Aseptiske laboratorieteknikker: Volume Overføringer med Serologiske Pipettes og Micropipettors

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

Når du arbeider i et laboratorium, er det viktig å minimere kilder til forurensning. Aseptisk teknikk refererer til prosedyrer som tillater overføring av kulturer og reagenser og samtidig unngå kontakt med ikke-sterile flater. Serologiske pipetter og micropipettors brukes til å måle nøyaktige volumer uten at sterilitet av løsninger som benyttes i forsøk.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), e2754, doi:10.3791/2754 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikroorganismer finnes overalt - i luft, jord, og menneskekroppen samt livløse overflater som laboratorium benker og tastaturer. Ubiquity av mikrober skaper en rikelig tilførsel av potensielle miljøgifter i et laboratorium. For å sikre eksperimentell suksess, må antallet av forurensninger på utstyr og arbeid overflater minimeres. Vanlig blant mange eksperimenter i mikrobiologi er teknikker som involverer måling og overføring av kulturer som inneholder bakterielle celler eller viruspartikler. For å gjøre det uten å kontakte ikke-sterile flater eller forurensende sterile medier krever (1) forbereder en steril arbeidsområde, (2) nøyaktig innstilling og nøyaktig lesing instrumenter for aseptisk overføring av væsker, og (3) riktig å manipulere instrumenter, kulturer flakonger, flasker og rør innenfor et sterilt felt. Lære disse prosedyrene krever opplæring og praksis. Ved første, bør tiltak være treg, bevisst og kontrollert med mål å være for aseptiske technique til å bli andre naturen når du arbeider på benken. Her presenterer vi de trinnene for måling av volum ved hjelp av serologiske pipetter og micropipettors innenfor et sterilt felt skapt av en gassbrenner. Volumene varierer fra mikroliter (mL) til milliliter (ml) avhengig av instrumentet som brukes. Væsker ofte overført inkludere steril kjøttkraft eller kjemiske løsninger samt bakteriekulturer og Phage bestander. Ved å følge disse prosedyrene, skal studentene kunne:

  • Arbeidet innenfor det sterile feltet skapt av bunsenbrenner flammen.
  • Bruk serologiske pipetter uten at det går instrument sterilitet.
  • Sug væsker med serologiske pipetter, nettopp lesing kalibrerte volumer ved å samkjøre menisken dannet av væsken til konfirmasjonen merker på pipetten.
  • Hold kultur flasker, flakonger, rør og deres respektive caps sterile under flytende overføringer.
  • Identifisere ulike programmer for plast versus glass serologisk pipettes.
  • Statlige nøyaktighet begrensninger for micropipettors.
  • Presist og nøyaktig satt volumer på micropipettors.
  • Vet hvordan du skal bruke den første og andre stopp på en micropipettor til å suge og overføre riktige volumer.

Protocol

1. Forbered en steril arbeidsområde

  1. Før du starter noen steriliseringsprosedyrer i arbeidet ditt område, vaske hendene grundig med antiseptisk såpe og varmt vann.
    • Pass på å re-vaske hendene hver gang du mistenker at du har forurensning fra eksperimentelle manipulasjoner.
  2. Rydd unna alle materialer unngår at arbeidet område på laboratoriebenken. Fjerne en pre-fuktet desinfeksjonsmiddel Tørk fra beholderen og tørk ned hele området. La desinfeksjonsmiddel fordampe - ikke tørk!
    • Bruk desinfeksjonsmidler som alkohol (isopropanol eller 70% etanol) eller fenoliske forbindelser (o-Phenylphenol).
    • For å forhindre aerosolization, eller produksjon av en fin tåke som inneholder bakterielle celler, og spredning av mikrobielle forurensninger, unngå utlevering desinfeksjonsmiddel fra en squeeze flaske.
    • Uttørking av mikroorganismer er en av de mest effektive måtene å dekontaminere overflater.
    • Selv om noen har nylig brukt laboratoriebenken og benken toppen ble tørket ned med desinfeksjonsmiddel, ALLTID begynne laboratorium tid ved å tørke av benken.
  3. Etter at desinfeksjonsmiddel har tørket helt, bruker en tenneren å tenne bunsenbrenner. Juster flammen slik at en blå kjegle kan sees i midten av flammen. Flammen produserer nå en updraft, eller luft konveksjonsstrømmer der varm luft stiger oppover og vekk fra flammen (figur 1). Som Varmen stiger, er mikroorganismer og støvpartikler tvunget oppover og bort fra den umiddelbare arbeidsområdet. Arbeid sakte, forsiktig, og med vilje til enhver tid innenfor dette området skapt av gassbrenner, referert til som et sterilt felt. Hold bunsenbrenner på under hele prosedyren.
    • Tuppen av blå kjegle er den varmeste delen av flammen.
    • Vær forsiktig så du ikke forstyrrer updraft ved raske bevegelser som dramatisk endrer air strømmer rundt laboratoriebenken. Opprette en updraft med gassbrenner minimerer muligheten for mikroorganismer og støv som faller ned på benken eller i åpne flasker, tuber eller kolber i arbeidsområdet.
  4. Ordne alle forsyninger som trengs for prosedyren på laboratoriebenken nær det sterile feltet. Kontroller at alle materialene er riktig merket.
    • Forsyninger kan omfatte serologiske pipetter og micropipettors, sterile kultur rør, sterile flakonger, media flasker med innhold av kjøttkraft, sterile Mikrosentrifugerør og micropipettor tips, stativer for rør, bakteriell celle kulturer og Phage aksjer.
    • Flytende medier bør steriliseres i en autoklav ved 121 ° C i minst 15 minutter på den flytende innstillingen. Større mengder media (> 1L) krever lengre autoclave ganger. Labware bør steriliseres i en autoklav ved 121 ° C i minst 30 minutter på gravitasjon (tørr) innstilling.
    • Generelt kan sterile løsninger lagres ved 4° C i opp til 5 måneder. Vær oppmerksom på at lagring reduseres betraktelig for løsninger som inneholder ustabile komponenter som for eksempel antibiotika - alltid sjekke produsentens anbefalinger.

2. Overføre væsker med Serologiske Pipettes

  1. Serologiske pipetter kommer i mange størrelser og alternativer: glass eller plast, engangs eller gjenbrukbar, plugget eller unplugged. Disse er kalibrert for å levere volumer som spenner fra en 0,1 ml til 25 ml.
    • Vanlige størrelser for serologiske pipetter er 5 ml, 10 ml og 25 ml og bør brukes til aseptiske flytende overføringer på 0,1 ml eller mer (panel A i figur 2). Det er også større serologiske pipetter som kan levere volumer opp til 100 ml, men er fokus for denne protokollen på de mer vanlige, mindre størrelse pipetter.
    • Pre-steriliserte pipetter med en bomullsdott plugg er nødvendig for mikrobiologi og vevskulturstudier eksperimenter. Pluggen skal ikke fjernes fra tilp av pipetten, den er designet for å fungere som en barriere mot overfylling pipetten.
    • Ulike applikasjoner kaller for plast kontra glass serologiske pipetter. Glass er nødvendig for organiske løsemidler. Begge kan brukes når du utfører BSL-1 eksperimenter på laboratoriebenken toppen. Bare plast kan brukes når du arbeider i en biosikkerhet skap med BSL-2 organismer der en gassbrenner ikke kan brukes. Det er også anbefalt at plast benyttes for søknader som innebærer overføring av smeltet agar.
    • Serologiske pipetter er av to typer: TC ("å inneholde") eller TD ("å levere"). TC pipetter levere hele volumet, inkludert spissen, og må "blåst ut" eller skylles for å få den angitte volum. TD pipetter er kalibrert til å forlate en liten bit i spissen som ikke skal leveres. Sørg for å sjekke etiketten på kroppen av pipetten nær toppen for å fastslå hvilken type det er (figur 3). Den mest brukte er TD pipetter, som er markedsked med doble ringer på toppen.
  2. Ta en steril plast serologisk pipette (også kalt en volumetrisk overføringspipetten) og fjern forsiktig papiret erme på slutten med vatt pluggen ved å trekke den bort som huden på en banan - ikke fjerne hele ermet, beskytter tuppen av pipetten som vil komme i kontakt med væsken som skal overføres. Trykk bare toppen av pipetten (over konfirmasjonen poeng) med hendene.
    • Aldri gå inn i en steril løsning med en brukt pipette, selv om stor omsorg har blitt tatt for å holde det sterilt.
    • Glass serologiske pipetter lagres vanligvis i metall beholdere (panel B i figur 2). Løsne toppen av beholderen og deretter forsiktig fjerne hetten, og flamme de åpne endene av hetten og lyddemper. Plasser lokket ned, på sin side, på desinfisert benken. Ta en pipette fra beholderen ved å holde den horisontalt og forsiktig risting det slik toppene av en eller to pipettérTES stikke ut omtrent en tomme og kan lett gripes. Legg ned beholderen på siden og fjerne en pipette, men vær forsiktig å ikke berøre de andre pipetter i beholderen. Ikke berør bunnen tuppen av pipetten med hendene, og unngå kontakt med tuppen med andre ikke-sterile flater.
  3. Fest en pipette hjelpemiddel som en pære, pumpe, eller pistol til toppen slutten av serologisk pipetten. Fjern papiret hylsen fra plast pipette. Hold pipetten hjelpemiddel i din høyre hånd.
    • Hvis du bruker et glass pipette, passerer den nederste tredjedelen av pipetten gjennom den blå kjegle i bunsenbrenner flammen i 1-3 sekunder. Roter pipetten 180 ° når den passerer gjennom flammen. Plast pipetter og slanger kan ikke flammet.
    • Hvis venstrehendt, hold pipetten hjelpemiddel i venstre hånd og gjennomføre påfølgende manipulasjoner av kultur flasker og tuber med din høyre hånd.
    • Forurensning tendens til å oppstå med plast pipetter ved uttak av den endelige økeshes av pipetten fra ermet, fordi den sterile spissen kommer i kontakt med den delen av ermet berørt av dine hender.
  4. Ta lokket av flasken inneholder sterile medier. Ikke plasser lokket på laboratoriebenken men hold det mellom ringefinger og inni den høyre hånden mens manipulere pipetten hjelp med tommelen, pekefingeren og langfingeren på samme hånd (figur 4). Hold flasken i en 45 graders vinkel, passerer kanten av flasken gjennom flammen på bunsenbrenner, skaper en steril feltet rundt det åpne flasken.
    • Selv beste unngås, hvis du må sette korken ned, plasserer den med forsiden ned på en desinfisert overflate. Med en lue som vender opp, er det større sjanse for forurensning fra bevegelser av objekter eller hender, og skaper luftstrømmer som forårsaker mikroorganismer og støvpartikler å stige ned til innsiden av hetten.
    • Formålet med flammende er ikke å sterilisere, men å varme åpningen of flasken og skaper luft konveksjonsstrømmer opp og vekk fra åpningen (dvs. updraft). Den varme, stigende luft forhindrer støvpartikler og andre forurensninger kommer inn i flasken.
    • Hold steril beholder åpen for så lite tid som mulig. Det er viktig å holde poeng av oppføring av luftbårne mikroorganismer til et minimum gjennom hele prosedyren.
    • Unngå hoste, nysing, snakke, og annen utilsiktet bevegelse mens sterile beholdere er åpne.
    • Aldri passere hender og fingre over toppen av et sterilt felt (dvs. åpne flasker eller flakonger, innsiden av rør og flaskekorker) når de har blitt passert bunsenbrenner flammen.
    • Arbeid alltid med en åpen flamme når du åpner sterile rør eller flasker. Aldri har mer enn en tube, flaske, eller kolbe åpen på benken gangen. Flaming bør gjøres umiddelbart etter åpning og like før stengetid tuber, flasker og flakonger.
  5. Plasser tuppen av serological pipette i flasken som inneholder sterilt media da aspirer, eller tegne prøven aseptisk, fra flasken. Bruk pipetten hjelp til å kontrollere flyten av prøven i pipetten. Nettopp lese volumet trukket inn i pipetten ved å samkjøre menisken dannet på toppen av væsken kolonnen til konfirmasjonen merker på den kalibrerte pipetten (figur 5).
    • IKKE MUNNEN Pipet! Bruk alltid en pipette hjelp (pumpe, pære, eller pistol).
    • Vær oppmerksom på rekkefølgen av numrene ved fastsettelse av volumet aspirert. Tallene kan skrives velte til toppen, eller vice versa, eller ofte ganger i begge retninger.
    • Når du leser volumet, alltid holde pipetten vertikalt, loddrett mot bakken, og vise væsken menisken døde-on i øyehøyde.
    • Serologiske pipetter er bare så nøyaktig som den minste markerte økningen, som er typisk 0,1 ml til 5 ml og 10 ml pipetter og 0,2 ml til 25 ml pipetter. Jegf større presisjon er nødvendig, kan en serologisk pipette benyttes i kombinasjon med en micropipettor.
  6. Pass kanten av flasken gjennom bunsenbrenner flammen igjen, og plasser deretter lokket tilbake på flasken. Sett media flasken til side.
    • Ikke brenn deg med gassbrenner i et rush for å lukke flasken.
  7. Hold et reagensrør eller kolbe i venstre hånd. Ta og hold lokket som beskrevet i trinn 4 ovenfor. Opprett et sterilt felt av flammende kanten av røret eller kolben i bunsenbrenner.
  8. Tilsett media i pipetten inn i røret eller kolben. Kontrollere flyten av prøven slik at den ikke sprute ut av røret eller kolben.
    • Volumene kan måles slik at hele volumet er levert og pipetten avløp helt, eller et bestemt volum oppnås ved å gjøre en punkt-til-punkt levering (en volum merking til en annen).
  9. Pass kanten av røret eller kolben gjennom Bunsen brenneER flamme igjen, så sett på lokket. Sett røret eller kolben til side. Fjern pipetten bistand, og kast pipetten i riktig avfall mottaket.
    • Plast serologiske pipetter er disponibel, mens glass serologiske pipetter kan steriliseres og brukes igjen. Riktig avhending krever plast pipetter plasseres i et eget beholder for skarpe gjenstander (stiv boks foret med plast avfallspose) mens glass pipetter utgangspunktet skal senkes ned i en container med 10% blekemiddel løsning å desinfisere innsiden og utsiden overflater. Da glasset pipetter skal være grundig vasket med laboratoriet vaskemiddel, skylles med destillert vann, og steriliseres i en autoklav.
  10. De samme trinnene bør følges når inokulere media med en bakteriekultur eller phage lager eller når du utfører seriefortynning.

3. Overføre væsker med Micropipettors

  1. Nettopp måling og utlevering minutt volumer kan være accomplifelle ved hjelp micropipettors (også referert til som Pipetman; Panel A i figur 6). Disse instrumentene kommer i forskjellige størrelser hver med et bestemt volum utvalg: P2 for 0,2 til 2 mL og P10 for 1-10 mL og P20 for 2-20 mL og P200 for 20-200 mL, og P1000 for 200-1000 mL.
    • Unn micropipettors med forsiktighet, da de er presisjonsinstrumenter. Ikke la dem ligge på laboratoriebenken uten tilsyn der de kan bli slått av og skadet. Ikke la pipetter til å komme i kontakt med etsende kjemikalier.
    • For volumer større enn 1000 mL, bruker en serologisk pipette.
    • Selv arbeider innenfor det sterile feltet skapt av gassbrenner, ikke flamme micropipettors, rør og plast tips. Rørene og tips bør være pre-steriliseres. De micropipettors kan tørkes ned med en pre-fuktet desinfeksjonsmiddel tørke før bruk.
  2. En numerisk volumeter viser utlevert volumet kan stilles ved å vri justeringsrattet. Adjust volumet før du går videre til trinn tre.
    • Slå aldri justeringsrattet OVER THE MENT rekkevidde!
    • For å oppnå maksimal nøyaktighet når redusere volumet innstillingen på micropipettor, sakte slå ned tommelen hjulet, noe som gjør at du ikke skyter den konfirmasjonen mark.
    • For å oppnå maksimal nøyaktighet når øke volumet innstillingen på micropipettor, slå tommelen hjulet opp, passerer ønsket konfirmasjonen merket med 1/3 av en sving. Så sakte ringe ned tommelen hjulet for å nå den tiltenkte volumet, noe som gjør at du ikke skyter den konfirmasjonen mark.

    Den volumeter viser tre tall. Avhengig av micropipettor, tallene tolkes annerledes. Vær oppmerksom på at hver micropipettor er bare så nøyaktig som den minste konfirmasjonen mark.

    P2: For volumer mellom 0,2 til 2,0 mL. Den øverste tallet angir volum i mikroliter. Det andre tallet indicates tiendedeler av en mikroliter (0,1 mL), og det tredje tallet representerer hundredeler av en mikroliter (0,01 mL). Hver konfirmasjonen mark tilsvarer en økning på to ganger ett tusendels (0,002 mL) av en mikroliter.

    P10: For volumer mellom 1,0 til 10,0 mL. Den øverste nummeret er for titalls mikroliter, dette vanligvis settes til "0" og skal bare settes til "1" med de to andre tallene satt til "0" når dispensing 10,0 mL. Det midterste tallet betegner volum i mikroliter. Den tredje tallet indikerer tiendedeler av en mikroliter (0,1 mL). Hver konfirmasjonen mark tilsvarer en økning på to ganger ett hundredeler (0,02 mL) av en mikroliter.

    P20: For volumer mellom 2,0 til 20,0 mL. Den øverste tall i svart er for titalls mikroliter, dette bør bare settes til "2" med de to andre tallene satt til "0" når dispensing 20,0 mL. Det andre tallet i svart betegner volumet i mikroliter. Den tredje tallet i rødt indikerer tiths av en mikroliter (0,1 mL). Hver konfirmasjonen mark tilsvarer en økning på to ganger ett hundredeler (0,02 mL) av en mikroliter.

    P200: For volumer mellom 20,0 til 200 mL. Den øverste nummeret er for hundrevis av mikroliter, dette bør bare settes til "2" med de to andre tallene satt til "0" når dispensing 200 mL. Den midterste tallet angir utlevert volum i titalls mikroliter, og det tredje tallet indikerer volumet i mikroliter. Hver konfirmasjonen mark tilsvarer en økning på to ganger ett tiendedels (0,2 mL) av en mikroliter.

    P1000: For volumer mellom 200-1000 mL. Den øverste nummeret er for tusenvis av mikroliter, dette vanligvis settes til "0" og skal bare settes til "1" med de to andre tallene satt til "0" når dispensing 1000 mL. Det midterste tallet er for hundrevis av mikroliter. Den nederste tallet er for titalls mikroliter. Hver konfirmasjonen mark tilsvarer en økning på to (2 mL) mikroliter.

    • Ytelse sjekk: Disse instrumentene bør kalibreres årlig, noe som sikrer nøyaktighet og presisjon er opprettholdt for å holde seg innenfor ± 5% av spesifikasjoner. Bruk en analytisk skala for å måle vann, noe som gjør at minimum og maksimum innstillingene svarer til den tiltenkte volumet. For eksempel bruke en P1000 til overføringer 200 mL av vann til en veie rett på skalaen. Siden vann har en tetthet på 1, deretter 1 ml vann tilsvarer 1 gram (g). Derfor bør 200 mL (0,2 ml) vann være lik 0,2 g. Sørg også for spissen ikke lekke ikke og kan opprettholde ønsket volum inntil utlevert bruke stempelet system.
  3. Micropipettors må brukes med plast engangs tips til alle tider. Monter et tips fast på enden av løpet av micropipettor. Trykk ned og vri litt for å sikre en lufttett.
    • Tips er vanligvis pakket inn i plast bokser som kan steriliseres ved autoklavering. Åpne spissen for å hente en spiss, Deretter lukker spissen boksen for å minimere kontakt med forurensninger i luften.
    • Noen tips har filtre som ligner på bomull ull pluggene på serologiske pipetter. Disse tipsene er ofte dyrere enn vanlige tips og dermed brukes for spesialiserte programmer. For eksempel, når man måler flyktige kjemikalier som kloroform eller radioaktive væsker, for eksempel 32 P-merket DNA, bruker filteret tips bidrar til å hindre fat av micropipettor fra å bli forurenset.
  4. Hold micropipettor i vertikal posisjon.
    • Holde micropipettor oppreist vil hindre væsker fra å kjøre inn og forurenser fat av micropipettor.
  5. Den micropipettor har tre posisjoner: (1) hvileposisjon, (2) Første stopp, og (3) Andre stopp (Figur 6, panel B). Instrumentet har en to-stop stempelet system. Første stopp har to funksjoner. Den første er å trekke i ønsket volum av væske i spissen when slippe stempelet fra første stopp til hvileposisjon. Den andre funksjonen er å dispensere de fleste av væske fra spissen da trykke inn stempelet fra resten posisjon til første stopp. Videre trykke stempelet til det andre stoppet dispenses hva væske forblir i spissen.
    Tråkk trykknapp på stempelet fra resten posisjon til første stopp. Luft lik volumet av innstillingen vil bli fortrengt.
  6. Dypp tuppen inn i væsken mens du holder nede knappen til første stopp.
    • Ikke berør micropipettor seg til sidene av flasker, tuber og flakonger, ellers innvendige flater av disse fartøyene vil bli forurenset. Bare tips er sterile.
  7. Slipp knappen sakte å suge væsken inn i tips. Stopp når trykknappen er tilbake til hvileposisjon. Vent et øyeblikk, slik at væsken kan trekkes inn i tips.
    • Volumet av væske i spissen vil være lik volumet of innstillingen av micropipettor.
    • Viskøse væsker som de som inneholder glyserol kreve mer tid å gå inn i tips.
  8. Fjern tips fra væsken, og visuelt inspisere spissen for å bekrefte at væsken trekkes opp har nådd forventet nivå i spissen, og det ikke er luftbobler i spissen.
    • Om nødvendig utvise væsken og manuelt stram tipsene inn på micropipettor. Tegn opp væsken og sjekk igjen.
  9. Plasser tuppen på en vinkel (10 ° til 45 °) mot veggen av røret får væsken. For å fordrive væsken langsomt trykke inn trykknappen på stempelet til første stopp. Vent et øyeblikk og trykk deretter på knappen til den andre stopp for å fordrive eventuelle gjenværende væske i spissen.
    • Trykke inn stempelet for fort kan føre til at væsken blir utvist til splatter eller vil produsere uønskede bobler i røret.
  10. Før du slipper stempelet til hvileposisjon, reflytte tips fra væsken.
  11. Kast tips til utpekt spisse gjenstander avfallsbeholder ved å trykke på utstøting knappen på micropipettor.

4. Rengjøring opp arbeidet Space

  1. Når du er ferdig med et eksperiment som krever bruk av aseptisk teknikk, slå av gassbrenner, og deretter sette bort alle forsyninger og reagenser. Tørk utsiden av Labware (flasker, micropipettors og pipettespissen bokser) med en pre-fuktet desinfeksjonsmiddel tørk for å sikre forurensninger blir ikke overført til lagringsstedet.
  2. Place forurenset glass og farlig avfall i riktig avhending stikkontakten. Laboratory avfall omfatter Labware som hansker, pipetter, tips og rør. Ikke-smittsomme farlig avfall genereres når du utfører eksperimenter med ikke-sykdomsfremkallende organismer (BSL-1), mens smittefarlig avfall oppstår ved bruk av patogene organismer (BSL-2 eller nyere). Smittefarlig avfall skal autoklaveres eller desinfiseres before det blir forkastet. Følg laboratoriet retningslinjer for sikkerhet beskrevet i BMBL (5 th Ed.) Så vel som de som tilbys av OSHA og institusjonelle Helse, miljø og sikkerhet avdelinger.
  3. Tørk hele arbeidsområdet på laboratoriebenken med en pre-fuktet desinfeksjonsmiddel Tørk fra beholderen, en gang slik at desinfeksjonsmiddel til å fordampe.
  4. Vask hendene grundig med antiseptisk såpe og varmt vann før du forlater laboratoriet.

5. Representative Resultater

Et eksempel på søknad om bruk av serologiske pipetter til å overføre væsker er vist i Figur 7. Disse pipetter ofte brukes i mikrobiologi for å forberede media for inokulasjon med bakteriekulturer. For eksempel, sterile flasker første er fylt med en spesifisert volum av kultur kjøttkraft, i dette tilfellet Luria buljong (LB), deretter et lite antall celler (som E. coli) er lagt til media. Bruke en serologisk pipette, første suppen må aseptisk overføres fra media flaske til kolben. I dette tilfelle ble 25 ml LB lagt til en 125 ml steril kolbe med en 25 ml serologisk pipette. Deretter må suppen bli inokulert med E. coli-celler. Her ble 10 mL av celler overføres aseptisk ved hjelp av en P20 micropipettor fra en tidligere voksende kultur kolbe til 25 ml av frisk LB. Kolben inkuberes i en vekst kammer for en bestemt tidsperiode, slik at cellene til å replikere (for dette eksemplet ble E. coli-celler inkubert over natten ved 37 ° C på en skjelvende plattform). Resultatet er en grumsete bakteriell celle kultur som kan brukes for senere eksperimenter.

Serologiske pipetter også kan brukes til å overføre media opprinnelig leveres i en flaske til reagensrør, eller mellom reagensrør, er som skjer når du gjør fortynninger av en bakteriekultur. Hvis aseptisk teknikk ikke er opprettholdt gjennom disse typer medier manipulasjoner , Da kulturer blir forurenset, og påfølgende forsøk med disse kulturene vil bli forsinket fordi friske, rene kulturer må være forberedt. Feil oppstår fordi et sterilt felt ikke opprettholdes gjennom hele prosedyren. For eksempel kan du glemme å desinfisere laboratoriebenken eller flamme kanten av en kultur flaske eller tube. Du kan berøre tuppen av pipetten eller sette korken av en flaske eller prøverør på benken i stedet for å holde den i hånden din. Riktig prosedyre er kritisk for å holde forurensning av media og kulturer til et minimum. Figur 8A gir et eksempel på en ren versus forurenset kultur E. coli i et rør som inneholder 5 ml LB. Det venstre panelet viser en kultur som viser ensartet fint turbiditet typisk for en ren E. coli kultur. I kontrast, viser panelet til høyre en forurenset kultur der vekstkarakteristikker avvike fra som forventet for denne bakteriestammen.

"> Tekniske feil kan oppstå ved å manipulere serologiske pipetter resulterer i overføring av feil mengder media mellom reagensrør. For eksempel kan du lese volumet på pipetten feil (dvs. topp mot bunn av menisk) eller du kan fordrive media helt fra en TD pipette, som ble designet for å legge igjen en liten bit i spissen ikke skal leveres. Når du utfører et punkt-til-punkt levering av media, kan du bruke feil kalibrering merkene og dispensere feil volum. Figur 8B viser et eksempel på reagensglass med riktige versus feil mengder media. Røret til venstre inneholder 3,5 ml LB målt med en 5 ml serologisk pipette. Studenten har gjennomført en punkt-til-punkt levering av mediet som LB ble utarbeidet til 5,0 ml konfirmasjonen mark og utlevert til 1,5 ml merket. røret på høyre inneholder 2,5 ml LB målt med en pipette av samme størrelse fordi studenten som utførte punkt-til-punkt levering av media incorrectly dispensert det fra 5,0 ml merket til 2,5 ml merket. Denne feilen vil resultere i en bakteriekultur som vil være på et høyere konsentrasjon enn planlagt, og forårsake fortynninger å være feil. Dette spredning av feil kan resultere i et mislykket eksperiment som måtte gjentas med de riktige cellekonsentrasjonen.

Et eksempel på søknad om bruk av micropipettors å overføre væsker er vist i figur 9. Disse pipetter brukes til en rekke eksperimenter i molekylær biologi og mikrobiologi herunder forberede prøver for PCR og gelelektroforese eller annethvert sterile medier eller buffer med små volumer (mindre enn 1,0 ml) av bakterielle celler eller Phage partikler. I eksempelet forutsatt, overføres studenten 12,5 mL av TE buffer i en 1,8 ml mikrosentrifuge tube (venstre rør i panel A; oppmerksom på at fargen er lagt til buffer for å lette visualisering av væske inne i klare Mikrosentrifugerør).Denne prosedyren er nødvendig at studenten først for å velge riktig micropipettor, i dette tilfellet en P20, og siden sette volumeter til riktig volum (panel B). Et tips ble brukt som inneholder en bomullsdott plugg i enden for å hindre mulig forurensing som kan bli utvist fra fat av micropipettor fra nå buffer prøven i spissen. Denne forholdsregelen er ikke nødvendig hvis omsorg er tatt når aspirere væske inn i tuppene, deprimerende stempelet langsomt slik at væsken ikke sprute inn i pipettor fat. Tekniske feil kan oppstå som resultat i overføring av uriktige volumer. For eksempel kan du velge feil micropipettor for jobben, eller sette volumeter på riktig micropipettor til en feil volum. Før leve spissen inn i bufferen, kan du skyver stempelet forbi første stopp, forårsaker et overskudd av buffer for å bli trukket inn spissen når slippe stempelet. Alternativt kan du ikke dyppe spissen langt nok inn i bufferen, så luft trekkesinn spissen i stedet for buffer. Du kan glemme å presse stempelet til andre stopp når utlevering buffer i mikrosentrifuge røret forårsaker mindre enn ønsket volum å bli løst fra spissen. Retten tube i panel A Figur 9 viser en mikrosentrifuge tube inneholder feil volumet av buffer i forhold til røret på venstre. I stedet for utlevering 12,5 mL av bufferen, utlevert studenten 125 mL. I dette tilfellet, selv om tallene er identiske på de volumeter ble feil micropipettor valgt for jobben (studenten brukte en P200 istedenfor en P20, panel B) som resulterer i levering av et betydelig større volum av buffer. Hvis denne løsningen ble brukt til å forberede en blanding av reagenser for et program som PCR, så denne feilen vil endre den endelige konsentrasjonen av alle reagenser senere lagt til samme røret. Derfor er det usannsynlig at forsøket vil lykkes, ettersom molekylærbiologiske prosedyrer sliksom PCR krever at alle komponenter skal være på bestemte konsentrasjoner for reaksjonen å fungere ordentlig.

Fordi det er ikke alltid mulig å sikre micropipettors (særlig innsiden av fat) er sterile, kan stamløsninger bli forurenset forårsaker enda feilsøking innsats for å mislykkes når du utfører eksperimenter. Hvis du bruker micropipettors å overføre sterile løsninger, er det sterkt anbefalt at alikvoter av stamløsninger (media, buffer, vann) gjøres ved bruk av aseptisk teknikk med serologiske pipetter. Det er vanlig å opprettholde jobbe stamløsninger i 15 ml eller 50 ml sterilt koniske rør. Disse er ofte lettere å manipulere mens du betjener micropipettor og kan bli erstattet med en ny delmengde av stamløsning hvis forurenset under volum overføringer.

Figur 1
Figur 1. Sterile feltet opprettet av updraft av bunsenbrenner flamme. Til minimize forurensning av sterile løsninger og kulturer, er det avgjørende at alle manipulasjoner gjennomføres innenfor det sterile feltet. Felgene av glass kultur rør og kolber skal videreformidles gjennom tuppen av blå kjegle, den varmeste delen av flammen. Plastrørene og tips kan ikke flammet - disse bør være pre-steriliseres ved alternative metoder før bruk.

Figur 2
Figur 2. Serologiske pipetter brukes til aseptisk overføring av væsker. (A) Vist fra venstre til høyre er tegninger av 25 ml, 10 ml og 5 ml pipetter. (B) Serologiske pipetter kan være av plast eller glass. Plast pipetter er disponibel (engangspassord) og vanligvis er individuelt pakket i papir og plast ermene hvor alle innvendige overflater er steril (venstre side). Glass pipetter kan brukes flere ganger forutsatt at de er rengjort og sterilisert mellom bruker, disse vanligvis lagres i metall beholdere (høyreside).

Figur 3
. Figur 3 Serologiske pipetter er av to typer: TC ("å inneholde") eller TD ("å levere"). Vises er den forklarende etiketten av en TD 5 ml pipette.

Figur 4
Figur 4. Aseptisk teknikk. Når aspirere væske fra en flaske, flaske, eller tube med caps, plasser aldri lokket på benken. I stedet holder lokket på samme hånd som pipette hjelp mens manipulere fartøyet inneholder væske med den motsatte hånden som vist.

Figur 5
Figur 5. Menisk dannes når tegning væske inn i serologisk pipette. Volumet tilsvarer konfirmasjonen merket på pipetten der bunnen av menisk justeres. I dette eksempelet, justerer menisken med 2,5 ml gradua sjon mark.

Figur 6
Figur 6. Enkelt kanal micropipettor. (A) som vises er en prøve micropipettor med en plast spissen festet til bunnen av tønna spissen holderen. Indikerte er plasseringen av den volumeter, tommelen hjulet for å endre volumeter innstillingen, tønna spissen holderen, spissen ejektor knappen, og trykknapp for stempelet. (B) To-stopp stempelet system på en micropipettor.

Figur 7
Figur 7. Bruk serologiske pipetter til å overføre media til sterile 125 ml flasker. Den venstre kolbe har 25 ml av media bare (LB), mens den høyre kolben er en kultur av E. coli som følge av inokulere LB med cellene deretter ruger over natten ved 37 ° C. Legg merke til hvordan media i kolben til høyre er grumset på grunn av cellevekst.

e 8 "src =" / files/ftp_upload/2754/2754fig8.jpg "/>
Figur 8. Bruke serologiske pipetter til å overføre media til sterile reagensrør. (A) Den venstre tube inneholder 5 ml av et rent E. coli kultur, mens den høyre tube inneholder 5 ml av en forurenset bakteriell celle kultur. Legg merke til forskjellene i vekstkarakteristikker mellom de to kulturene. Selv om begge er grumset, har kulturen på høyre blitt forurenset med en sopp eller andre luftbårne mikroorganismer gi kulturen en annen farge og konsistens fra at forventet for E. coli-celler. (B) Den venstre kulturen tube inneholder 3,5 ml LB mens den høyre tuben inneholder kun 2,5 ml LB. Dette volumet forskjellen skyldtes en feil som ble gjort mens gjennomføre en punkt-til-punkt levering av media til rørene.

Figur 9
Figur 9. Using micropipettors å overføre buffer i sterile Mikrosentrifugerør. (A) Den venstre mikrosentrifuge tube inneholder kun 12,5 mL av TE buffer, mens den høyre tube inneholder 125 mL. Merk at et fargestoff har blitt lagt til buffer for å lette visualisering av væske inne i klare Mikrosentrifugerør. (B) Den venstre volumeter er fra en P20 micropipettor, mens den høyre volumeter er fra en P200 micropipettor. En vanlig feil er å velge feil micropipettor. Selv om tallene er identiske på P20 og P200 volumeter, valg av feil micropipettor resulterer i overføring av feil volumer.

Figur 10
Figur 10. Laminær hette brukes til å hindre forurensning av løsninger og kulturer. Vist er en biosikkerhet skap godkjent for arbeid med BSL-2 organismer.

Discussion

Aseptisk teknikk refererer til et sett av rutinemessige prosedyrer gjøres for å hindre sterile løsninger og kulturer fra å bli forurenset av uønskede mikroorganismer i laboratoriet. Slike teknikker er avgjørende for eksperimenter som krever voksende celler. Selv om et arbeid innstilling som er helt sterilt ikke kan oppnås, prosedyrer som desinfiserer laboratorium flater, skape et sterilt felt ved hjelp av en gassbrenner, noe som begrenser eksponeringen av uncapped kulturer og medier til luft, sterilisering materialer som flasker, rør og glass pipetter, og unngå kontakt av sterile instrumenter med ikke-sterile flater reduserer muligheten for å forurense løsninger og kulturer i et eksperiment. Målet er at disse forebyggende prosedyrer for å bli andre naturen, og dette kommer med trening og praksis mens du arbeider i et laboratorium.

Volum overføringer med sterile løsninger og kulturer som bruker instrumenter som serologiske pipetter og micropipettors er en av mange typer rutinemessige teknikker gjort i et laboratorium. Ulike eksperimentelle applikasjoner krever virkemidler som kan overføre forskjellige, men likevel presise og nøyaktige, volumer. Serologiske pipetter brukes i mikrobiologiske laboratorier for å forberede cellekulturer som krever medier forberedelser involverer milliliter volumer, mens micropipettors er avgjørende for molekylærbiologi eksperimenter som trenger bare mikroliter mengder løsninger. Når aseptisk teknikk praktiseres med disse instrumentene, er forurensning minimeres under volum overføringer uavhengig av mengden av væske eller type eksperiment.

Selv ikke drøftet i denne protokollen, er en annen måte vanligvis brukes til å hindre forurensning til å arbeide innenfor en laminær hette (Figur 10). Dette utstyret er kritisk for vev kultur og for eksperimenter utført med mikroorganismer som er klassifisert som BLS-2 eller høyere. En laminær hette inneholder en HEPA (høy effektivitetpartikkelfilter luft) filter som fjerner luftbårne forurensninger fra luften som strømmer inn i panseret mens hindre ufiltrert luft fra rommet i å trenge arbeidsområdet. Av notatet, kan en gassbrenner ikke brukes inne i en laminær hette fordi varmen fra flammen forstyrrer luftstrømmen avgjørende for funksjonaliteten av hetten.

Det er ofte nyttig å kontrollere kvaliteten på aseptisk teknikk når du utfører eksperimenter. For å bekrefte løsninger og dyrkingsmedier ikke bli forurenset under eksperimentelle manipulasjoner, alltid forberede en negativ kontroll. For eksempel, hvis forbereder rør av kjøttkraft for vekst av bakteriekulturer, ikke vaksinere en tube slik at bare sterile medier. Inkuber medium langs inokulerte rørene deretter inspisere uninoculated kontroll tube for tegn på forurensning, for eksempel turbiditet fra vekst av uønskede celler utilsiktet introdusert inn i røret. Hvis kontrollen tube er forurenset, den eksperimentelle tubes sannsynligvis er forurenset også, og forsøket må gjentas. Disse forholdsregler bør gjøres med hvert eksperiment.

Disclosures

Jeg har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Spesiell takk til Cori Sanders ved IROC Designs for å forberede illustrasjoner og Kris Reddi ved UCLA for å sette opp eksempler kulturer for tall. Midler til dette prosjektet ble gitt av HHMI (HHMI Grant nr. 52006944).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Difco Laboratories 244620 Recipe also available in reference 6
TE Buffer:
EDTA disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Trizma-HCl Sigma-Aldrich T-3253
CiDecon Decon Laboratories 8504 Disinfectant
Ethanol Fisher Scientific A406 For use as disinfectant, prepare 70%(v/v) with distilled water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. (1998).
  2. Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL). 5th Ed, US Department of Health and Human Services (DHHS), Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and National Institutes of Health (NIH), U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm (2009).
  3. Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic Technique. Current Protocols in Microbiology. Appendix 4, Appendix 4D (2008).
  4. Coté, R. J. Aseptic Technique for Cell Culture. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
  5. Grimes, S. E. A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine. RAP Publication. AC802/E, 12-13 (2002).
  6. Guzman, K. Pipetting: A Practical Guide. The American Biology Teacher. 63, (2), 128-131 (2001).
  7. Jordan, T., et al. RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual. Howard Hughes Medical Institute. (2008).
  8. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 978-087969576 (2001).
  9. Seidman, L. A., Moore, C. J. Basic Laboratory Methods for Biotechnology: Textbook and Laboratory Reference. Prentice Hall, Inc. Upper Saddle River, New Jersey. (2000).
  10. Pipettes, Calibration & Repair Service - Pipette.com [Internet]. Available from: http://pipette.com/public/staticpages/guidetopipetting.aspx (2012).
  11. On-Line Resources for Biology: Table of Contents [Internet]. Available from: http://abacus.bates.edu/~ganderso/biology/resources/index.html (2012).
  12. PIPETMAN P User's Guide. Gilson Inc. Available from: http://www.gilson.com/Resources/LT801120_a_eng_030209%20BD.pdf (2012).
  13. Sterile Technique - Laboratory Wiki [Internet]. Available from: http://lab.wikia.com/wiki/Sterile_Technique (2012).
  14. Air displacement pipette - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Air_displacement_pipette (2012).
  15. Disinfectant - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Disinfectant (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics