무균 실험실 기술 : Serological Pipettes 및 Micropipettors로 볼륨 이동

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Summary

연구실에 근무하면 오염의 소스를 최소화하기 위해 필수적입니다. 무균 기법이 아닌 멸균 표면과 접촉을 피하면서 문화와 시약의 양도를 허용 절차를 말합니다. Serological pipettes 및 micropipettors는 실험에 사용되는 솔루션의 불임을 손상시키지 않고 정확한 볼륨을 측정하는 데 사용됩니다.

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Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), e2754, doi:10.3791/2754 (2012).

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Abstract

미생물은 어디 에나있다 - 공기, 토양, 그리고 인체뿐 아니라 실험실 벤치 및 컴퓨터 키보드와 같은 생명이없는 표면. 미생물의 편재는 실험실의 잠재적인 오염 물질의 풍부한 공급을 만듭니다. 실험의 성공을 보장하기 위해, 장비, 작업 표면에 오염 물질의 수를 최소화해야합니다. 미생물학의 많은 실험 중에서 공통는 세균 세포 또는 바이러스 입자를 포함하는 문화의 측정 및 전송과 관련된 기술입니다. 멸균 작업 공간을 준비 멸균 매체가 필요합니다 (1), (2) 정확하게 설정하고 정확하게 액체의 무균 전송을 위해 악기를 읽고, 그리고 (3) 적절하게, 문화의 flasks, 병 악기를 조작을하지 않는 무균 표면에 연락하거나 훼손없이 이렇게하고하려면 멸균 입력란 내의 튜브. 이 절차를 배우는 것은 훈련과 연습을 요구하고있다. 처음에는 동작이 느리고 신중한 및 무균 t 당분간 목표로 제어되어야벤치에서 작업할 때 제 2의 천성이 될 echnique. 여기 분젠 버너에 의해 만들어 멸균 분야 내에서 serological pipettes 및 micropipettors를 사용하여 볼륨을 측정하는 단계를 소개합니다. 볼륨은 microliters (μl)에서 사용하는 악기에 따라 밀리리터 (ML)로 다양합니다. 일반적으로 양도 액체는 멸균 국물이나 화학 솔루션뿐만 아니라 세균성 문화와 파지 주식을 포함합니다. 이 절차를 수행하여, 학생에게 수 있어야한다 :

  • 분젠 버너 불꽃에서 만든 멸균 분야 내에서 작동합니다.
  • 악기 불임을 손상시키지 않고 serological pipettes를 사용하십시오.
  • serological pipettes로 액체를 대기음, 정확하게 피펫에 졸업 자국으로 액체에 의해 형성된 초승달 모양을 정렬하여 보정 볼륨을 읽고.
  • 문화 병, flasks, 튜브 및 액체 전송 중에 멸균 각각의 모자 보관하십시오.
  • 플라스틱 대 유리 serological의 핍에 대해 서로 다른 애플 리케이션을 식별ettes.
  • micropipettors에 대한 국가의 정확성 제한.
  • 정확하고 정확하게 micropipettors에 볼륨을 설정합니다.
  • 제대로 올바른 볼륨을 대기음하고 전송하는 micropipettor에서 첫 번째와 두 번째 정거장을 사용하는 방법을 알아요.

Protocol

1. 무균 작업 영역 준비

  1. 작업 영역의 모든 살균 절차를 시작하기 전에 살균 비누와 따뜻한 물로 깨끗이 손을 씻는다.
    • 손을 당신은 귀하의 실험 조작의 오염이 의심되는 언제든지 다시 씻어주십시오.
  2. 실험실 벤치에 작업 영역을 cluttering 모든 자료 치워. 제거를 미리 moistened 살균제는 용기에서 닦아하고 그 구역 전체를 닦아냅니다. 살균제가 증발하도록 허용 - 건조 닦아 없어!
    • 이러한 알코올 (이소프로판올 또는 70 % 에탄올) 또는 페놀 수지 화합물 (O-phenylphenol)로 disinfectants를 사용합니다.
    • aerosolization, 또는 세균 세포 및 미생물의 오염 물질의 확산을 포함하는 미세 안개의 생산을 방지하기 위해 스퀴즈 병의 살균제를 분배하지 마십시오.
    • 미생물의 탈수는 표면 오염을 제거하다하는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다.
    • 누군가가 최근 실험실 벤치를 사용하여 벤치 톱은 소독제로 닦여도, 항상 벤치를 닦고하여 실험 시간을 시작합니다.
  3. 살균제가 완전히 건조되면 분젠 버너에 불을 점화기를 사용합니다. 푸른 원추가 불꽃의 가운데에 볼 수 있도록 불꽃을 조정합니다. 화염은 이제 updraft을 생산하거나, 따뜻한 공기가 화염 (그림 1)에서 최대 떠서 멀리있는 공기 대류 전류있다. 열이 상승함에 따라 미생물이나 먼지 입자는 즉시 작업 영역에서 상향과 멀리 강요하고 있습니다. 천천히 걸어, 신중하게, 그리고 신중하게 분젠 버너에 의해 만들어이 지역 내에서 항상, 멸균 분야로 언급. 전체 절차를 수행하는 동안에 분젠 버너를 유지.
    • 푸른 원추형의 팁은 불꽃의 가장 뜨거운 부분입니다.
    • 극적으로 AI를 변경 신속한 움직임으로 updraft 방해하지 않도록주의실험실 벤치 주변에 R 전류. 분젠 버너로 updraft를 생성하는 것은 벤치에 또는 개방형 병, 튜브 또는 작업 영역에서 flasks 형성한 미생물과 먼지의 가능성을 최소화합니다.
  4. 멸균 현장 근처에 실험실 벤치에서 절차에 필요한 모든 소모품을 마련. 모든 자료가 제대로 분류되어 있는지 확인합니다.
    • 공급 serological pipettes 및 micropipettors, 무균 배양 튜브, 멸균 flasks, 국물이 들어있는 미디어 병, 멸균 microcentrifuge 튜브, micropipettor 팁, 튜브를위한 랙, 세균 세포 배양 및 파지 주식을 포함할 수 있습니다.
    • 리퀴드 미디어 액체 설정에 적어도 15 분 동안 121 ° C에서 압력솥으로 소독하여야한다. 미디어의 큰 볼륨 (> 1L)는 더 이상 압력솥 시간을 필요로합니다. Labware는 중력 (건조) 설정에서 최소 30 분 동안 121 ° C에서 압력솥으로 소독하여야한다.
    • 일반적으로 무균 솔루션 4에 저장될 수 있습니다° C에서 최대 5 개월까지입니다. 저장 시간이 대폭 같은 항생제와 같은 불안 정한 요소를 포함하는 솔루션을 감소합니다 - 항상 제조 업체의 권장 사항을 확인합니다.

2. Serological Pipettes를 사용하여 액체를 전송하기

  1. Serological pipettes은 여러 크기와 옵션에 들어가도 : 플라스틱이나 유리, 일회용 또는 재사용, 전원 연결 또는 분리. 이들은 0.1 ML 25 ML에 이르기까지 볼륨을 제공하도록 조정됩니다.
    • serological pipettes 일반적인 크기는 5 ML 10 ML 25 ML이며, 0.1 ML 이상 (패널 그림 2)의 무균 액체 전송을 위해 사용해야합니다. 또한 최대 100 ML에 볼륨을 제공할 수있는 더 큰 serological pipettes가있다하지만,이 프로토콜의 초점은보다 일반적인, 작은 크기의 pipettes에 있습니다.
    • 생면 플러그인으로 미리 소독 pipettes은 미생물학과 조직 배양 실험을 위해 필요합니다. 플러그를 제거하지 말아야피펫의 P, 그것은 피펫을 overfilling의 장애물로 작동하도록 설계되었습니다.
    • 다른 응용 프로그램은 플라스틱 대 유리 serological pipettes 위해 부릅니다. 유리는 유기 용제를 위해 필요합니다. 실험실 벤치 톱에 BSL-1 실험을 수행할 때 둘 다 사용할 수 있습니다. 분젠 버너를 사용할 수 없습니다 BSL-2 생물과 Biosafety 캐비닛에서 작업하는 경우에만 플라스틱을 사용할 수 있습니다. 또한 플라스틱이 녹은 한천의 양도와 관련된 응용 프로그램에서 사용하는 것이 좋습니다.
    • Serological pipettes 두 유형이 있습니다 : TC ( "포함") 또는 TD ( "제공하는"). TC의 pipettes는 팁을 포함한 모든 볼륨을 전달하고 "터져"또는 지정된 볼륨을 얻을 씻어서되어야합니다. TD의 pipettes이 전달되지 않았습니다한다 팁에 작은 비트를 떠나 보정하고 있습니다. 그것이 어떤 종류를 확인하기 위해 상단 (그림 3) 근처에 피펫의 몸에 라벨을 확인하십시오. 가장 일반적으로 월 수 있습니다 TD pipettes가 사용됩니다상단에있는 두 고리에 ked.
  2. 멸균 플라스틱 serological 피펫을 (또한 체적 전송 피펫이라) 타고 조심스럽게 바나나의 껍질처럼 물러나고하여 탈지면 플러그와 끝부분에 종이 슬리브를 제거 - 전체 슬리브를 제거하지 끝을 보호 양도할 수있는 액체와 접촉 것이다 피펫. 손으로 피펫의 단지 상단을 (졸업 부호 이상) 방치.
    • 좋은 치료는 그것이 무균 유지 옮겨졌으며 경우에도 사용 피펫으로 무균 용액으로 이동하지 마십시오.
    • 유리 serological pipettes는 일반적으로 금속 용기 (그림 2의 패널 B)에 저장됩니다. 용기의 상단을 낮춰서하면 다음 조심스럽게 뚜껑과 용기의 열린 끝을 캡, 그리고 불꽃을 제거하십시오. 감염되지 않았소 벤치에, 그 측면에 뚜껑을 내려 놓습니다. 수평으로 잡고하여 용기에서 한 피펫을 제거하고 부드럽게 흔들어 때문에 한두 pipet의 꼭대기오셨는 인치 정도 내밀어 쉽게 파악하실 수 있습니다. 그 측면에 용기를 버리고, 하나의 피펫을 제거하지만, 컨테이너의 다른 pipettes를 만지지 않도록주의하십시오. 손으로 피펫의 아래쪽 끝부분을 만지지 및 기타 비 멸균 표면과 끝부분의 접촉을 방지하지 마십시오.
  3. 접사 등 serological 피펫의 맨 끝에 전구, 펌프, 또는 총기와 같은 피펫 보조. 플라스틱 피펫에서 종이 슬리브를 제거합니다. 오른쪽에있는 피펫의 원조를 잡아.
    • 유리 피펫을 사용하는 경우, 1-3 초간 분젠 버너 불꽃의 파란 원추 통해 피펫의 하단 세번째 전달합니다. 그것이 화염 통과로 피펫 180 ° 회전합니다. 플라스틱 pipettes 튜브는 골조 수 없습니다.
    • 왼손잡이 경우 왼손에 피펫 원조를 개최하고 오른손으로 문화 병 튜브의 후속 조작을 실시합니다.
    • 최종 INC를 철수 때 오염 플라스틱 pipettes 발생하는 경향이슬리브의 피펫의 hes는 멸균 팁은 손에게 감명 소매 부분과 접촉으로 오기 때문이죠.
  4. 멸균 미디어를 포함하는 병 뚜껑을 제거합니다. 실험실 벤치에서 뚜껑을 배치하지만, 엄지손가락과 피펫 원조를 조작하면서 손가락과 오른손의 손바닥 사이를 개최하지 마십시오 색인과 같은 손 (그림 4)의 가운데 손가락. 45 ° 각도로 병을 개최하는 것은 개방 병 주위에 무균 필드를 만들고, 분젠 버너의 불꽃을 통해 병 림을 전달합니다.
    • 최고의 피할 비록 당신이 뚜껑을 내려놓고해야하는 경우, 그것이 감염되지 않았소 표면 엎드려서 얼굴을 놓으십시오. 최대 직면 캡으로 미생물이나 먼지 입자가 뚜껑의 내부 표면에 하강하는 원인이 공기 흐름을 만드는 객체 또는 손의 움직임에서 오염의 큰 기회가있다.
    • 불타는의 목적은 멸균을 위해 그러나 개통 O를 따뜻하게하지 않는 것입니다개장 시간 (즉, updraft)에서 F 병 및 공기 대류 전류를 생성하고 멀리. 따뜻한 공기는 상승 병을 출입 먼지 및 기타 오염 물질을 방지하는 데 도움이됩니다.
    • 가능한 한 시간이 아니라위한 무균 컨테이너 크게 뜨고. 그것은 절차 전반에 걸쳐 최소한으로 대기 중의 미생물의 항목의 점수를 유지하는 것이 중요합니다.
    • 멸균 용기가 열려있는 동안, 재채기 이야기 및 기타 부주의로 운동, 기침 마십시오.
    • 그들이 분젠 버너 불꽃 통과되고 나면 멸균 필드 (즉, 개방 병 또는 flasks, 튜브와 병 뚜껑의 안쪽)의 맨 위에 손과 손가락을 통과하지 마십시오.
    • 멸균 튜브 또는 병을 열 때 항상 열린 불꽃과 함께 작동합니다. 절대로 하나 이상의 튜브, 병, 또는 한 번에 플라스크 벤치에서 열린이 없습니다. 불타는을 여는시로와 닫는 튜브, 병 및 flasks 전에 즉시 수행하여야한다.
  5. serol의 팁을 놓으십시오멸균 미디어를 포함하는 병으로 ogical 피펫 다음 대기음, 또는 병에서 무균 샘플을 그립니다. 피펫으로 시료의 흐름을 제어하는​​ 피펫 보조를 사용하십시오. 정확하게 보정 피펫 (그림 5)에서 졸업 자국으로 액체 컬럼의 위에 형성된 초승달 모양을 정렬하여 피펫으로 그려진 볼륨을 참조하십시오.
    • 입 PIPET! 항상 (펌프, 전구, 또는 총) pipet 보조를 사용하지 마십시오.
    • aspirated 볼륨을 결정할 때 숫자의 순서에주의. 번호는 양쪽 방향으로 상단, 또는 그 반대로, 또는 종종 번 팁을 인쇄할 수 있습니다.
    • 볼륨을 읽을 때 항상지면에 수직, 피펫 세로를 개최하고, 사망의 눈 높이에서 액체 초승달 모양을 봅니다.
    • Serological pipettes은 일반적으로 5 ML 및 10 ML의 pipettes 25 ML의 pipettes위한 0.2 ML 용 0.1 ML은 작은 표시된 증가, 불과 정확한 있습니다. 나f를 더 정교이 필요, serological 피펫은 micropipettor와 함께 사용할 수 있습니다.
  6. 다시 한번 분젠 버너 불꽃을 통해 병의 가장자리를 통과 후, 용기에 뚜껑을 다시 넣으십시오. 옆으로 미디어 병을 설정합니다.
    • 병을 종료 서두를 분젠 버너로 자신을 태우지 마십시오.
  7. 왼손의 시험관이나 플라스크를 잡아. 위의 단계 # 4에 설명된대로 뚜껑을 제거하고 누르고 있습니다. 분젠 버너의 튜브 또는 술병의 테두리를 타는듯한하여 멸균 필드를 만듭니다.
  8. 튜브 또는 플라스크에 피펫의 미디어를 분배. 그것이 튜브 또는 플라스크 밖으로 끼얹으하지 않도록 시료의 흐름을 제어합니다.
    • 볼륨이 전체 볼륨을 전달하고 피펫 완전히 소모, 또는 특정 볼륨이 포인트 투 포인트 전송 (한 볼륨이 다른 마킹)를 수행하여 달성되고있다는 등의 측정 수 있습니다.
  9. 분젠 화상을 통해 튜브 또는 술병의 가장자리를 전달어 화염 다시 한번 다음, 뚜껑을 교체하십시오. 별도로 튜브 또는 술병을 설정합니다. 피펫 보조를 제거하고, 적절한 폐기물 용기에 피펫을 버리고.
    • 유리 serological의 pipettes 다시 소독하고 사용할 수있는 반면 플라스틱 serological pipettes은 일회용입니다. 적절한 폐기 유리 pipettes가 처음 내부와 외부 표면을 소독하기 위해 10 %의 표백제 용액으로 용기에 포장되어 있어야하는 동안 플라스틱 pipettes가 지정한 sharps 용기 (비닐 쓰레기 봉투 줄지어 딱딱한 상자)에 배치되어야합니다. 그런 다음 유리 pipettes은 철저하게, 실험실 세제로 씻어 증류수로 씻어서, 그리고 압력솥으로 소독하여야한다.
  10. 시리얼 dilutions를 수행할 때 세균성 문화 또는 파지 주식과 미디어를 inoculating하거나 이와 동일한 절차를 따라야한다.

3. Micropipettors를 사용하여 전송 액체

  1. 정확하게 측정하고 분 볼륨을 분배하는 것은 accompli 될 수 있습니다(; 패널 그림 6의도 Pipetman로 지칭) micropipettors를 사용하여 창고. 0.2-2 μl를위한 P2, 1-10 μl를위한 P10, 2-20 μl를위한 P20, P200 200-1000 μl를위한 20-200 μl 및 P1000 용 :이 악기는 각 특정 볼륨 범위의 다양한 크기로 왔습니다.
    • 그들은 정밀 악기 있기 때문에 신경을 써서 micropipettors 드셔보세요. 그들이 떨어져나와 손상될 수있는 그들 무인 실험실 벤치에 누워 두지 마십시오. pipettes은 부식성 화학 물질과 접촉하도록 허용하지 마십시오.
    • 1000 μl보다 큰 볼륨을 보려면 serological 피펫을 사용합니다.
    • 비록 불꽃 micropipettors, 튜브 및 플라스틱 팁, 분젠 버너에서 만든 멸균 필드 내에하지 일하게되었다. 튜브와 팁은 미리 소독을해야한다. micropipettors는 사용하기 전에 닦아 사전 moistened 살균제로 닦여 수 있습니다.
  2. 적절하게 볼륨을 보여주는 숫자 volumeter가 조절 노브를 돌려 설정할 수 있습니다. Adjus# 3 단계로 진행하기 전에 T는 볼륨.
    • 의도 범위 위에 조절 노브를 보이지 말라!
    • micropipettor의 볼륨 설정을 감소시 최대 정확도를 얻으려면 천천히 아니라 오버 슈트 졸업 마크를해야하고, 엄지 휠을 다이얼.
    • micropipettor에서 볼륨 설정을 증가시 최대 정확도를 얻으려면 회전의 1 / 3로 원하는 졸업 마크를 통과, 최대 엄지 휠 다이얼. 그럼 천천히하지 오​​버 슈트 졸업 마크를해야하고, 의도된 볼륨에 도달 엄지 휠을 다이얼.

    volumeter 세 숫자를 보여줍니다. micropipettor에 따라 번호가 다르게 해석하고 있습니다. 각 micropipettor가 가장 작은 졸업 점수에 불과 정확합니다.

    P2 : 0.2-2.0 μl 간의 볼륨하십시오. 상단 숫자는 microliters의 볼륨을 나타냅니다. 두 번째 숫자 indicat일이야 microliter의 에바 (0.1 μl), 그리고 세 번째 숫자는 microliter (0.01 μl)의 hundredths를 나타냅니다. 각 졸업 마크 microliter의 두 한 수천 (0.002 μl)의 증가 같습니다.

    P10 : 1.0-10.0 μl 간의 볼륨하십시오. 상단 숫자는 microliters 수십입니다, 이것은 일반적으로 "0"으로 설정된 경우에만 10.0 μl를 분배하면 "0"으로 설정 다른 두 숫자 "1"로 설정되어야합니다. 가운데 숫자는 microliters의 볼륨을 나타냅니다. 세 번째 숫자는 microliter의 에바 (0.1 μl)를 나타냅니다. 각 졸업 마크 microliter의 두 한 hundredths (0.02 μl)의 증가 같습니다.

    P20 : 2.0-20.0 μl 간의 볼륨하십시오. 검정의 최고 숫자는 microliters 수십입니다, 이것은 전용 20.0 μl를 분배하면 "0"으로 설정 다른 두 숫자 "2"로 설정되어야합니다. 블랙의 두 번째 숫자는 microliters의 볼륨을 나타냅니다. 빨간색의 세 번째 숫자 십을 나타냅니다microliter (0.1 μl)으로 ths. 각 졸업 마크 microliter의 두 한 hundredths (0.02 μl)의 증가 같습니다.

    P200 : 20.0-200 μl 간의 볼륨하십시오. 상단 숫자는 microliters 수백이다; 이것은 단 200 μl를 분배하면 "0"으로 설정 다른 두 숫자 "2"로 설정되어야합니다. 가운데 숫자는 microliters 수만에 적절하게 볼륨을 나타냅니다, 그리고 세 번째 숫자는 microliters의 볼륨을 나타냅니다. 각 졸업 마크 microliter의 두 한 에바 (0.2 μl)의 증가 같습니다.

    P1000 : 200-1000 μl 간의 볼륨하십시오. 상단 숫자는 microliters 수천을 위해이다; 이것은 일반적으로 "0"으로 설정되고 1000 μl를 분배하면 "0"으로 설정 다른 두 숫자 "1"로 설정되어야합니다. 가운데 숫자는 microliters 수백위한 것입니다. 아래 번호는 microliters 수십입니다. 각 졸업 마크는 두 (2 μl) microliters의 증가 같습니다.

    • 성능 검사 :이 악기는 매년 보정해야 정확성을 보장하는 것은 사양의 ± 5 % 이내로 접근해 유지됩니다. 최소 및 최대 설정이 의도한 볼륨에 대응해야하고, 수분을 측정하는 분석 스케일을 사용합니다. 예를 들어, 물 200 μl의 규모 무게는 접시에 이체로 P1000을 사용합니다. 물이 1 밀도를 가지고 있기 때문에, 그때 물이 1 ML은 1g (G)와 동일합니다. 따라서, 물 200 μl (0.2 ML)는 0.2 g과 동일해야합니다. 또한, 플런저 시스템을 사용하여 적절 때까지 팁 원하는 볼륨을 누설하지 않으며 유지할 수 있는지 확인하십시오.
  3. Micropipettors은 항상 플라스틱 일회용 팁을 함께 사용해야합니다. micropipettor의 총신의 끝 부분에 단단히 팁을 어울린다. 아래로 눌러 완벽한 밀봉을 보장하기 위해 약간 비틀어.
    • 팁은 보통 autoclaving 소독 수있는 플라스틱 상자에 포장됩니다. 도움말을 검색하는 팁 상자를 엽니다다음 공기 중의 오염 물질과 접촉을 최소화하기 팁 상자를 닫습니다.
    • 일부 팁 serological pipettes에 탈지면 플러그와 비슷한 필터를합니다. 이러한 조언은 종종 일반적인 조언보다 더 비싸다 그래서 전문적인 어플 리케이션을 위해 사용됩니다. 예를 들어, 필터 팁을 사용하는 등 클로로포름 또는 32 P-라벨의 DNA와 같은 방사성 액체 등 휘발성 화학 물질을 측정했을 때하는 것이 오염 얻는 micropipettor의 총신을 방지하는 데 도움이됩니다.
  4. 수직 위치에서 micropipettor 잡아.
    • micropipettor를 유지할 수있다는 것은 직립 내부 실행 micropipettor의 총신 오염으로부터 액체를 방지할 수 있습니다.
  5. (1) 레스트 위치, (2) 첫 번째 정류장, 그리고 (3) 두 번째 정류장 (그림 6, 패널 B) : micropipettor 세 가지 위치를 가지고 있습니다. 악기는 두 정류장 플런저 제도가 있습니다. 첫번째 정지는 두 가지 기능이 있습니다. 첫 번째 팁 whe으로 액체 원하는 볼륨으로 그리는 것입니다N 나머지 위치에 첫 번째 정류장에서 플런저를 릴리스. 두 번째 함수는 나머지 위치에서 첫 번째 정류장에 플런저를 누르 때 일각에서 액체의 대부분을 분배하는 것입니다. 또한 어떤 액체가 일각에 남아 두 번째 중지 dispenses로 플런저 우울증에.
    나머지 위치에서 첫 번째 정류장 플런저에 푸시 버튼으로 조준해. 설정의 볼륨과 동일 항공을 뺀 것입니다.
  6. 첫 번째 정류장에 푸시 버튼을 누른 상태에서 액체로 끝 젖어.
    • 병, 튜브 및 flasks의 측면에 micropipettor 자체를 만지지 마십시오, 그렇지 않으면이 혈관의 내부 표면은 오염이 될 것입니다. 단 팁 멸균 수 있습니다.
  7. 팁으로 액체를 대기음 위해 천천히 푸시 버튼을 놓으십시오. 푸시 다시 나머지 위치에되면 중지합니다. 액체는 팁 들어가게 수 있도록 잠시 기다리십시오.
    • 팁에있는 액체의 부피는 볼륨 O 같아야합니다micropipettor의 F 설정.
    • 그러한 분들 함유 글리세롤과 같은 점성 액체 팁을 입력 더 많은 시간을 필요로합니다.
  8. 액체에서 팁을 제거하고 시각적으로 수립 액체는 일각의 기대 수준에 도달했으며 일각에서 기포가 없는지 확인하는 팁을 검사한다.
    • 필요하다면, 액체를 추방하고 수동 micropipettor 진입 팁을 조입니다. 액체를 그려 다시 확인합니다.
  9. 액체를받는 튜브 벽에 붙어 각도 (10 ° ~ 45 °)에서 팁을 놓으십시오. 액체를 추방하려면, 천천히 첫 번째 정류장 플런저에 푸시 버튼을 우울하게. 다음 팁을에 잔류 액체를 추방하기 위해 두 번째 정류장에 푸시 버튼을 누르면 잠시 기다리십시오.
    • 너무 빨리 플런저를 누르하면 액체가 튜브에 바람직하지 거품을 튀기지하거나 생산할 것입니다 퇴학을 일으킬 수 있습니다.
  10. 나머지 위치로 플런저를 방출하기 전에 다시액체에서 팁을 이동합니다.
  11. micropipettor의 배출 버튼을 눌러 지정 sharps 폐기물 컨테이너에 조언을 폐기하십시오.

4. 작업 공간 정리

  1. 무균 기술의 사용을 필요로하는 실험이 완료되면, 분젠 버너를 끄고 다음 모든 소모품 및 시약 치웠어. 오염 물질이 저장 위치로 전송되지 않도록 닦아 사전 moistened 살균제로 labware (병, micropipettors, 피펫 팁 박스)의 외부 표면을 닦아주십시오.
  2. 장소는 적절한 폐기 용기로 유리와 유해 폐기물을 오염. 실험실 폐기물 장갑, pipettes, 도움말 및 튜브 등의 labware 등이 포함됩니다. 비 병원성 미생물 (BSL-1)과 함께 실험을 수행할 때 병원성 미생물 (BSL-2 이상)를 사용할 때 전염성 유해 폐기물이 생성되는 동안 비 전염성 유해 폐기물이 생성됩니다. 감염성 폐기물 autoclaved 또는 감염되지 않았소 befor 여야합니다전자 그것은 삭제됩니다. OSHA 및 제도적 환경 보건 및 안전 부서에서 제공하는 이들뿐만 아니라 BMBL (5 에드.)에서 설명하는 실험실 안전 지침을 따르십시오.
  3. 로 실험실 벤치에 전체 작업 영역을 닦고 사전 moistened 살균제 다시 한번 살균제가 증발 수 있도록 용기로 닦으십시오.
  4. 실험실을 떠나기 전에 살균 비누와 따뜻한 물로 깨끗이 손을 씻으십시오.

5. 대표 결과

액체를 전송 serological pipettes를 사용하는 샘플 응용 프로그램은 그림 7에 표시됩니다. 이러한 pipettes는 종종 박테리아 문화와 접종을 위해 미디어를 준비하는 미생물학 실험실에 사용됩니다. 예를 들어, 멸균 flasks 처음이 경우에는 Luria 국물 (LB)가 다음 세포의 소수 (예 : E. 대장균 등) 미디어에 추가됩니다, 문화 국물의 지정된 볼륨으로 가득차있다. serological P 사용하기ipette은 먼저 국물은 무균 플라스크에 미디어 병에서 전송되어야합니다. 이 경우, LB의 25 ML는 25 ML serological 피펫을 사용하여 125 ML 멸균 플라스크에 추가되었습니다. 다음, 국물은 E.으로 주사되어야합니다 대장균 세포. 여기서 세포의 10 μl는 신선한 LB의 25 ML에 이전에 성장하는 문화 플라스크에서 P20 micropipettor를 사용하여 무균 전송되었습니다. 플라스크는 세포가 (이 예를 들어, E. 대장균 세포가 떨고 플랫폼에서 37 ° C에서 하룻밤 incubated되었다) 복제 수 있도록 시간을 특정 금액에 대한 성장 챔버에서 incubated있다. 결과는 후속 실험에 사용할 수 흐린 세균성 세포 배양이다.

세균성 문화의 dilutions을 내릴 때 Serological pipettes도 원래의 테스트 튜브에 병에 제공된 미디어를 전송하는 데 사용될 수도 있고, 테스트 튜브 사이로서 이루어집니다. 무균 기술은 미디어 조작 이러한 유형의 전역에 유지되지 않는 경우 다음, 문화가 될 것이다는 오염, 신선한, 오염 문화가 대비해야 할 것이기 때문에 그 문화를 사용하는 후속 실험이 지연됩니다. 멸균 필드 절차 전반에 걸쳐 유지되지 않기 때문에 오류가 발생합니다. 예를 들어, 실험실 벤치 또는 화염 문화 병 또는 튜브의 가장자리를 소독하는 것을 잊지 수 있습니다. 당신은 피펫의 팁을 만지거나 대신 손에 들고 벤치에 병이나 시험관의 뚜껑을 설정할 수 있습니다. 적절한 절차는 최소한으로 미디어 및 문화의 오염을 유지하는 데 중요합니다. 그림 8A는 E의 순수한 대 오염된 문화의 예를 제공합니다 LB 5 ML을 포함 튜브 대장균. 왼쪽 패널은 순수한 E. 전형적인 균일한 미세 탁도를 표시하는 문화를 보여준다 대장균 배양. 대조적으로, 오른쪽 패널의 성장 특성이 박테리아 스트레인에 대한 예상들을 이탈하는 오염된 문화를 보여줍니다.

"테스트 튜브 사이에 미디어의 잘못된 권의 양도가 발생 serological pipettes을 조작하면> 기술 오류가 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 잘못 피펫에 볼륨을 읽을 수있다 (초승달 모양의 즉, 상단 대 아래) 또는 미디어를 퇴학 수 있습니다 완전히 전달되지 않는 것을 팁에 작은 비트를 떠날 수 있도록 설계되었다 TD 피펫.에서 포인트 투 포인트 전송 미디어, 당신은 잘못된 교정 부호를 사용하여 잘못된 볼륨을 하는걸 수도를 수행합니다. 그림 8B 보여줍니다 미디어의 올바른 대 잘못된 볼륨이있는 시험관의 예제. 왼쪽에 튜브가 5 ML serological 피펫으로 측정 LB 3.5 ML이 들어 있습니다. 학생은 LB가 수립되었다되는 미디어의 포인트 투 포인트 전송을 실시 5.0 ML 졸업 마크와 1.5 ML 마크에 적절. 오른쪽 튜브는 같은 크기의 피펫으로 측정 LB 2.5 ML 들어 있기 때문에 미디어의 포인트 투 포인트 전송을 행한 학생 전ncorrectly 5.0 ML 마크에서 2.5 ML 마크에 적절. 이러한 실수는 이후 dilutions가 잘못된 것으로 원인, 계획보다 높은 농도에있을 것입니다 세균성 문화가 높아집니다. 오류의 전파는 올바른 세포 농도와 반복해야하는 것이 실패한 실험이 발생할 수 있습니다.

액체를 전송 micropipettors를 사용하는 샘플 응용 프로그램은 그림 9에 표시됩니다. 이러한 pipettors는 PCR과 겔 전기 영동을 위해 샘플을 준비하거나 세균성 세포 또는 파지 입자의 작은 볼륨 (이하 1.0 ML)로 멸균 미디어 또는 버퍼를 inoculating 포함하여 분자 생물학과 미생물학의 실험은 다양한 사용됩니다. 제공된 예제에서, 학생은 1.8 ML의 microcentrifuge 튜브로 TE 버퍼의 12.5 μl를 양도 (패널의 왼쪽 튜브, 염료 맑은 microcentrifuge 튜브 내부의 액체의 시각화를 촉진하기 위해 버퍼에 추가되었음을 유의).이 절차는 올바른 볼륨 (패널 B)에 volumeter을 설정할 수 학생이이 경우 P20에서 올바른 micropipettor을 선택할 먼저하고 다음에 필요합니다. 끝 끝에 버퍼 샘플을 도달 micropipettor의 총신에서 퇴학 수있는 가능한 오염을 방지하기 위해 끝에 탈지면 플러그인을 포함하는 사용되었다. 천천히 때문에 액체가 pipettor이 총신에 끼얹으하지 않습니다 플런저를 깨는 팁을에 액체를 aspirating 때주의가 함락되는 경우주의가 필요하지 않습니다. 기술적인 오류는 잘못된 볼륨의 양도에 해당 결과가 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 작업에 대한 잘못된 micropipettor를 선택하거나 잘못된 볼륨에 올바른 micropipettor에 volumeter을 설정할 수 있습니다. 버퍼에 팁을 immersing하기 전에 플런저를 공개할 때 팁으로 얻을 수있는 버퍼의 초과를 일으키는, 첫 번째 정류장지나 플런저를 밀어 수도 있습니다. 양자 택일로, 당신은 버퍼에까지 충분히 팁을 담가하지 않을 수 있으므로 공기가 그려진대신 버퍼의 끝에. 당신은 제보에서 공개하기 원하는 볼륨 미만을 일으키는 microcentrifuge 튜브로 버퍼를 분배하면 두 번째 정류장에 플런저를 밀어 것을 잊지 수 있습니다. 패널의 오른쪽 튜브 그림 9의 왼쪽에 튜브에 상대적인 버퍼의 잘못된 볼륨을 포함하는 microcentrifuge 튜브를 보여줍니다. 대신 버퍼의 12.5 μl를 분배 때문에, 학생 125 μl를 적절. 버퍼의 상당히 큰 볼륨의 전달의 결과로, 숫자가 volumeter에 동일하게 설정되어 있지만,이 경우에는, 잘못된 micropipettor은 직장 (패널 B 학생이 P20의 P200를 대신 사용)에 선정되었습니다. 이 솔루션은 이러한 PCR과 같은 응용 프로그램에 대한 시약의 혼합물을 준비하는 데 사용되는 경우, 다음이 실수는 이후 동일한 튜브에 추가된 모든 시약의 최종 농도가 변경됩니다. 따라서, 그것은 분자 생물학 절차 등 때문에 실험이 성공적으로되지 않을 수도 있습니다PCR은 모든 구성 요소가 제대로 작동하는 반응에 대해 특정 농도에있을 필요가 있습니다.

항상 micropipettors이 (통 특히 내) 멸균 있습니다 유지를 위해 가능한 아니기 때문에, 주식 솔루션은 실험을 수행할 때 실패도 문제 해결 노력을 일으키는 오염 될 수 있습니다. 멸균 솔루션을 전송할 micropipettors를 사용하는 경우, 그것은 적극 재고 솔루션 aliquots가 (미디어, 버퍼, 물) serological pipettes과 무균 기술을 사용하여 제출하는 것이 좋습니다. 그것은 15 ML 50 ML 멸균 원뿔 튜브 주식 솔루션을 작동 유지 관리가 일반적입니다. 이들은 종종 micropipettor을 운영하면서 조작하기 쉽게 볼륨 전송 중에 오염된 경우 주식 솔루션의 신선한 나누어지는로 대체될 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 분젠 버너 불꽃 updraft 만든 무균 입력란입니다. 분멸균 솔루션과 문화의 오염을 imize, 모든 조작은 무균 필드 내에서 실시하는 것이 중요합니다. 유리 문화 튜브 및 flasks의 바퀴는 푸른 원추, 불꽃의 가장 뜨거운 부분의 끝을 통과해야합니다. 플라스틱 튜브와 팁은 골조 수 없습니다 - 이들은 사용하기 전에 다른 방법으로 미리 소독을해야한다.

그림 2
그림 2. Serological의 pipettes은 액체의 무균 전송을 위해 사용됩니다. () 오른쪽 25 ML의 도면, 10 ML, 5 ML pipettes 있습니다하려면 왼쪽에서 표시됩니다. (B) Serological pipettes은 플라스틱이나 유리있을 수 있습니다. 플라스틱 pipettes은 일회용입니다 (1 시간 사용)와 일반적으로 개별적으로 모든 내부 표면 살균 (왼쪽)되는 종이와 플라스틱 슬리브에 싸여있다. 유리 pipettes은 여러 번 그들이 사용하는 세척 및 소독을 사이에 제공됩니다 사용될 수 있으며, 이들은 일반적으로 금속 용기에 저장됩니다 (오른쪽쪽).

그림 3
. 그림 3 Serological pipettes 두 가지 유형이 있습니다 : TC ( "포함") 또는 TD ( "제공하는"). 표시된 것은 TD 5 ML의 피펫의 설명 레이블입니다.

그림 4
그림 4. 무균 기법. 마개가있는 병, 플라스크, 또는 튜브로부터 액체를 aspirating 때, 벤치에 뚜껑을 배치하지 마십시오. 대신, 같은 손으로 뚜껑을 보유 피펫 보조와 같은 그림과 같이 반대편 손으로 액체를 포함하는 선박을 처리하는 동안.

그림 5
serological 피펫으로 액체를 그릴 때 그림 5. 초승달 모양이 형성했다. 볼륨은 초승달 모양의 바닥이 일치 피펫에 졸업 점수에 해당합니다. 이 예제에서는 초승달 모양은 2.5 ML gradua으로 정렬 기 마크.

그림 6
그림 6. 단일 채널 micropipettor. ()을 표시 배럴 팁 홀더의 하단에 부착된 플라스틱 팁과 샘플 micropipettor입니다. 표시된 volumeter의 위치이며, volumeter 설정을 변경하기위한 엄지 휠, 배럴 팁 홀더, 팁 배출 버튼, 그리고 플런저를위한 푸시 버튼. (B) micropipettor에 플런저 시스템을 두 - 중지합니다.

그림 7
그림 7. 멸균 125 ML flasks로 미디어를 전송하는 serological pipettes를 사용하여. 오른쪽 플라스크는 중에 문화가있는 동안 왼쪽 플라스크는 전용 미디어 (LB)의 25 ML있다 37 세포 후 하룻밤 잠복기와 LB를 inoculating으로 인한 대장균 ° C. 오른쪽에있는 술병의 미디어가 세포 성장에 의한 흐린하는 방법 있습니다.

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그림 8. 멸균 테스트 튜브로 미디어를 전송하는 serological pipettes를 사용하여. () 왼쪽 튜브 순수한 E. 5 ML이 포함되어 있습니다 대장균 문화, 오른쪽 튜브 오염된 세균 세포 배양의 5 ML을 포함하면서. 두 문화 사이의 성장 특성의 차이를 확인합니다. 둘 다 흐린되지만, 오른쪽에 문화는 문화에게 E. 대해 기대와는 다른 색깔과 일관성을주는 곰팡이 또는 다른 대기 중의 미생물에 오염되었습니다 대장균 세포. 오른쪽 튜브에만 2.5 ML의 LB를 포함하는 동안 (B) 왼쪽 문화 튜브는 3.5 ML의 LB가 포함되어 있습니다. 이러한 볼륨 차이가 튜브에 대한 미디어의 포인트 투 포인트 전송을 수행하는 동안 만든 실수에서 발생했습니다.

그림 9
그림 9. Using의 micropipettors는 멸균 microcentrifuge 튜브로 버퍼를 전송합니다. 오른쪽 튜브 125 μl를 포함하는 동안 () 왼쪽 microcentrifuge 튜브는 TE 버퍼의 단지 12.5 μl가 포함되어 있습니다. 염료가 맑은 microcentrifuge 튜브 내부의 액체의 시각화를 촉진하기 위해 버퍼에 추가되었습니다 있습니다. 오른쪽 volumeter은 P200 micropipettor에서있는 동안 (B) 왼쪽 volumeter는 P20의 micropipettor에서입니다. 일반적인 실수는 잘못 micropipettor을 선택합니다. 번호는 P20와 P200 volumeter, 잘못된 볼륨의 양도에 잘못된 micropipettor 결과의 선택에 동일하게 설정하고 있지만.

그림 10
그림 10. 솔루션과 문화의 오염을 방지하기 위해 사용 층류 후드. 표시된 것은 BSL-2는 생물과 작업에 대한 승인 biosafety 캐비닛입니다.

Discussion

무균 기술은 실험실에서 원치 않는 미생물에 의해 오염되는 것을 멸균 솔루션과 문화를 막을 일상적인 절차의 집합을 말합니다. 이러한 기술은 성장 세포를 필요로 실험을위한 필수적입니다. 완전 멸균은 작업 설정이 달성될 수는 없지만, 같은 실험실 표면을 소독 분젠 버너를 사용하여 멸균 필드를 만들고, 공기에 uncapped 문화와 미디어의 노출을 제한, 그러한 병, 튜브 및 유리 pipettes과 같은 물질을 살균 등의 절차, 및 비 멸균 표면 살균 계기의 접촉을 피하는 것이 실험에서 솔루션과 문화를 오염 가능성을 줄여줍니다. 목표는 제 2의 천성이 될하려면 다음 예방 절차를 위해이다; 연구실에 근무하는 동안 이것은 훈련과 연습이 제공됩니다.

이러한 serological pipettes와 마이크 등의 악기를 사용하여 멸균 솔루션과 문화가있는 볼륨 전송ropipettors는 실험실에서 수행 루틴 기법의 여러 유형 중 하나입니다. 다른 실험적인 응용 프로그램은 별개의, 아직 정밀하고 정확한 볼륨을 전송할 수있는기구 부릅니다. micropipettors 솔루션만을 microliter 양의 필요한 분자 생물학 실험에 필수적인 반면 Serological pipettes은 밀리리터 볼륨을 포함한 미디어의 준비를 필요로하는 세포 문화를 준비하는 미생물학 실험실에 사용됩니다. 무균 기술은 이러한 악기와 함께 연습을하면 오염은 액체 또는 실험 형태의 금액에 관계없이 볼륨 전송하는 동안 최소화된다.

이 프로토콜에서 설명하지 않지만, 일반적으로 오염을 방지하기 위해 사용하는 다른 한 방법은 층류 후드 (그림 10) 내에서 작동하는 것입니다. 이 장비는 조직 문화와 BLS-2 이상으로 분류된 미생물과 함께 수행한 실험에 중요합니다. 층류 후드는 HEPA (고효율이 포함되어 있습니다작업 영역을 permeating에서 회의실에서 필터없는 공기를 방지하면서 후드에 흐르는 공기에서 공기로 운반되는 오염 물질을 제거 미립자 공기) 필터. 화염의 열기가 후드의 기능에 필수적인 공기 흐름을 방해하기 때문에 참고, 분젠 버너는 층류 후드 안에서 사용할 수 없습니다.

그것은 실험을 수행할 때 무균 기법의 품질을 확인하는 것이 도움이 될 것입니다. 솔루션을 확인하려면 문화 미디어 실험 조작 중에 오염된받을 수 없어 항상 부정적인 컨트롤을 준비합니다. 예를 들어, 세균성 문화의 성장 국물의 튜브를 준비한다면, 한 튜브만을 무균 미디어를두고 접종하지 않습니다. 같은 실수 튜브에 소개 원치 않는 세포의 성장에서 탁도 등 오염의 징후에 대해 다음 검사 uninoculated 제어 튜브 주사 튜브와 함께 매체를 품어. 제어 튜브가 오염되면 실험 튜브들 가능성뿐만 아니라 오염되며, 실험을 반복해야한다. 이러한 예방책은 모든 실험을 다해야합니다.

Disclosures

나는 공개 할게 없다.

Acknowledgments

인물에 대한 샘플 문화를 설정하는 그림을 준비하고 UCLA의 크리스 Reddi에 대한 Iroc 설계에서 Cori 샌더스에 대한 특별 감사합니다. 이 프로젝트에 대한 자금 지원은 HHMI (HHMI 그랜트 번호 52006944)에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Difco Laboratories 244620 Recipe also available in reference 6
TE Buffer:
EDTA disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Trizma-HCl Sigma-Aldrich T-3253
CiDecon Decon Laboratories 8504 Disinfectant
Ethanol Fisher Scientific A406 For use as disinfectant, prepare 70%(v/v) with distilled water

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References

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