. Сбор Клеточный лизат в другой набор 6x50 мм Известь стеклянные трубки.
  9. Вымойте скважин раз с чистой H 2 O и добавить мыть в трубах Клеточный лизат.
  10. Граф супернатанты и клеточных лизатов с помощью гамма-счетчика.
  11. Рассчитать конкретных лизис следующим образом:
    Уравнение 1

4. Окрашивание клеток для живого изображения ячейки

Среди наиболее часто используемых митохондриального мембранного потенциала красители, TMRM экспонатов мере митохондриальной токсичности. 3 Таким образом, мы выбираем TMRM для этих исследований жить изображений клеток.

  1. Подготовка 40 мМ фондовом TMRM раствора в ДМСО и хранить при температуре -20 ° C. Сделать [25 нм] свежие рабочего раствора в фенол красный без DMEM со всеми дополнениями для NIT-1 клеточная культура 1.
  2. Пятно целевой NIT-1 клеток с TMRM 25 нм в течение 30 мин при 37 ° C.
  3. Замените СМИ со свежей средой, содержащей 5 нМ TMRM для поддержания равновесного распределения красителя 4.
  4. Граф активированный эффекторные Т-клетки AI4 использованием гемоцитометр.
  5. Пятно активированный эффекторных AI4 Т-клеток с 1 мкл / мл для Picogreen5 минут при комнатной температуре и мыть с фенолом красным без питательной среды в 3 раза.

5. Оценка Т-лимфоцитов-опосредованных бета гибели клеток с использованием живого изображения ячейки

  1. Горы покровного стекла патрон с окрашенных клеток NIT на сцене Zeiss LSM 510 конфокальной микроскопии. Удалить вкладку с dremmel и газовой стерилизации стеклянных патрон с оксидом etheline. Этап оснащен жить-клеточной изображений камера, которая с контролем температуры на 37 ° С и 5% CO 2 с влагой.
  2. Добавить активируется и окрашенных Т-клеток, назначенных камер при разных E: T отношений.
  3. Добавлен же количество окрашенных клеток Jurkat с контролем камер.

6. Получение изображения в реальном времени клетка

Микроскоп снабжен моторизованным этапе, что позволило нам неоднократно получать изображения в разных местах, от одного или разных камер автоматически за время хода эксперимента.

  1. Использование 63x объектив нефти, получать изображения с интервалом в каждые 3 минуты в общей сложности 300 кадров в месте.
  2. Обнаружение TMRM окрашивания использованием длины волны возбуждения 543 нм и набор фильтров для излучения 565-619 нм
  3. Обнаружение Picogreen окрашивания использованием возбуждении 488 нм и набор фильтров для излучения 500-630 нм. Видео было создано с помощью Zeiss LSM программного обеспечения.

7. Конвертация видео для публикации

  1. Использование программного обеспечения Zeiss LSM, создавать несжатый файл фильма в формате AVI.
  2. Для преобразования видео в формат опубликованы, импорта видео в пакет программного обеспечения Фиджи ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ц / ) распределения, используя Bioformats плагин из локусов ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
  3. Регулировка яркости и контрастности, чтобы сбалансировать зеленый и красный сигналы и частота кадров была установлена ​​на 2 кадр / сек, используя меню анимации вариантов.
  4. Crop видео до 512 х 512 пикселей и экспорта, как несжатый файл AVI.
  5. Откройте этот файл AVI в Программное обеспечение QuickTime 7 (Apple Computer, Купертино, Калифорния), а также сжатие и экспорта в открытый формат файлов видео H264/MPEG-4 при 1200 кбит / сек.

8. Представитель Результаты:

  1. Представитель результате анализа 51 Cr ХМЛ. На рисунке 1 показана представитель результате анализа ХМЛ, где процент конкретных лизис (Y ось) увеличивается по мере создания эффектов: Целевые отношения (оси Х) возрастает. Целевые клетки островков первичной изолированной от иммунодефицитных NOD RAG1-/ -. Мышей и помечен 51 Cr. Спленоциты от NOD.AI4α / β трансгенных мышей изолированы и активированные как описано в шаге 2 выше. Цели и эффекторы были совместно культивировали в течение 16 часов. Процент конкретных лизис рассчитывается как описано в шаге 3,11 выше.
  2. Два представителя (положительные и отрицательные) результаты Т клеточного бета-клеток митохондриального мембранного потенциала диссипации представлены. Клетки окрашивали и реакции регистрируются как описано в пунктах 4, 5 и 6 выше, видео-файлы создаются как в шаге 7. Видео 1: клетка мыши бета линии NIT-1 была запятнана митохондриального мембранного потенциала красителя TMRM (красный). Активированный, аутореактивных CD8 + Т-клеток AI4 (Витраж зеленый с Picogreen) были инициаторами культивировали с этим NIT-1 клетки на E: T отношением 50:1. NIT-1 митохондриального мембранного потенциала рассеивается постепенно в течение 400 минут длительности, но только в кластеры, которые взаимодействуют с AI4 Т-клеток. Видео 2: В качестве контрольного эксперимента, NIT-1 клетки окрашивали TMRM и совместно с культурно Picogreen окрашенных клеток Jurkat на E: T отношением 50:1. Jurkat клетки человеческого Т-клеточной линии, МНС неверными. NIT-1 клеток поддерживается митохондриального мембранного потенциала на всем протяжении от 400 минут со-инкубационный период. Jurkat клетки не взаимодействует с NIT-1 кластеров и, следовательно, не вызывают убийства.

Рисунок 1
Рисунок 1 представитель результате ХМЛ, используя в качестве клеток-мишеней первичных островков изолированы от иммунодефицитных NOD.Rag1-/ -. Мышей и спленоцитов от NOD.AI4α / β трансгенных мышей. Цели и эффекторы были совместно культивировали в течение 16 часов. Процент конкретных лизис возрастает по мере создания эффектов: увеличение целевой отношение.

Видео 1. Мышь бета-клеточной линии NIT-1 была запятнана митохондриального мембранного потенциала красителя TMRM (красный). Активированный аутореактивных CD8 + Т-клеток AI4 (Витраж зеленый с Picogreen) были инициаторами культивировали с этим NIT-1 клетки на E: T отношением 50:1. NIT-1 митохондриального мембранного потенциала диссипацииТед постепенно в течение 400 минут длительности, но только в кластеры, которые взаимодействуют с зелеными AI4 Т-клеток. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео .

Видео 2. NIT-1 клетки окрашивали же, как описано в Video 1 и со-культивировали с Picogreen окрашенных человека Jurkat клеточной линии T. NIT-1 клетки в состоянии поддерживать митохондриальный мембранный потенциал продуманы продолжительностью 400 минут. Jurkat клетки не взаимодействует с NIT-1 кластеров и, следовательно, не вызывают убийства. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цитотоксических Т-клеток опосредованной смерти бета-клеток является основным патофизиологии T1D 5. CML анализов использованием 51 Cr релизе позволяют исследовать степень эффекторных-целевой отклик 6. Тем не менее, детальный процесс и пути Т клеточного гибели клеток бета-прежнему полностью не поняты. Так как митохондрии имеют решающее значение для бета-функции клеток и смерти 7, мы сосредоточились на митохондриальные изменения во время визуального ХМЛ. Митохондриальная мембранного потенциала диссипации рано и необратимый шаг в митохондриальной функциональных изменений, приводящих к апоптозу 8. Использование конфокальной микроскопии живых изображений клетки, мы были в состоянии представить себе бета-клеток митохондриальной диссипацию мембранного потенциала при взаимодействии с аутореактивных Т-лимфоцитов. Эта экспериментальная установка имитирует хотя бы часть того, что случается с бета-клеток в процессе развития СД1. Ограничения этого эксперимента являются: нагревание вставки для живого изображения ячейки оснащены нашими Zeiss микроскоп был разработан для 3,5 см чашках Петри, поэтому при использовании 8-а-Так Лаборатории II патрон покровного стекла (для одновременной записи обработанных и контроля), ручка на покровного стекла патрон должен быть удален, чтобы вписаться в микроскоп вставки. Кроме того, поскольку нагревание вставки предназначен для 35-мм блюдо Петри, когда мы используем 8-а-Так Лаборатории II патрон покровного стекла, мы были ограничены центр 4 скважины. Это ограничение может быть легко решена путем установки отопления вставить специально разработан для лаборатории-Tak II патрон покровного стекла от Zeiss. Возможные изменения этого эксперимента в том числе с использованием генетически флуоресцентные эффекторные Т-клетки атаковать клетки-мишени, или тестирование сигнальных путей цитокинов и межклеточных взаимодействий. Бета гибель клеток в патогенезе T1D представляет собой сложный процесс, включает в себя несколько путей, включая, но не ограничиваясь, гранзима и перфорина 9, Fas / Fas лиганд 9, цитокинов 10. Есть флуоресцентных субстратов каспаз и гранзима B имеются в продаже, с этим выбором можно изучать пути и последовательность событий, в ходе бета-клеточной смерти.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Университета Флориды Институциональные уходу и использованию животных комитета.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья и DK074656 AI56374 (CEM), а также несовершеннолетних исследовательского фонда диабета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cr-51 PerkinElmer, Inc. NEZ030500IMC
PBS Cellgro 21-040-60
Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) Invitrogen T668
Picogreen Invitrogen P7581
AI4 mimotope mimotopes.com amino acid sequence: YFIENYLEL
IL-2 R&D Systems 485-MI
DMEM Invitrogen 11885
FBS Hyclone SH30071.03
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8412
HEPES Cellgro 25-060-Cl
MEM Non-Essential Amino Acids GIBCO, by Life Technologies 11140
Penicillin/Streptomycin Gemini Bio Products 400-109
Phenol red-free DMEM Sigma-Aldrich D5303
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Inc. HeraCell 150i Kept sterile for cell culture
Biological safety cabinet Thermo Fisher Scientific, Inc. Forma 1440
Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass Fisher Scientific 14-958-A
Gamma Counter PerkinElmer, Inc. Wizard 1470 Automatic Gamma Counter
Confocal microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 510 Meta Confocal With motorized stage and live cell chamber
Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) Eppendorf
Tubes (Amber) Fisher Scientific 50819772
Centrifuge Sorvall, Thermo Scientific 75004377
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
Upright Microscope Carl Zeiss, Inc. Axioskop40
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice Jackson Laboratory 004347
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice Jackson Laboratory 004348
NOD-AI4α/ β F1 mice N/A N/A Bred in UF animal facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
  2. Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. (2010).
  3. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  4. Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
  5. Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
  6. Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. 235-240 (2001).
  7. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
  8. Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
  9. Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
  10. Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics