Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Serolojik Pipetler ve Micropipettors ile Cilt Transferler

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

Bir laboratuarda çalışırken, bulaşma kaynakları en aza indirmek için şarttır. Aseptik teknik Steril olmayan yüzeyler ile temas kaçınarak kültürler ve reaktifler transferi izin prosedürleri ifade eder. Serolojik pipet ile micropipettors Deneylerde kullanılan çözeltilerin sterilite bozmadan hassas cilt ölçmek için kullanılır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), e2754, doi:10.3791/2754 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikroorganizmalar her yerde vardır - hava, toprak ve insan vücudunda yanı sıra laboratuar tezgahları ve bilgisayar klavyeleri gibi cansız yüzeyler üzerinde. Mikrop ubiquity bir laboratuvar potansiyel kirletici maddelerin bir bol kaynağı oluşturur. Deneysel başarı sağlamak için, ekipman ve iş yüzeyler bulaşanların sayısı en aza indirilmelidir. Mikrobiyoloji birçok deneyler arasında yaygın bakteri hücreleri veya viral partikülleri içeren kültürlerin ölçüm ve transferi ile ilgili teknikleri vardır. Steril bir çalışma alanı hazırlarken steril ortam gerektirir (1), (2) hassas ayar ve doğru sıvıların aseptik transferi için araçlar okuma, ve (3) düzgün, kültür şişeleri, şişe aletleri manipüle steril olmayan yüzeylere temas veya kontamine olmadan bunu yapmak ve steril bir alan içinde tüpler. Bu işlemler Öğrenme eğitim ve uygulama gerektirir. İlk başta, eylemler, yavaş, bilinçli ve aseptik t olma hedefi ile kontrol edilmelidirtezgah üzerinde çalışırken ikinci doğa haline Tekniğine Dayalı Görüşme. Burada bir Bunsen beki tarafından oluşturulan steril bir alan içinde serolojik pipet ve micropipettors kullanarak hacimleri ölçmek için adımları sunuyoruz. Hacimler mikrolitre (ul) ile kullanılan alet bağlı mililitre (ml) arasında değişir. Sık transfer Sıvılar steril suyu veya kimyasal çözümler yanı sıra bakteri kültürleri ve faj stokları bulunmaktadır. Bu işlemleri takiben, öğrenciler gerekir:

  • Bunsen beki alevi tarafından oluşturulan steril alan içinde çalışır.
  • Enstrüman sterilite ödün vermeden serolojik pipet kullanın.
  • Serolojik pipet ile sıvı aspire, tam pipet üzerinde mezuniyet işaretleri sıvı oluşan menisküs hizalayarak kalibre hacimleri okuma.
  • Kültür şişeler, mataralar, tüpler ve sıvı aktarımı sırasında steril kendi kapakları tutun.
  • Plastik karşı cam serolojik pip için farklı uygulamalar tespitmak.
  • Micropipettors Devlet doğruluğu sınırlamalar.
  • Hassas ve doğru micropipettors birimler ayarlayın.
  • Doğru düzgün hacimleri aspire ve aktarmak için bir micropipettor üzerindeki birinci ve ikinci durağı nasıl kullanacağımı biliyorum.

Protocol

1. Bir Steril Çalışma Alanı hazırlayın

  1. Çalışma alanınızı herhangi bir sterilizasyon işlemleri başlamadan önce, antiseptik sabunla ve ılık suyla ellerinizi yıkayın.
    • Ellerinizi size deneysel manipülasyonlar kirlenme olduğundan şüpheleniyorsanız istediğiniz zaman yeniden yıkamak için emin olun.
  2. Laboratuvar tezgah üzerinde çalışma alanı doldurmasını tüm malzemeleri uzak temizleyin. Kaldır önceden nemlendirilmiş dezenfektan kavanozdan silin ve tüm alanı silin. Dezenfektan buharlaşmaya bırakın - kuru silmeyin!
    • Bu tür alkol (izopropanol veya% 70 etanol) veya fenolik bileşikler, (o-phenylphenol) gibi dezenfektanlar kullanılır.
    • Aerosolizasyon veya bakteri hücrelerinin ve mikrobik kirleticiler yayılmasını içeren ince bir sis üretimini önlemek için, bir sıkmak şişeden dezenfektan dozajlama kaçının.
    • Mikroorganizmaların kuruma yüzeyleri temizlemek için en etkili yollardan biridir.
    • Birisi geçenlerde laboratuvarlarda kullanılan ve tezgah üstü dezenfektan ile aşağı sildi bile, DAİMA tezgah aşağı silerek sizin laboratuar zaman başlayacak.
  3. Dezenfektan tamamen kuruduktan sonra, Bunsen beki yakmak için bir çakmak kullanın. Mavi bir koni alev ortasında görülebilir ki alev ayarlayın. Alev artık bir havanın yükselmesi, üretilmesi veya sıcak hava alevi (Şekil 1) yükselir ve uzak olduğu hava konveksiyon akımları edilir. Isı yükselir olarak, mikroorganizmalar ve toz parçacıkları hemen çalışma alanından yukarı ve uzağa zorlanmaktadır. Yavaş çalışın, dikkatli ve bilinçli Bunsen beki tarafından oluşturulan bu alan içinde her zaman, steril bir alan olarak anılacaktır. Tüm prosedürü sırasında Bunsen beki tutun.
    • Mavi koni ucu alev sıcak parçasıdır.
    • Dramatik ai değiştirmek hızlı hareketlerle yukarı yönlü rahatsız dikkat edinlaboratuvar tezgah etrafında r akımlar. Bunsen beki ile bir havanın yükselmesi oluşturma tezgah üzerine veya açık şişeleri, tüpler veya çalışma alanında şişeler içine düşen mikroorganizmalar ve toz olasılığını en aza indirir.
  4. Steril alan yakın laboratuar bankta prosedürü için gerekli tüm malzemeleri yerleştirin. Bütün malzemeleri bir şekilde etiketlenmiş olduğundan emin olun.
    • Malzemeleri serolojik pipetler ve micropipettors, steril kültür tüpleri, steril şişeler, et suyu içeren medya şişeleri, steril mikrosantrifüj tüpleri, micropipettor ipuçları, tüpler için rafları, bakteri hücre kültürleri ve faj stokları içerebilir.
    • Sıvı ortam sıvı ayar en azından 15 dakika süreyle 121 ° C'de otoklavda sterilize edilmelidir. Medyanın geniş hacimli (> 1L) uzun otoklav kez gerektirir. Laboratuvar ağırlık (kuru) ayarına en azından 30 dakika süreyle 121 ° C'de otoklavda sterilize edilmelidir.
    • Genel olarak, steril çözeltiler 4 saklanabilir° C 5 ay için. Depolama süresi önemli ölçüde antibiyotikler gibi kararsız bileşenler içeren çözümler için azalır unutmayın - her zaman üreticinin tavsiyelerini kontrol edin.

2. Serolojik Pipetler kullanma Sıvılar Aktarma

  1. Serolojik pipet birçok boyutları ve seçenekleri gelir: plastik veya cam, tek kullanımlık veya tekrar kullanılabilen, takılı veya takılı. Bunlar 0.1 ml ile 25 ml arasında değişen hacimleri sunmak için kalibre edilir.
    • Serolojik pipet için yaygın boyutları 5 ml, 10 ml ve 25 ml ve 0.1 ml ya da daha fazla (paneli, Şekil 2'nin A) aseptik sıvı aktarımı için kullanılmalıdır. Ayrıca 100 ml hacimli teslim edebiliriz büyük serolojik pipet vardır, ancak bu protokolün odak daha yaygın, küçük ölçekli pipet üzerinde.
    • Bir pamuk fişi ile önceden sterilize pipetler mikrobiyoloji ve doku kültürü deneyleri için gereklidir. Fişe kaldırılır edilmemelidirpipetin p; bu pipet taşmayı bir engel olarak işlev için tasarlanmıştır.
    • Farklı uygulamalar plastik karşı serolojik cam pipetler için arayın. Cam organik çözücüler için gereklidir. Laboratuvar tezgah üstüne BSL-1 deneyler yaparken Ya kullanılabilir. Bir Bunsen beki kullanılamaz BSL-2 organizmalar ile Biyogüvenlik kabini çalışırken sadece plastik kullanılabilir. Ayrıca plastik erimiş agar transferi içeren uygulamalar için kullanılması tavsiye edilir.
    • Serolojik pipet iki türlüdür: TC ("saklama") ya da TD ("aktarma"). TC pipet ucu dahil tüm hacmi verecek ve "dışarı üflenir" veya belirtilen ses almak için durulanması gerekir. TD pipetler verilmemesi gerektiği uç bir nebze bırakmak kalibre edilir. Bu hangi tür anlamak için üst (Şekil 3) yakın pipet gövdesi üzerinde etiketi kontrol ettiğinizden emin olun. En yaygın olarak dec TD pipet vardır kullanılanüst çift halkalı Düşey Nokta Kuyu.
  2. Steril plastik serolojik pipet (aynı zamanda bir hacimsel transferi pipet denir) alın ve dikkatli bir muz deri gibi uzak soyulma pamuk fişi ile sonunda kağıt Kovanı çıkarmak - tüm Kovanı çıkarmak değil, ucu koruma aktarılacak sıvı ile temas edecek pipet. Ellerinizle pipet sadece üst (mezuniyet işaretleri yukarıda) dokunun.
    • Büyük bir özenle steril tutmak için alınmış olsa bile, kullanılan pipetle steril bir çözelti içine asla.
    • Cam serolojik pipet tipik olarak metal kutu (Şekil 2 panel B) saklanır. Kutunun üst gevşetin sonra dikkatli bir kap ve kutunun açık uçlar kap ve alev çıkarın. Dezenfekte bankta, yan, kap aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Yatay olarak tutarak kavanozdan bir pipet çıkarın ve hafifçe sallayarak yüzden bir veya iki pipet üstlerites bir inç hakkında sopa ve kolayca kavranabilir. Yan kanister uzandı ve bir pipet kaldırmak, ancak konteyner diğer pipetler dokunmamaya dikkatli olun. Ellerinizle pipetin alt ucu dokunma ve diğer steril olmayan yüzeyleri ile ucunun temas kaçının.
  3. Tutturmak gibi serolojik pipetle üst ucuna bir termometre, pompa, ya tabancası gibi bir pipet yardımı. Plastik pipet kağıt kol çıkarın. Sağ elindekini pipet yardımı tutun.
    • Cam bir pipet kullanıyorsanız, 1-3 saniye Bunsen beki alev mavi koni aracılığıyla pipet alttaki üçte geçmektedir. O alev geçerken pipetle 180 ° döndürün. Plastik pipetler ve tüpler Alevli edilemez.
    • Solak ise sol elinizde pipet yardımı tutun ve sağ elinizle kültürü şişeleri ve tüpler sonraki manipülasyonlar yapmak.
    • Son inc çekilirken Kirlilik plastik pipetler meydana gelme eğilimikovanından pipet hes steril ucu sizin ellerinizle dokundu kol kısmı ile temas çünkü.
  4. Steril ortam içeren şişenin kapağını çıkarın. Laboratuvar tezgah üzerine kap yerleştirin ama başparmak ile pipet yardımı işlenirken sizin yüzük parmağı ve sağ elin avuç arasında tutmayın, dizin ve aynı el (Şekil 4) orta parmaklar. 45 ° açıyla şişe Holding, açık şişe etrafında steril bir alan oluşturarak, Bunsen beki alevinden aracılığıyla şişenin ağız geçmek.
    • Iyi kaçınılması rağmen, eğer kap indirdi gerekiyorsa, bir dezenfekte yüzeyi aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Yukarıya dönük bir kap ile, mikroorganizmalar ve toz parçacıkları kapağı iç yüzeyine inmeye neden hava akımları oluşturarak nesneleri veya ellerin hareketleri kirlenme büyük bir şansı var.
    • Alevli bir amacı, sterilize ancak o açıklığı ısıtmak için değilaçılış (yani, yukarı yönlü) dan f şişe ve hava konveksiyon akımları oluşturur ve uzak. Sıcak, yükselen hava şişe girmesini toz parçacıkları ve diğer kirleticilerin önlenmesine yardımcı olur.
    • Mümkün olduğunca az süreler için steril kap açık tutun. Bu işlem boyunca en az havadaki mikroorganizma giriş noktalarını tutmak için önemlidir.
    • Steril kaplarda açık iken, hapşırma konuşurken ve diğer istenmeyen hareket, öksürme kaçının.
    • Onlar Bunsen beki alevi geçti sunulduktan sonra steril bir alan (yani, açık şişe veya cam şişeler, tüpler ve şişe kapakları iç) üstünden elleri ve parmakları geçmek asla.
    • Steril tüpler veya şişeler açarken her zaman açık bir alev ile çalışmak. Asla birden fazla tüp, şişe, ya da bir anda balon bankta açık var. Flaming açılması üzerine ve sadece kapanış tüpler, şişeler ve mataralar hemen önce yapılmalıdır.
  5. Serol ucu yerleştirinsteril ortamı içeren şişeye ogical pipet sonra aspire veya şişeden, aseptik örnek çizin. Pipet içine numune akışını kontrol etmek için pipet yardımı kullanın. Kesinlikle kalibre pipet (Şekil 5) mezuniyet işaretleri sıvı sütunun üstünde oluşan menisküs hizalayarak pipetin içine çizilmiş hacmi okuyun.
    • AĞIZ pipet! Daima (pompa, ampul veya silah) bir pipet yardımı KULLANMAYIN.
    • Aspire hacmi belirlerken sayıların dizisine dikkat edin. Sayıları her iki yönde de en üst ya da tam tersi, ya da sık sık defa bahşiş basılmış olabilir.
    • Hacmi okurken, her zaman yere dik, pipet dikey tutun ve ölü-on göz seviyesinde sıvı menisküs görüntülemek.
    • Serolojik pipet tipik olarak 5 ml ve 10 ml pipetler ve 25 ml pipetler için 0.2 ml 0.1 ml olan en küçük belirgin artış, kadarıyla doğrudur. Benf büyük hassasiyet tabi, bir serolojik bir pipetle micropipettor ile kombinasyon halinde kullanılabilir.
  6. Bir kez daha Bunsen beki alevi ile şişenin ağız geçmek, sonra şişenin kapağını geri yerleştirin. Kenara medya şişe ayarlayın.
    • Şişe kapatmak için acele Bunsen beki kendinizi yakmayın.
  7. Sol elinizde bir test tüp veya şişe tutun. Yukarıdaki adımı # 4'te açıklandığı gibi kapağını kaldırın ve tutun. Bunsen beki olarak tüp veya şişenin ağız alevli tarafından steril bir alan oluşturun.
  8. Tüp veya balona pipetle ortam dağıtın. Bu tüp veya şişenin sıçrayacaktır değildir böylece numunenin akış kontrol eder.
    • Hacimler bütün hacim teslim ve pipetle tamamen kurursa, ya da belirli bir ses, bir noktadan-noktaya teslim (bir ses başka bir işaretleme) yaparak elde edilir olduğu gibi ölçülebilir.
  9. Bunsen yakmak yoluyla tüp veya şişenin ağız iletiner alev kez daha, sonra kapağı değiştirin. Kenara tüp veya şişesi ayarlayın. Pipet yardımıyla çıkarın ve uygun atık yuvasına pipet atın.
    • Cam serolojik pipet tekrar sterilize edilebilir ve kullanılabilir iken Plastik serolojik pipetler, atılabilir. Uygun bertaraf cam pipetler başlangıçta iç ve dış yüzeylerin dezenfekte edilmesi için% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile bir kaba daldırılmış gerekirken plastik pipetler atanmış bir tasfiye edin (plastik atık torbası ile kaplı sert kutu) yerleştirilir gerektirir. Daha sonra cam pipet iyice, laboratuar deterjan ile yıkanmış damıtılmış su ile yıkanır ve bir otoklav içinde sterilize edilmesi gerekir.
  10. Seri dilüsyonlar yaparken bir bakteriyel kültür veya faj stoku ile medya aşılamak veya aynı adımları takip edilmelidir.

3. Micropipettors kullanarak aktarma Sıvılar

  1. Hassas ölçüm ve dakika volümü dağıtım accompli olabilir(; Panel Şekil 6 arasında bir zamanda Pipetman olarak anılacaktır) micropipettors kullanılarak döküldü. 0,2-2 ul için P2, 1-10 ul için P10, 2-20 ul için P20, P200 200-1000 ul için 20-200 ul ve P1000 için: Bu araçların her biri belli bir hacim aralığı ile farklı boyutlarda olabilir.
    • Bunlar hassas aletler gibi, özenle micropipettors davranın. Onlar kapalı çaldı ve zarar görebilir onları nerede katılımsız laboratuar bankta yatan bırakmayın. Pipetler korozif kimyasallar ile temas etmesine izin vermeyin.
    • 1000 ul daha büyük birimler için bir serolojik pipet kullanın.
    • Rağmen alev micropipettors, tüpler ve plastik ipuçları, Bunsen beki tarafından oluşturulan steril alan içinde değil çalışıyor. Tüpler ve uçları ön-sterilize edilmelidir. Micropipettors kullanmadan önce silin önceden nemlendirilmiş dezenfektan ile aşağı silinebilir.
  2. Dağıtılan miktarını gösteren sayısal volumetre ayar düğmesini çevirerek ayarlanabilir. Ayarları yapma# 3. adıma geçmeden önce t hacmi.
    • AMACI RANGE YUKARIDA AYAR DÜĞMESİ TURN ASLA!
    • Micropipettor üzerinde ses ayarı azalan ederken maksimum doğruluk elde etmek için, yavaş yavaş değil aşmayı mezuniyet işaretine dikkat ederek, başparmak tekerleği aşağı çevirin.
    • Micropipettor üzerinde ses ayarını artırarak ederken maksimum doğruluk elde etmek için, sırayla 1/3 oranında istenilen mezuniyet işareti geçerek, yukarı başparmak tekerleği çevirin. Sonra yavaş yavaş değil aşmayı mezuniyet işaretine dikkat ederek, hedeflenen hacme ulaşmak için başparmak tekerleği aşağı çevirin.

    Volumetre üç numaralarını gösterir. Micropipettor bağlı olarak, numaraları farklı yorumlanmaktadır. Her micropipettor küçük mezuniyet işareti olarak sadece doğru olduğunu unutmayın.

    P2: 0.2-2.0 mikrolitre arasındaki birimler için. Üst sayısı mikrolitre hacmi gösterir. İkinci sayı belirtir vees bir mikrolitre onda (0.1 ul) ve üçüncü bir dizi mikrolitre (0.01 ul) hundredths temsil eder. Her mezuniyet işareti mikrolitre iki tek binde (0.002 ul) bir artış eşittir.

    P10: 1.0-10.0 ul arasındaki birimler için. Üst sayısı mikrolitre onlarca içindir; bu genellikle "0" olarak belirlenmiştir ve sadece 10,0 ul dağıtım zaman "0" olarak belirtilen diğer iki sayı ile "1" olarak ayarlanması gerekir. Numarası orta mikrolitre hacmi gösterir. Üçüncü sayı bir mikrolitre onda (0.1 ul) gösterir. Her mezuniyet işareti mikrolitre iki tek hundredths (0.02 ul) bir artış eşittir.

    P20: 2,0-20,0 ul arasındaki birimler için. Siyah top sayısı mikrolitre onlarca içindir; bu sadece 20.0 ul dağıtım zaman "0" olarak ayarlayın, diğer iki sayı ile "2" olarak ayarlanması gerekir. Siyah ikinci sayı mikrolitre yılında hacmi gösterir. Kırmızı üçüncü sayısı on gösterirBir mikrolitre (0.1 ul) ile ths. Her mezuniyet işareti mikrolitre iki tek hundredths (0.02 ul) bir artış eşittir.

    P200: 20,0-200 ul arasındaki birimler için. Üst sayısı mikrolitre yüzlerce içindir; bu sadece 200 ul dağıtım zaman "0" olarak belirtilen diğer iki sayı ile "2" olarak ayarlanması gerekir. Numarası orta mikrolitre onlarca dağıtılan hacmi gösterir ve üçüncü sayı mikrolitre hacmi gösterir. Her mezuniyet işareti mikrolitre iki tek onda (0.2 ul) bir artış eşittir.

    P1000: 200-1000 ul arasındaki birimler için. Üst sayısı mikrolitre binlerce içindir; bu genellikle "0" olarak belirlenmiştir ve sadece 1000 ul dağıtım zaman "0" olarak belirtilen diğer iki sayı ile "1" olarak ayarlanması gerekir. Numarası orta mikrolitre yüzlerce içindir. Alt numarası mikrolitre on içindir. Her mezuniyet işareti iki (2 ul) mikrolitre bir artış eşittir.

    • Performans kontrol edin: Bu cihazlar kalibre edilmelidir, doğruluk ve hassasiyet sağlayan özellikleri ±% 5 içinde kalmak korunur. Minimum ve maksimum ayarlar istenilen hacme karşılık emin, su ölçmek için analitik bir ölçek kullanın. Örneğin, suyun 200 ul ölçekte bir tartmak çanak transferler için bir P1000 kullanın. Su 1 bir yoğunlukta sahip olduğu için, daha sonra su ve 1 ml 1 gram (g) eşittir. Böylece, 200 ul su (0.2 mi) 0.2 g eşit olmalıdır. Ayrıca, piston sistemi ile dağıtılan kadar ucu istenen hacmi akmaması ve bakımını emin olun.
  3. Micropipettors her zaman için plastik tek uçları ile kullanıldığında yapılmalıdır. Micropipettor namlusunun ucuna sıkı bir ucu takın. Aşağı bastırın ve hava geçirmez bir mühür sağlamak için hafifçe bükün.
    • İpuçları genellikle otoklav ile sterilize edilebilir plastik kutular içine paketlenir. Bir ucu almak için ucu kutusunu aç, Daha sonra havadaki kirletici ile temas en aza indirmek için ipucu kutusunu kapatın.
    • Bazı ipuçları serolojik pipet üzerinde pamuk fişler benzer filtreleri var. Bu ipuçları genellikle düzenli ipuçları daha pahalıdır ve bu nedenle özel uygulamalar için kullanılır. Örneğin, filtre ipuçlarını kullanarak örneğin kloroform ya da 32 P-işaretli DNA gibi radyoaktif sıvılar gibi uçucu kimyasallar ölçerken kontamine getting micropipettor varil önlemeye yardımcı olur.
  4. Dikey konumda micropipettor tutun.
    • Micropipettor tutulması dik içinde çalışan ve micropipettor varil karışmasını sıvı önleyecektir.
  5. (1) bir dinlenme konumu, (2) ilk durdur, ve (3) ikinci durdurma (Şekil 6, panel B): micropipettor üç konuma sahiptir. Cihaz iki durak piston sistemi vardır. İlk durak iki işlevi vardır. Birinci ucu whe içine sıvı istenen hacimde çizmek içinn dinlenme konumuna ilk durağından pistonu serbest. Ikinci bir işlevi bir dinlenme konumu ile birinci durdurma için Medyumu olduğunda ucundan sıvı dağıtım çoğunluğu etmektir. Ayrıca ne olursa olsun sıvı ucu kalır ikinci durağı Eczanesi için Medyumu.
    Dinlenme konumu ile birinci durdurma için pistonu basma sıkıp. Ayarı hacmine eşit Hava yerinden edilecektir.
  6. Ilk durağı için düğmeye basılı tutarken sıvı içine ucu daldırın.
    • Şişeleri, borular, ve tüpler kenarlarına micropipettor kendisini dokunmayın, aksi takdirde bu gemilerin iç yüzeyleri kontamine olacak. Sadece ipuçları sterildir.
  7. Ucu içine sıvı aspire yavaş yavaş basma bırakın. Düğmeye geri kalanı konumuna bir kez durdurun. Sıvı ucuna çekilir böylece bir an bekleyin.
    • Ucu sıvı hacmi birime o eşit olacaktırmicropipettor f ayarı.
    • Böyle içerenler gliserol gibi viskoz sıvılar ucu girmek için daha fazla zaman gerektirecektir.
  8. Sıvıdan ucu çıkarın ve görsel olarak hazırlanan sıvı ucu beklenen düzeye ulaşmıştır ve ucu hiç hava kabarcığı olduğunu onaylamak için ucu kontrol edin.
    • Gerekirse, sıvı dışarı atılması ve elle micropipettor üzerine uçları sıkmak. Sıvı hazırlayın ve tekrar kontrol edin.
  9. Sıvı alan tüp duvarına karşı bir açı (10 ° ila 45 °) ucu yerleştirin. Sıvı çıkarmak için, yavaş yavaş ilk durağı için pistonu üzerindeki buton bastırın. Sonra ucu herhangi bir kalıntı sıvı çıkarmak için ikinci durağı basıyorsunuz bir an bekleyin.
    • Çok hızlı Medyumu sıvı tüp içinde arzu edilmeyen kabarcıkları püskürteceğim veya üretecek atılmaktan neden olabilir.
  10. Dinlenme konumuna piston yayınlamadan önce, tekrarSıvı gelen ucu hareket eder.
  11. Micropipettor üzerindeki fırlatma düğmesine basarak belirlenen kavuz çöp konteyneri içine ipuçları atın.

4. Work Space Up Temizleme

  1. Aseptik teknik kullanımını gerektiren bir deney tamamladığınızda, Bunsen beki kapatın, sonra tüm malzemeleri ve reaktifler bıraktım. Kirletici depolama yeri transfer emin olmak için silin önceden nemlendirilmiş dezenfektan ile laboratuar malzemeleri (şişe, micropipettors, pipet kutuları) dış yüzeyleri silin.
  2. Yeri uygun şekilde bertaraf yuvasına cam ve tehlikeli atık maddelerin kirlenmiş. Laboratuvar atık eldiven, pipetler, ipuçları ve tüpler gibi laboratuar malzemeleri gibi içerir. Patojen olmayan organizmalar (BSL-1) ile deneyler yaparken patojen organizmalar (BSL-2 veya üzeri) kullanırken bulaşıcı tehlikeli atık üretilen ederken Sigara bulaşıcı tehlikeli atık üretilmektedir. Bulaşıcı atıkların otoklavlanmış veya dezenfekte befor olmalıdıre atılır. OSHA ve kurumsal Çevre Sağlığı ve Güvenliği departmanları tarafından sağlanan yanı sıra BMBL (5. Ed.) Açıklanan laboratuar güvenlik kurallarına uyun.
  3. Ile laboratuvar tezgahı üzerindeki tüm çalışma alanı silin önceden nemlendirilmiş dezenfektan bir kez daha dezenfektan buharlaşmasına izin, teneke kutu silin.
  4. Laboratuar ayrılmadan önce antiseptik sabunla ve ılık suyla ellerinizi iyice yıkayın.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Sıvıların aktarmak için serolojik pipet kullanılarak için örnek bir uygulama Şekil 7 'de gösterilmiştir. Bu pipetler genellikle bakteri kültürleri ile aşılama için ortam hazırlamak için mikrobiyoloji laboratuvarı olarak kullanılmaktadır. Örneğin, steril şişeler, bu durumda ilk Luria Broth (LB), daha sonra hücreler küçük sayıda (örneğin, E. coli gibi) bir ortama ilave edilir, kültür bulyonu belirli bir hacim ile doldurulur. Bir serolojik p kullanılmasıipette, birinci broth aseptik olarak bir şişeye ortam şişeye aktarılmış olması gerekir. Bu durumda, 25 ml LB bir 25 ml serolojik pipet kullanılarak, bir 125 ml steril şişesine ilave edildi. Sonra, broth E. ile inoküle edilmelidir coli hücreleri. Burada, hücreler 10 ul taze LB 25 ml kadar önceden büyüyen kültürü şişeye bir P20 micropipettor kullanılarak aseptik olarak transfer edilmiştir. Şişeye hücreleri (bu örneğin, E. coli hücreleri, bir sallama platforma 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edildi) çoğaltmak için izin veren, belirli bir zaman miktarı için bir büyüme odacık içinde inkübe edilir. Sonuçta daha sonraki deneylerde kullanılan bir bulanık bir bakteriyel hücre kültürü.

Bir bakteri kültürü olan çözülmelere yaparken Serolojik pipet de ilk test tüpleri için bir şişe içinde verilen medya aktarmak için kullanılabilir, ya da test tüpleri arasında, gibi yapılır. Aseptik teknik medya manipülasyonları bu tür boyunca muhafaza değilse Sonra kültürleri olacak kontamine ve taze, kirlenmemiş kültürleri hazır olmak gerekir, çünkü bu kültür kullanılarak sonraki deneylerde gecikecektir. Steril bir alan prosedür boyunca tutulmaz, çünkü hatalar oluşur. Örneğin, laboratuar tezgah alev veya bir kültür şişe veya tüpün kenarına dezenfekte unutabilir. Sen pipet ucu dokunmayın veya yerine elinizde tutarak heyetinde bir şişe veya test tüpünün kapağını ayarlayabilirsiniz. Uygun prosedür minimum medya ve kültür kontaminasyon tutmak için önemlidir. Şekil 8A E. saf bir karşı kirli kültürü bir örnek teşkil LB 5 ml ihtiva eden bir tüp içinde coli. Sol panelde saf E. tipik düzgün ince bulanıklık gösteren bir kültür gösterir coli kültürü. Bunun aksine, sağ panel büyüme karakteristiklerine Bu bakteri suşunun için beklenen bu sapma olduğu bir kirlenmiş kültürü gösterir.

"Test tüpleri arasında medya yanlış hacim transferi ile sonuçlanan serolojik pipet işlenirken> Teknik hatalar oluşabilir. Örneğin, yanlış pipet sesini okuyabilirsiniz (menisküs, yani üst karşılık alt) veya medya sınırdışı edebilir tamamen teslim olmamak ucu bir nebze bırakmak için tasarlanmış bir TD pipet,. bir noktadan-noktaya teslimat medya, yanlış kalibrasyon işaretleri kullanmak ve yanlış hacmi etmeyebilir yaparken. Şekil 8B gösterir Medyanın doğru karşı yanlış hacimli test tüplerinde bir örnek. sol tüp 5 ml serolojik pipet yardımıyla ölçülen LB 3.5 ml içerir. Öğrenci LB hazırlanmıştır hangi medya bir noktadan-noktaya teslimat yapılan 5.0 ml mezuniyet işareti ve 1.5 ml işaretine dağıtılmıştır. sağ tüpü aynı büyüklükte bir pipet yardımıyla ölçülen LB 2.5 ml içerdiğinden medya noktadan-noktaya teslimat yapılan öğrenci incorrectly 5.0 ml işareti gelen 2.5 ml işaretine dağılacağı. Bu, daha sonraki bir hata dilüsyonları yanlış bir hale gelmesine neden, planlanan göre daha yüksek bir konsantrasyonda olacak bir bakteri kültürü ile sonuçlanacaktır. Hataları bu yayılımı doğru hücre konsantrasyonları ile tekrar edilmesi gereken bir başarısız denemenin neden olabilir.

Sıvıların aktarmak için micropipettors kullanılarak için örnek bir uygulama Şekil 9 içerisinde gösterilmiştir. Bu Pipet PCR ve jel elektroforez için numuneler hazırlanması ya da bakteriyel hücre veya faj parçacıkların küçük hacimli (az 1.0 ml) içeren steril ortam veya tampon inokulasyonu da dahil olmak üzere moleküler biyoloji ve mikrobiyoloji deneyler çeşitli için kullanılır. Verilen örnekte, öğrenci 1.8 ml mikrosantrifüj tüpe TE tamponu 12.5 ul transfer (panelinde sol tüp A; boya açık mikrosantrifüj tüpleri içinde sıvı meyi kolaylaştırmak için tampon eklenmiştir unutmayın).Bu işlem doğru birim (panel B) volumetre ayarlamak için öğrencinin bu durumda bir P20, doğru micropipettor seçmek için, ilk ve sonraki gerekli. Bir ucu ucuna tampon örnek ulaşmasını micropipettor varil ihraç edilebilir muhtemel kirlenmeyi önlemek için sonunda bir pamuk yün tıkaç içerdiğini kullanılmıştır. Yavaş böylece sıvı pipet kovan içine sıçrama değildir Medyumu, uçları içine sıvı aspire dikkatli alınırsa, bu önlemi gerekli değildir. Teknik hataları yanlış hacim transfer olduğu sonucu ortaya çıkabilir. Örneğin, iş için yanlış micropipettor seçin veya yanlış bir birime doğru micropipettor üzerine volumetre ayarlayabilirsiniz. Tampon içine ucu çeker önce, piston serbest zaman ucu olarak çekilecek tampon fazlalığı neden ilk durağı geçmişte pistonu itebilir. Alternatif olarak, tampon içine yeterince ipucu batırmayın olmayabilir, bu nedenle hava çiziliryerine tampon ucu içine. Sen ucundan çıkacak istenen hacmi daha az neden mikrosantrifüj tüp içine tampon dağıtım zaman ikinci durağı pistonu itmek unutabilir. Panelinde sağ tüp Şekil 9 bir sol tüp göre tampon hacmi yanlış ihtiva eden bir tüp mikrosantrifüj gösterir. Bunun yerine tampon 12.5 ul reçete hazırlama, öğrenci 125 ul dağıtılır. Tamponunun bir ölçüde daha büyük hacimli teslim sonuçlanan; numaraları volumetre üzerine aynı ayarlanır ancak bu durumda, yanlış micropipettor iş (panel B öğrenci P20 bir P200 yerine kullanılan) için seçildi. Bu çözüm, örneğin PCR gibi bir uygulama için reaktifler oluşan bir karışım hazırlamak için kullanılan edildi, sonra bu hata, daha sonra aynı tüp eklenmiştir tüm reaktiflerin son konsantrasyon değişecektir. Sonuç olarak, moleküler biyoloji gibi prosedürleri yana, deney başarılı olması olası değildirPCR, tüm bileşenler düzgün çalışması için reaksiyon için spesifik konsantrasyonlarda olmak üzere ihtiyaç duymaktadır.

Her zaman micropipettors (namlu, özellikle içinde) steril olduğundan emin olmak mümkün değildir, çünkü stok çözümler deneyler başarısız bile sorun giderme çabaları neden kontamine olabilir. Steril çözümleri aktarmak micropipettors kullanarak, bu güçlü stok solüsyonları aynı hacimde (medya, tampon, su) serolojik pipet ile aseptik teknik kullanılarak yapılması önerilir. Bu 15 ml, 50 ml steril konik boru stok çözümler çalışan korumak için yaygındır. Bunlar genellikle bir micropipettor çalışırken işlemek için kolay ve ses aktarımı sırasında kontamine eğer stok solüsyon taze bir kısım ile değiştirilebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Bunsen beki alev yukarı yönlü tarafından oluşturulan Steril alan. Dk içinsteril çözümleri ve kültürlerin kirlenme imize, tüm manipülasyonlar steril alan içinde yapılacak önemlidir. Cam tüpler ve kültür şişeleri kenarları mavi koni, alev sıcak parçanın ucuna geçirilir edilmelidir. Plastik borular ve uçları Alevli edilemez - kullanım öncesi alternatif yöntemler önceden sterilize edilmesi gerekir.

Şekil 2
Şekil 2. Serolojik pipet sıvıların aseptik transferi için kullanılır. (A) sağ 25 ml çizimler, 10 ml ve 5 ml pipet olan soldan gösterilmiştir. (B) Serolojik pipet plastik veya cam olabilir. Plastik pipetler atılabilir (tek kullanımlık) ve tipik olarak tek tek tüm iç yüzeyleri steril (sol taraf) olan kağıt ve plastik hortumlar içinde sarılır. Cam pipet birden çok kez onlar kullanır temizlenip arasında sterilize edilir kullanılabilir; bu tipik olarak metal bidonlarda saklanır (sağyan).

Şekil 3
. Şekil 3 Serolojik pipet iki türlüdür: TC ("saklama") ya da TD ("aktarma"). Gösterilen bir TD 5 ml pipet açıklayıcı bir etikettir.

Şekil 4
Şekil 4. Aseptik teknik. Kapaklı bir şişe, matara, ya da tüp sıvı aspire yaparken, bankta kap yerleştirin asla. Bunun yerine, aynı elde kap tutma pipetle yardımcısı olarak gösterildiği gibi karşıt eli ile sıvı ihtiva eden tekneye işlenirken.

Şekil 5,
Serolojik pipet içine sıvı çizerken Şekil 5. Menisküs kurdu. Hacmi menisküsün alt hizalar pipet üzerinde mezuniyet işaretine karşılık gelir. Bu örnekte, menisküs 2.5 ml gradua aynı hizada TION işareti.

Şekil 6
Şekil 6. Tek kanallı micropipettor. (A) gösterilir namlu ucu tutucusunun alt kısmına monte plastik bir ucu ile bir örneğini micropipettor olup. Belirtilen volumetre yerleri vardır, volumetre ayarını değiştirmek için disk, namlu ucu sahibi, ucu fırlatma düğmesine ve piston için buton. (B) micropipettor üzerindeki piston sistemi İki durdurun.

Şekil 7
Şekil 7. Steril 125 ml'lik şişeler içinde medya aktarmak için serolojik pipet kullanarak. Sağ şişe E. bir kültür iken sol şişesi, sadece medya (LB) 25 ml var 37 hücreleri daha sonra, bir gece boyunca kuluçkaya sahip LB inokülasyon kaynaklanan coli ° C. Sağda şişe içinde ortam hücre büyümesi nedeniyle tortulaşmış nasıl not edin.

e 8 "src =" / files/ftp_upload/2754/2754fig8.jpg "/>
Şekil 8. Steril test tüplerinde medya aktarmak için serolojik pipet kullanarak. (A) sol tüp saf bir E. 5 ml'de coli kültür, doğru bir tüp kirlenmiş bakteriyel hücre kültürü 5 ml'de ederken. Iki kültür arasında büyüme özellikleri farklılıkları not edin. Her iki bulanık olsa da, sağ kültür kültürü E. için beklenenden farklı bir renk ve kıvam veren bir mantar veya diğer hava mikroorganizma ile kontamine olmuş coli hücreleri. Sağ tüpü sadece 2.5 ml LB içerir ederken (B) sol kültür tüpü 3,5 ml LB içerir. Bu hacim farkı tüplere bir medya noktadan-noktaya teslimat yapılırken yapılan bir hata sonucu.

Şekil 9
Şekil 9. Işılg micropipettors steril mikrosantrifüj tüpleri içine tampon aktarmak. Sağ tüpü 125 ul içerir ederken (A) sol mikrosantrifüj tüp, TE tampon, sadece 12.5 ul içerir. Bir boya berrak mikrosantrifüj tüp içindeki sıvının görselleştirme kolaylaştırmak için tampon eklendi dikkat ediniz. Sağ volumetre bir P200 micropipettor gelen iken (B) sol volumetre, bir P20 micropipettor arasındadır. Yaygın bir hata yanlış micropipettor seçmektir. Numaraları P20 ve P200 volumetre, yanlış cilt transferi yanlış micropipettor sonuçlarının seçimi aynı ayarlanır rağmen.

Şekil 10
Şekil 10. Çözümleri ve kültürlerin kirlenmesini önlemek için kullanılan Laminar akış kaputu. Gösterilen BSL-2 organizmalar ile çalışmak için onaylanmış bir biyogüvenlik kabine.

Discussion

Aseptik teknikle laboratuvar istenmeyen mikroorganizmalar tarafından kontamine olmasını steril çözümleri ve kültürleri önlemek için yapılan rutin bir dizi ifade eder. Bu tür teknikler büyüyen hücreleri gerektiren deneyler için çok önemlidir. Tamamen steril bir iş ortamında elde edilemez olsa da, bu, laboratuvar yüzeylerin dezenfekte Bir Bunsen beki kullanarak steril bir alan yaratarak, hava kapağını açıp kültür ve medya maruz sınırlandırılması, bu şişeler, tüpler ve cam pipetler gibi malzemelerin sterilizasyon gibi prosedürleri, ve steril olmayan yüzeyleri steril aletlerin temastan kaçınarak bir deneyde çözümleri ve kültür kirlenmesi olasılığı azaltır. Amaç ikinci doğa haline aşağıdaki önlem prosedürleri için; bir laboratuarda çalışırken, bu eğitim ve uygulama ile birlikte geliyor.

Gibi serolojik pipet ve mikrofon gibi aletler kullanılarak steril çözümleri ve kültürler ile Cilt transferleriropipettors bir laboratuvarda yapılan rutin teknikler birçok türleri vardır. Farklı deneysel uygulamalar farklı, henüz kesin ve doğru cilt aktarabilen araçlar için arayın. Micropipettors çözümleri sadece mikrolitre miktarda ihtiyaç moleküler biyoloji deneyleri için gerekli olan süre Serolojik pipet, mililitre birimleri kapsayan medya hazırlıklar gerektiren hücre kültürleri hazırlamak için mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanılmaktadır. Aseptik teknik bu aletle uygulanan zaman, kirlenme sıvı veya deneme türü ve miktarı ne olursa olsun ses aktarımı sırasında en aza indirilmiştir.

Bu protokol ele olmasa da, sık kirlenmeyi önlemek için kullanılan bir başka yollarla bir laminar akım kapağı (Şekil 10) içinde çalışmaktır. Bu cihaz, doku kültürü ve BLS-2 veya daha yüksek olarak sınıflandırılan mikroorganizmalar ile yapılan deneyler için önemlidir. A laminar akım kaput bir HEPA (yüksek verimlilik içerençalışma permeating gelen odasından filtresiz hava önlerken kaputun içine akan hava hava kirleticileri kaldırır partikül hava) filtresi. Alevden ısı kaput işlevselliği için gerekli hava akımını bozar, çünkü not, bir Bunsen beki laminar flow kaput içinde kullanılamaz.

Bu deneyler sırasında aseptik teknik kalitesini kontrol etmek için genellikle yararlıdır. Çözümler teyit etmek ve kültür ortamı, deneysel manipülasyonlar sırasında kontamine alamadım, her zaman negatif kontrol hazırlamak. Örneğin, bakteriyel kültür büyümesi için çorbasının tüpler hazırlanması durumunda, tek tüp, sadece steril ortam terk aşılamak değildir. Böyle istemeden tüp içine istenmeyen hücrelerin büyüme bulanıklık gibi kirlilik belirtileri daha sonra kontrol aşılanmamış kontrol tüpü inoküle tüpü boyunca orta inkübe edin. Kontrol tüpü kirli ise, deney tüpübüyük olasılıkla da kontamine ve deneyi tekrarladı gerekecektir. Bu önlemler her deneyde ile yapılmalıdır.

Disclosures

Ben ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Rakamlar için örnek kültürleri kurmak için resimler hazırlamak ve UCLA Kris Reddi için IROC Tasarımları Cori Sanders özel teşekkürler. Bu proje için finansman HHMI (HHMI Hibe No 52.006.944) tarafından sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Difco Laboratories 244620 Recipe also available in reference 6
TE Buffer:
EDTA disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Trizma-HCl Sigma-Aldrich T-3253
CiDecon Decon Laboratories 8504 Disinfectant
Ethanol Fisher Scientific A406 For use as disinfectant, prepare 70%(v/v) with distilled water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. (1998).
  2. Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL). 5th Ed, US Department of Health and Human Services (DHHS), Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and National Institutes of Health (NIH), U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm (2009).
  3. Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic Technique. Current Protocols in Microbiology. Appendix 4, Appendix 4D (2008).
  4. Coté, R. J. Aseptic Technique for Cell Culture. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
  5. Grimes, S. E. A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine. RAP Publication. AC802/E, 12-13 (2002).
  6. Guzman, K. Pipetting: A Practical Guide. The American Biology Teacher. 63, (2), 128-131 (2001).
  7. Jordan, T., et al. RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual. Howard Hughes Medical Institute. (2008).
  8. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 978-087969576 (2001).
  9. Seidman, L. A., Moore, C. J. Basic Laboratory Methods for Biotechnology: Textbook and Laboratory Reference. Prentice Hall, Inc. Upper Saddle River, New Jersey. (2000).
  10. Pipettes, Calibration & Repair Service - Pipette.com [Internet]. Available from: http://pipette.com/public/staticpages/guidetopipetting.aspx (2012).
  11. On-Line Resources for Biology: Table of Contents [Internet]. Available from: http://abacus.bates.edu/~ganderso/biology/resources/index.html (2012).
  12. PIPETMAN P User's Guide. Gilson Inc. Available from: http://www.gilson.com/Resources/LT801120_a_eng_030209%20BD.pdf (2012).
  13. Sterile Technique - Laboratory Wiki [Internet]. Available from: http://lab.wikia.com/wiki/Sterile_Technique (2012).
  14. Air displacement pipette - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Air_displacement_pipette (2012).
  15. Disinfectant - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Disinfectant (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics