Aseptiske Laboratorieteknikker: Volume overførsler med Serologiske pipetter og Micropipettors

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

Når du arbejder i et laboratorium, er det nødvendigt at minimere kilder til forurening. Aseptisk teknik henviser til procedurer, der tillader overførsel af kulturer og reagenser og samtidig undgå kontakt med ikke-sterile overflader. Serologiske pipetter og micropipettors anvendes til at måle præcise mængder uden at kompromittere sterile opløsninger, der anvendes i forsøg.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), e2754, doi:10.3791/2754 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikroorganismer findes overalt - i luft, jord og menneskelige krop samt på døde overflader som laboratorie-bænke og computertastaturer. Den allestedsnærværende af mikrober skaber en rigelig forsyning af potentielle kontaminanter i et laboratorium. For at sikre eksperimentel succes, skal antallet af forurenende stoffer på udstyr og arbejde overflader minimeres. Udbredt blandt mange forsøg inden for mikrobiologi er teknikker, der involverer måling og overførsel af kulturer indeholdende bakterieceller eller virale partikler. For at gøre det uden at kontakte ikke-sterile overflader eller kontaminerende sterile medier kræver (1) udarbejdelse af en steril arbejdsområde, (2) præcis indstilling og præcist læse instrumenter til aseptisk overførsel af væsker, og (3) ordentligt manipulere instrumenter, kulturer kolber, flasker og rør i et sterilt område. At lære disse procedurer kræver uddannelse og praksis. I første omgang skal handlinger være langsom, bevidst, og styres med det mål at være for aseptiske technique bliver anden karakter, når der arbejdes på bænken. Her præsenterer vi de benyttes til at måle mængder ved hjælp af serologiske pipetter og micropipettors i et sterilt felt skabt af en bunsenbrænder. Mængder i området fra mikroliter (ul) til milliliter (ml) afhængigt af det anvendte instrument. Væsker almindeligt overført omfatter steril bouillon eller kemiske løsninger samt bakteriekulturer og fag-lagre. Ved at følge disse procedurer, skal de studerende være i stand til:

  • Arbejder inden for det sterile område skabes af bunsenbrænder flamme.
  • Anvendelse af serologiske pipetter uden at kompromittere instrument sterilitet.
  • Aspirer væsker med serologiske pipetter, netop læsning kalibreret mængder ved at tilpasse menisken dannet af væske til målestreger på pipetten.
  • Hold kultur flasker, kolber, rør og deres respektive kasketter sterile under flydende overførsler.
  • Identificere forskellige ansøgninger om plast versus glas serologisk pipettes.
  • Statslige nøjagtighed begrænsninger for micropipettors.
  • Præcist og korrekt indstillet mængder på micropipettors.
  • Vide, hvordan man korrekt brug af første og andet stop på en mikropipette at aspirere og overføre korrekte mængder.

Protocol

1. Forbered en Steril arbejdsområde

  1. Før du starter nogen steriliseringsprocedurer i dit arbejdsområde, skal du vaske dine hænder grundigt med antiseptisk sæbe og varmt vand.
    • Vær sikker på at re-vaske dine hænder når som helst du har mistanke om forurening fra dine eksperimentelle manipulationer.
  2. Ryd væk alle materialer roder dit arbejdsområde på laboratoriet bænken. Fjern en pre-fugtet desinfektionsmiddel tørre fra beholderen og tørre ned hele området. Lad desinfektionsmiddel til at fordampe - ikke tør!
    • Anvende desinfektionsmidler såsom alkohol (isopropanol eller 70% ethanol) eller phenolforbindelser (o-phenylphenol).
    • For at undgå aerosoldannelse eller produktionen af en fin tåge, som indeholder bakterieceller, og udbredelsen af mikrobielle forureninger, undgå udlevering desinfektionsmiddel fra en plastflaske.
    • Udtørring af mikroorganismer er en af ​​de mest effektive måder sanerende overflader.
    • Selv hvis nogen har for nylig brugt laboratoriet bænk og bænken top blev udslettet ned med desinfektionsmiddel, altid begynde Deres laboratorium tid ved at tørre ned bænken.
  3. Efter desinfektionsmidlet er tørret helt, kan du bruge en tænder til at tænde bunsenbrænderen. Justere flammen, så at en blå konus kan ses i midten af ​​flammen. Flammen er nu producere en updraft eller luft konvektionsstrømme i hvilken varm luft stiger op og væk fra flammen (figur 1). Som varmen stiger, er mikroorganismer og støvpartikler tvinges opad og væk fra arbejdsområdet. Arbejd langsomt, grundigt og bevidst på alle tidspunkter inden for dette område skabt af bunsenbrænder, der omtales som et sterilt felt. Hold bunsenbrænder på i løbet af hele proceduren.
    • Spidsen af ​​den blå keglen er den varmeste del af flammen.
    • Vær omhyggelig med ikke at forstyrre updraft ved hurtige bevægelser, som dramatisk ændrer air strømme omkring laboratoriebordet. Oprettelse af en updraft med bunsenbrænderen minimerer muligheden for mikroorganismer og støv falder ned på bænken eller i åbne flasker, rør eller kolber i arbejdsområdet.
  4. Arranger alle de leverancer nødvendige for proceduren på laboratoriet bænken nær det sterile område. Sørg for, at alle materialer er korrekt mærket.
    • Leverancer kan omfatte serologiske pipetter og micropipettors, sterile kultur rør, sterile kolber, medier flasker indeholdende bouillon, sterile mikrocentrifugerør og mikropipette tips, reoler til rør, bakterielle cellekulturer, og fag-lagre.
    • Flydende medier skal steriliseres i en autoklav ved 121 ° C i mindst 15 minutter på væsken indstilling. Større mængder af medier (> 1L) kræver længere autoklave gange. Labware skal steriliseres i en autoklav ved 121 ° C i mindst 30 minutter på tyngdekraft (tør) indstilling.
    • I almindelighed kan sterile opløsninger opbevares ved 4° C i op til 5 måneder. Bemærk, at lagringstid reduceres væsentligt for opløsninger der indeholder ustabile komponenter, såsom antibiotika - altid tjekke producentens anbefalinger.

2. Overførsel af væsker ved brug Serologiske Pipetter

  1. Serologiske pipetter kommer i mange størrelser og optioner: plast eller glas, engangs-eller genbruges, tilsluttet eller unplugged. Disse er kalibreret til at levere mængder i området fra en 0,1 ml til 25 ml.
    • Almindelige størrelser til serologisk pipette er 5 ml, 10 ml og 25 ml og bør anvendes til aseptisk flydende overførsel af 0,1 ml eller mere (panel A i figur 2). Der er også større serologiske pipetter, der kan levere mængder op til 100 ml, men fokus i denne protokol er på de mere almindelige, mindre størrelse pipetter.
    • Pre-steriliserede pipetter med en vat stikket er behov for mikrobiologi og vævskultur eksperimenter. Stikket bør ikke fjernes fra tilp af pipetten, og det er udformet til at fungere som en barriere for overfyldning pipetten.
    • Forskellige applikationer kræver plast versus glas serologiske pipetter. Glas er nødvendig for organiske opløsningsmidler. Enten kan anvendes ved udførelse af BSL-1 eksperimenter på brugsstedet. Kun plast kan anvendes, når der arbejdes i en biosikkerhed kabinet med BSL-2-organismer, hvor en bunsenbrænder ikke kan anvendes. Det anbefales også, at plast kan anvendes til anvendelser, der involverer overførsel af smeltet agar.
    • Serologiske pipetter er af to typer: TC ("til at indeholde") eller TD ("at levere"). TC pipetter levere hele det volumen, inklusive spidsen, og skal "blæses ud" eller skylles for at få den specificerede mængde. TD pipetter er kalibreret til at efterlade en lille smule i spidsen, som ikke bør leveres. Sørg for at tjekke etiketten på kroppen af pipetten nær toppen at fastslå, hvilken type det er (Figur 3). Den mest almindeligt anvendte er TD pipetter, der marked med dobbelte ringe foroven.
  2. Tag en steril plastik serologisk pipette (også kaldet en volumetrisk overførsel pipette) og fjern forsigtigt papiret ærme i slutningen med vat proppen ved at trække den væk som huden på en banan - ikke fjerne hele ærmet, beskytte spidsen af pipetten der vil komme i kontakt med væsken, der skal overføres. Tryk kun toppen af ​​pipetten (over målestreger) med hænderne.
    • Aldrig gå ind i en steril opløsning med en brugt pipette, selvom stor omhu er blevet taget for at holde det sterilt.
    • Glas serologiske pipetter opbevares typisk i daaserne (panel B i figur 2). Løsn toppen af ​​dåsen og derefter forsigtigt at fjerne hætten, og flammer de åbne ender af hætten og beholderen. Sæt hætten ned, på sin side, på den desinficerede bænken. Tag en pipette fra beholderen ved at holde det vandret, og forsigtigt ryste den, så toppen af ​​en eller to pipetteTES stikker ud omkring en tomme og kan nemt udnyttes. Fastlægge dåsen på siden og fjerne en pipette, men vær varsom med ikke at røre de andre pipetterne i beholderen. Rør ikke ved bunden spidsen af ​​pipetten med dine hænder, og undgå kontakt spidsen med andre ikke-sterile overflader.
  3. Anbringe en pipette hjælp såsom en pære, pumpe eller pistol til den øverste ende af den serologiske pipette. Fjerne papiret muffen fra plastpipette. Hold pipetten støtte i din højre hånd.
    • Hvis der anvendes en glaspipette, passerer den nederste tredjedel af pipetten gennem blå kegle i Bunsen brænderflammen til 1-3 sekunder. Rotere pipetten 180 °, når den passerer gennem flammen. Plastpipetter og-rør ikke kan flammet.
    • Hvis venstrehåndet, Hold pipetten støtte i din venstre hånd og udføre efterfølgende manipulationer af kultur flasker og tuber med højre hånd.
    • Forurening tendens til at forekomme med plastik pipetter, når at trække den endelige udtagningHES af pipetten fra bøsningen, fordi den sterile spids kommer i kontakt med den del af muffen i berøring med hænderne.
  4. Tag hætten af ​​flasken med sterile medier. Anbring ikke hætten på laboratoriet bænken, men hold den mellem din ring finger og håndflade af højre hånd, mens manipulere pipetten støtte med tommelfingeren, og langfinger på samme hånd (Figur 4). Holde flasken i en 45 ° vinkel, passerer kanten af ​​flasken gennem flammen af ​​Bunsen-brænder, hvilket skaber et sterilt felt omkring den åbne flasken.
    • Selv bedst undgås, hvis man skal sætte hætten ned, læg den med forsiden nedad på en desinficeret overflade. Med en hætte, der vender opad, er der større risiko for forurening af bevægelser af objekter eller hænder, skabe luftstrømme, der forårsager mikroorganismerne og støvpartikler til ned til den indvendige overflade af hætten.
    • Formålet med brændende ikke at sterilisere, men at opvarme åbningen of flasken og skaber luftkonvektion strømme op og væk fra åbningen (dvs. updraft). Den varme, opstigende luft hjælper med at forhindre støv og andre forureninger i at komme ind i flasken.
    • Hold steril beholder åben så lidt tid som muligt. Det er vigtigt at holde de indgangssteder for luftbårne mikroorganismer til et minimum under hele proceduren.
    • Undgå hoste, nysen, taler og andre utilsigtet bevægelse, mens sterile beholdere er åbne.
    • Aldrig passere hænder og fingre over toppen af ​​et sterilt felt (dvs. åbne flasker eller kolber, indersiden af ​​rør og flaskepropper) når de er blevet passeret gennem bunsenbrænder flamme.
    • Arbejd altid med en åben flamme, når du åbner sterile rør eller flasker. Aldrig har mere end ét rør, flaske eller kolbe åbent på bænken på et tidspunkt. Flaming skal ske umiddelbart efter åbning, og lige før lukketid rør, flasker og kolber.
  5. Placér spidsen af ​​serological pipette i flasken med de sterile medierne derefter suge eller trække prøve aseptisk, fra flasken. Anvende pipetten støtte til at styre strømningen af ​​prøven ind i pipetten. Netop læses volumen trækkes ind i pipetten ved at tilpasse menisken dannet på toppen af væskesøjlen til målestreger på kalibreret pipette (figur 5).
    • IKKE Bid Afpipettér! Brug altid en pipette støtte (pumpe, pære eller pistol).
    • Vær opmærksom på den sekvens af tal ved fastsættelsen af ​​aspireret volumen. Numrene kan trykkes spids til top, eller vice versa, eller ofte gange i begge retninger.
    • Når man læser lydstyrken, altid Hold pipetten lodret, vinkelret på jorden, og se den flydende menisken døde på i øjenhøjde.
    • Serologiske pipetter er kun så nøjagtigt som den mindste mærket interval, der typisk er 0,1 ml til 5 ml og 10 ml pipetter og 0,2 ml til 25 ml pipetter. Jegf større præcision er nødvendig, kan en serologisk pipette anvendes i kombination med en mikropipette.
  6. Før kanten af ​​flasken gennem bunsenbrænder flamme igen, og derefter placere hætten tilbage på flasken. Sæt medierne flasken til side.
    • Må ikke brænder dig med bunsenbrænder i et kapløb om at lukke flasken.
  7. Hold et reagensglas eller kolbe i din venstre hånd. Tag og hold hætten som beskrevet i trin # 4 ovenfor. Skabe et sterilt område af flammer kanten af ​​røret eller anbringes i bunsenbrænder.
  8. Dispenser medierne i pipetten ind i røret eller kolben. Styre strømningen af ​​prøven, så det ikke plaske ud af røret eller kolben.
    • Mængderne kan måles, således at hele mængden bliver leveret og pipetten afløb helt, eller en bestemt mængde opnås ved at lave et punkt-til-punkt levering (en volumen markering til en anden).
  9. Passerer kanten af ​​røret eller kolben gennem Bunsen brændingenis flamme igen, og derefter hætten på igen. Sæt røret eller flasken til side. Tag pipetten støtten, og kassér pipetten i den rigtige affaldsbeholderen.
    • Plastic serologiske pipetter er engangsemballage, mens glas serologiske pipetter kan steriliseres og bruges igen. Korrekt bortskaffelse kræver plast pipetter blive placeret i et dertil indrettet beholder til skarpe genstande (stiv kasse foret med plastik affaldspose), mens glaspipetter første omgang skal nedsænkes i en beholder med 10% blegemiddel til at desinficere de indvendige og udvendige overflader. Derefter glaspipetter skal vaskes grundigt med laboratorie detergent, skyllet med destilleret vand og steriliseret i en autoklave.
  10. De samme trin skal følges ved podning af medier med en bakteriekultur eller fag-lager eller når de udfører seriefortyndinger.

3. Overførsel af væsker ved brug Micropipettors

  1. Netop måle og dispensere små mængder kan være accomplistald med micropipettors (også henvist til som Pipetman, Panel A i figur 6). Disse instrumenter kommer i forskellige størrelser med hver et bestemt volumen interval: P2 for 0,2-2 ul, P10 for 1-10 gl, P20 for 2-20 gl og P200 til 20-200 pi, og P1000 for 200-1000 gl.
    • Forkæl micropipettors med omhu, da de er præcisionsinstrumenter. Lad dem ikke ligge på laboratoriet bænken uden opsyn, hvor de kan blive slået og skadet. Lad ikke pipetter til at komme i kontakt med ætsende kemikalier.
    • For mængder større end 1000 pi, bruge en serologisk pipette.
    • Selv arbejder inden for det sterile område skabt af bunsenbrænder, ikke flamme micropipettors, rør og plast tips. Rørene og tips skal klargøres steriliseres. De micropipettors kan tørres af med en forud-befugtet desinfektionsmiddel tørre inden anvendelse.
  2. En numerisk volumeter viser det dispenserede volumen kan indstilles ved at dreje justeringsknappen. Adjust volumen, før du fortsætter til trin # 3.
    • ALDRIG Drej indstillingsskruen over den tiltænkte rækkevidde!
    • For at opnå maksimal nøjagtighed, når faldende lydstyrkeindstillingen på mikropipette, langsomt ringe ned hjulet, sørg for ikke at skyde over mærket.
    • For at opnå maksimal nøjagtighed ved øgning lydstyrkeindstillingen på mikropipette, ringe tommelfingeren hjulet op, passerer den ønskede mærket med 1/3 af en tur. Så langsomt ringe ned tommelfingeren hjulet for at nå den tilsigtede volumen, sørg for ikke at skyde over mærket.

    Den volumeter viser tre numre. Afhængigt af mikropipette, er antallet fortolkes anderledes. Bemærk, at hver mikropipette er kun så præcis som den mindste mærket.

    P2: For mængder mellem 0,2-2,0 gl. Det øverste tal angiver volumen i mikroliter. Det andet tal indicates tiendedele af en mikroliter (0,1 pi), og det tredje tal repræsenterer hundrededele af en mikroliter (0,01 pl). Hver målestregen svarer til en stigning på to en-tusindedele (0,002 gl) af en mikroliter.

    P10: For mængder mellem 1,0-10,0 gl. Det øverste tal er for snesevis af mikroliter, hvilket normalt er sat til "0", og bør kun sættes til "1" med de to andre numre, der er på "0", når dispensering 10,0 gl. Den midterste række angiver mængden i mikroliter. Den tredje række viser tiendedele af en mikroliter (0,1 ul). Hver målestregen svarer til en stigning på to en-hundrededele (0,02 pl) af en mikroliter.

    P20: For mængder mellem 2,0-20,0 gl. Det øverste tal i sort er for snesevis af mikroliter, hvilket kun bør sættes til "2" med de to andre numre, der er på "0", når dispensering 20,0 gl. Det andet tal i sort angiver mængden i mikroliter. Det tredje tal i rød viser tiths af en mikroliter (0,1 pi). Hver målestregen svarer til en stigning på to en-hundrededele (0,02 pl) af en mikroliter.

    P200: For mængder mellem 20,0-200 gl. Det øverste tal er for hundredvis af mikroliter, hvilket kun bør sættes til "2" med de to andre numre, der er på "0", når dispensering 200 gl. Det midterste tal angiver det dispenserede volumen i ti mikroliter, og det tredje tal angiver mængden i mikroliter. Hver målestregen svarer til en stigning på to en tiendedele (0,2 pl) af en mikroliter.

    P1000: For mængder mellem 200-1000 gl. Det øverste tal er for tusinder af mikroliter, hvilket normalt er sat til "0", og bør kun sættes til "1" med de to andre numre, der er på "0", når dispensering 1000 gl. Det midterste tal er for hundredvis af mikroliter. Den nederste tal er for snesevis af mikroliter. Hver målestregen svarer til en stigning på to (2 pl) mikroliter.

    • Ydelse kontrollere: Disse instrumenter skal være kalibreret årligt, sikre nøjagtighed og præcision opretholdes for at holde sig inden for ± 5% af specifikationer. Brug en analytisk skala til at måle vand, og sørg for de minimale og maksimale indstillinger svarer til den tilsigtede volumen. For eksempel kan du bruge en P1000 på overførsler 200 ul af vand til en afveje parabol på skalaen. Idet vandet har en densitet på 1, hvorefter 1 ml af vand er ækvivalent med 1 gram (g). Således bør 200 pi (0,2 ml) af vand lig med 0,2 g. Sørg også for, at spidsen ikke lække og kan opretholde den ønskede lydstyrke indtil de dispenseres ved hjælp af stemplet system.
  3. Micropipettors skal bruges med plast engangsspidser på alle tidspunkter. Passer til en spids tæt på enden af ​​cylinderen af ​​mikropipette. Tryk ned og vride lidt for at sikre en lufttæt forsegling.
    • Spidser sædvanligvis pakket i kasser, som kan steriliseres ved autoklavering. Åbn spidsen boksen for at hente et tip, Luk derefter spidsen kassen for at minimere kontakten med forurenende stoffer i luften.
    • Nogle tips har filtre svarende til vattet stik på serologiske pipetter. Disse tips er ofte dyrere end almindelige tips og dermed bruges til specialiserede anvendelser. For eksempel medvirker ved måling flygtige kemikalier, såsom chloroform eller radioaktive væsker, såsom 32P-mærket DNA, under anvendelse filter spidser forhindre cylinder mikropipette i at blive forurenet.
  4. Hold mikropipette i en lodret position.
    • Holde mikropipette opretstående vil forhindre væske i at løbe inde og forurene cylinder mikropipette.
  5. Den mikropipette har tre positioner: (1) hvilestilling, (2) første stop, og (3) andet stop (figur 6, panel B). Instrumentet har et to-stop stemplet system. Det første stop har to funktioner. Den første er at trække det ønskede volumen af ​​væske ind i spidsen WHEn frigive stemplet fra det første stop til hvilestillingen. Den anden funktion er at dispensere hovedparten af ​​væske fra spidsen ved nedtrykning af stemplet fra hvilestillingen til det første stop. Yderligere nedtrykning af stemplet til det andet stop dispenserer helst væsken forbliver i spidsen.
    Nedtrykke trykknappen på stemplet fra hvilestillingen til det første stop. Luft svarende til volumenet af indstilling blive forskudt.
  6. Fordyb spidsen i væsken, mens du holder trykknappen til det første stop.
    • Rør ikke ved mikropipette sig til siderne af flasker, rør og kolber, ellers de indvendige overflader af disse fartøjer vil blive forurenet. Kun de tips er sterile.
  7. Slippes trykknappen langsomt til suge væske ind i spidsen. Stop når trykknappen er tilbage til hvileposition. Vent et øjeblik, så væske kan suges ind i spidsen.
    • Volumenet af væske i spidsen vil svare til mængden of indstillingen af ​​mikropipette.
    • Viskose væsker, såsom dem, der indeholder glycerol kræver mere tid til at komme ind i spidsen.
  8. Fjerne spidsen fra væsken, og visuelt inspicere spidsen for at bekræfte, at væske, der trækkes op, er nået det forventede niveau i spidsen og der er ingen luftbobler i spidsen.
    • Hvis det er nødvendigt, uddrive væsken og manuelt stramme tips ned på mikropipette. Træk væsken op og tjek igen.
  9. Placere spidsen i en vinkel (10 ° til 45 °) mod væggen af ​​røret, der modtager væske. At udvise væsken langsomt trykke trykknappen på stemplet til det første stop. Vent et øjeblik, og tryk derefter på trykknappen til det andet stop for at uddrive eventuelt resterende væske i spidsen.
    • Nedtrykning af stemplet for hurtigt, kan væsken, der skal udsendes splatte eller vil frembringe uønskede bobler i glasset.
  10. Før frigive stemplet i hvileposition, rebevæger spidsen fra væsken.
  11. Kassér tips til skarpe genstande affaldsbeholder ved at trykke på udslyngning knappen på mikropipette.

4. Rengøring Up The Work Space

  1. Når du er færdig med et eksperiment, som kræver brug af aseptisk teknik, skal du slukke for bunsenbrænderen, og derefter lægge alle forsyninger og reagenser. Tør de udvendige overflader af laboratorieudstyr (flasker, micropipettors og pipettespidsen kasser) med en pre-fugtet desinfektionsmiddel tørre for at sikre, forurenende stoffer ikke overføres til lagerplads.
  2. Sted forurenet glas og farligt affald i den rigtige bortskaffelse beholderen. Laboratorium affald omfatter laboratorieudstyr såsom handsker, pipetter, tips og rør. Ikke-infektiøs farligt affald genereres, når du udfører eksperimenter med ikke-patogene organismer (BSL-1), mens smittefarligt farligt affald genereres ved brug af patogene organismer (BSL-2 eller derover). Smittefarligt affald skal autoklaveres eller desinficeres before den kasseres. Følg sikkerhedsbriller til laboratoriebrug retningslinjer beskrevet i BMBL (5 th Ed.) Samt dem, der af OSHA og institutionelle miljø sundhed og sikkerhed afdelinger.
  3. Tør hele arbejdsområdet på laboratoriebordet med en forud-befugtet desinfektionsmiddel serviet fra beholderen igen tillader desinfektionsmiddel til at fordampe.
  4. Vask hænderne grundigt med antiseptisk sæbe og varmt vand, inden de forlader laboratoriet.

5. Repræsentative resultater

En prøve ansøgning under anvendelse af serologiske pipetter til at overføre væsker er vist i figur 7. Disse pipetter ofte anvendes i mikrobiologiske laboratorium for at forberede medier til podning med bakteriekulturer. For eksempel først sterile kolber fyldt med et specificeret volumen af dyrkningsmediet, i dette tilfælde Luria Broth (LB) og derefter et lille antal celler (såsom E. coli) tilsættes til mediet. Ved hjælp af en serologisk pipette første væsken overføres aseptisk fra mediet flasken til kolben. I dette tilfælde blev 25 ml LB tilsat til en 125 ml steril kolbe med en 25 ml serologisk pipette. Dernæst skal væsken podes med E. coli-celler. Her blev 10 ul celler overført aseptisk under anvendelse af en P20 mikropipette fra en tidligere voksende kultur kolben med 25 ml frisk LB. Kolben inkuberes i et vækstkammer for et bestemt tidsrum, tillader cellerne at replikere (i dette eksempel, blev E. coli-celler inkuberet natten over ved 37 ° C på et rystebord). Resultatet er en uklar bakteriel cellekultur, der kan anvendes til efterfølgende eksperimenter.

Serologiske pipetter kan også anvendes til at overføre medier oprindeligt blev leveret i en flaske til reagensglas eller mellem reagensglas, som det sker, når der fortyndinger af en bakteriekultur. Hvis aseptisk teknik ikke opretholdes under hele disse typer medier manipulationer , Da kulturer bliver forurenet, og efterfølgende eksperimenter ved hjælp af disse kulturer vil blive forsinket, fordi friske, uforurenet kulturer bliver nødt til at være forberedt. Fejl opstår, fordi et sterilt felt ikke opretholdes under hele proceduren. For eksempel kan man glemmer at desinficere laboratoriebord eller flamme kanten af ​​en kultur flaske eller et rør. Du kan røre spidsen af ​​pipetten eller indstille hætten af ​​en flaske eller reagensglas på bænken i stedet for at holde den i hånden. Passende fremgangsmåde er kritisk for at holde kontaminering af medier og kulturer til et minimum. Figur 8A viser et eksempel på en ren versus forurenet kultur af E. coli i et rør indeholdende 5 ml af LB. Det venstre panel viser en kultur udviser ensartet fin turbiditet typisk en ren E. coli-kultur. I modsætning hertil viser den højre panel en forurenet kultur, i hvilken vækstkarakteristika afviger fra dem, der forventes for denne bakteriestamme.

"> Tekniske fejl kan opstå, når manipulere serologiske pipetter resulterer i overførsel af forkerte mængder af medier mellem reagensglas. For eksempel kan du læse volumen på pipetten forkert (dvs., top eller bund af menisken), eller du kan bortvise medierne helt fra en TD pipette, som var designet til at efterlade en lille smule i spidsen for ikke at blive leveret. Når du udfører en punkt-til-punkt levering af medier, kan du bruge de forkerte kalibrerings-mærker og dispensere forkert volumen. 8B viser et eksempel på reagensglas med korrekte forhold forkerte volumener medium. Røret venstre indeholder 3,5 ml LB målt med en 5 ml serologisk pipette. Eleven udført en punkt-til-punkt levering af det medie, LB blev udarbejdet til 5,0 ml mærket og dispenseres til 1,5 ml mærket. Røret højre indeholder 2,5 ml LB målt med en pipette med samme størrelse, fordi den studerende, der udførte punkt-til-punkt levering af medier incorrectly dispenseret det fra 5,0 ml mærket til 2,5 ml mærket. Denne fejl vil resultere i en bakteriekultur, der vil være ved en højere koncentration end planlagt, hvilket efterfølgende fortyndinger at være ukorrekte. Denne spredning af fejl kan resultere i en ikke eksperiment, der skal gentages med de korrekte cellekoncentrationer.

En prøve ansøgning til anvendelse micropipettors at overføre væsker er vist i figur 9. Disse Pipetter anvendes til en række forsøg i molekylærbiologi og mikrobiologi, herunder fremstilling af prøver til PCR og gelelektroforese eller podning sterile medier eller puffer med små volumener (mindre end 1,0 ml) af bakterieceller eller fagpartikler. I det viste eksempel, overføres den studerende 12,5 ul TE-buffer i en 1,8 ml mikrocentrifugerør (venstre rør i panel A, bemærk at farvestoffet er tilføjet til bufferen for at lette visualiseringen af ​​væsken inde i klare mikrocentrifugerør).Denne fremgangsmåde kræves eleven først for at vælge den korrekte mikropipette, i dette tilfælde en P20, og ved siden indstille volumeter til den korrekte volumen (panel B). Et tip er blevet anvendt, der indeholder en vat proppen for enden for at forhindre eventuel forurening, der kunne blive udvist fra fad af mikropipette at nå bufferen prøven i spidsen. Denne forholdsregel er ikke nødvendigt, hvis omhu, når suge væsker ind i de tips, trykke stemplet langsomt, så væsken ikke sprøjte ind i pipette tønde. Tekniske fejl kan forekomme, som resulterer i overførsel af ukorrekte mængder. For eksempel kan du vælge den forkerte mikropipette til jobbet eller indstille volumeter på den rigtige mikropipette en forkert volumen. Før neddypning af spidsen i bufferen, kan skubbe stemplet forbi det første stop, hvorved et overskud af puffer at blive trukket ind i spidsen ved udløsning af glideren. Alternativt kan du ikke nedsænkes spidsen langt nok ind i bufferen, så luften sugesind i spidsen i stedet for buffer. De kan glemme at skubbe stemplet til det andet stop, når afgivelse puffer ind i mikrocentrifugerøret forårsager mindre end den ønskede volumen, der skal frigives fra spidsen. Højre rør i panel A i figur 9 viser et mikrocentrifugerør indeholdende ukorrekt rumfang puffer i forhold til røret til venstre. I stedet for udlevering 12,5 ul puffer, dispenseret eleven 125 ul. I dette tilfælde, selv om antallet er indstillet på samme måde på den volumeter blev den forkerte mikropipette udvalgt til jobbet (eleven anvendes en P200 i stedet for en P20, panel B) resulterer i afgivelse af et væsentligt større volumen af ​​puffer. Hvis denne opløsning blev anvendt til fremstilling af en blanding af reagenser til en anvendelse, såsom PCR, vil denne fejl vil ændre den endelige koncentration af alle reagenser senere tilføjes til det samme rør. Det er derfor usandsynligt, at forsøget vil lykkes, da molekylærbiologiske procedurer såsomsom PCR kræver, at alle komponenter er ved bestemte koncentrationer i reaktionsblandingen for at fungere korrekt.

Fordi det ikke altid er muligt at sikre micropipettors (især indersiden af ​​cylinderen) er sterile, kan stamopløsninger blive forurenet forårsage endda fejlfinding bestræbelser på at svigte når udførelse af eksperimenter. Hvis du bruger micropipettors til at overføre sterile opløsninger, anbefales det kraftigt, at portioner af stamopløsninger (medier, buffer, vand) kan foretages ved hjælp af aseptisk teknik med serologiske pipetter. Det er almindeligt at opretholde arbejde stamopløsninger i 15 ml eller 50 ml sterile koniske rør. Disse er ofte lettere at manipulere, mens du betjener en mikropipette og kan udskiftes med en frisk portion af bestanden løsning, hvis forurenet under volumen overførsler.

Figur 1
Figur 1. Sterilt felt skabt af updraft af bunsenbrænder flamme. Til minimize kontaminering af sterile opløsninger og kulturer, er det kritisk, at alle manipulationer gennemføres i det sterile område. Kanterne af glas dyrkningsrør og kolber bør passere gennem spidsen af ​​den blå kegle den varmeste del af flammen. Plastrør og tips ikke kan flammet - disse skal klargøres steriliseres ved alternative metoder inden brug.

Figur 2
Figur 2. Serologiske pipetter anvendes til aseptisk overførsel af væsker. (A) vist fra venstre til højre er tegninger af 25 ml, 10 ml, og 5 ml pipetter. (B) Serologiske pipetter kan være plast eller glas. Plastpipetter er disponibel (engangs brug), og typisk er individuelt pakket ind i papir og plast ærmer, hvor alle indvendige overflader er sterile (venstre side). Glas pipetter kan bruges flere gange, såfremt de forinden rengøres og steriliseres mellem bruger; disse typisk er gemt i daaserne (højreside).

Figur 3
. Figur 3 Serologiske pipetter er af to typer: TC ("til at indeholde") eller TD ("at levere"). Vist er den forklarende etiketten på en TD 5 ml pipette.

Figur 4
Figur 4. Aseptisk teknik. Når aspiration væsker fra en flaske, flaske, eller rør med hætter, aldrig placere hætten på bænken. I stedet holder hætten i den samme hånd som pipette bistand, samtidig med at manipulere beholderen indeholder væske med den modsatte hånd, som vist.

Figur 5
Figur 5. Menisk dannes ved at trække væsken ind serologisk pipette. Volumen svarer til mærket på pipetten, hvor bunden af ​​menisken justeres. I dette eksempel, justerer menisken med 2,5 ml gradua tion mærke.

Figur 6
Figur 6. Enkelt kanal mikropipette. (A) vist er en prøve mikropipette med en plast spids fæstnet til bunden af ​​cylinderen spids holderen. Angivet er de steder i volumeter, tommelfingeren hjulet for at ændre volumeter indstillingen, tønden spidsen indehaveren, spidsafskyder knappen, og trykknap for stemplet. (B) To-trins stempel system på en mikropipette.

Figur 7
Figur 7. Anvendelse serologiske pipetter at overføre medier i sterile 125 ml kolber. Den venstre Kolben er 25 ml af medium alene (LB), mens den højre kolben er en kultur af E. coli som følge af podning LB med celler derefter inkubere natten over ved 37 ° C. Bemærk hvordan medierne i kolben på ret uklar på grund af cellevækst.

e 8 "src =" / files/ftp_upload/2754/2754fig8.jpg "/>
Figur 8. Anvendelse serologiske pipetter at overføre medier til sterile reagensglas. (A) Den venstre rør indeholder 5 ml af en ren E coli-kultur, mens den højre rør indeholder 5 ml af en forurenet bakteriel cellekultur. Bemærk forskellene i vækst-egenskaber mellem de to kulturer. Skønt begge er uklar, er kulturen på højre blevet forurenet med en svamp eller andre luftbårne mikroorganismer give kulturen en anden farve og konsistens af den, der forventes for E. coli-celler. (B) Den venstre podningsrør indeholder 3,5 ml LB mens den højre røret kun indeholder 2,5 ml LB. Denne mængde forskel skyldes en fejl begået under udførelse en punkt-til-punkt levering af medier til rørene.

Figur 9
Figur 9. Using micropipettors at overføre buffer i sterile mikrocentrifugerør. (A) Den venstre mikrocentrifugerør kun indeholder 12,5 ul TE-buffer, mens den højre rør indeholder 125 pi. Bemærk, at et farvestof er tilsat til bufferen for at lette visualiseringen af ​​væsken inde i klare mikrocentrifugerør. (B) Den venstre volumeter er fra en P20 mikropipette, mens den højre volumeter er fra en P200 mikropipette. En almindelig fejl er at vælge den forkerte mikropipette. Selv om tallene er indstillet identisk på P20 og P200 volumeter, udvælgelse af de forkerte mikropipette resulterer i overførsel af forkerte mængder.

Figur 10
Figur 10. Laminært flow, der anvendes til at forhindre kontaminering af opløsninger og kulturer. Vist er en biosikkerheden kabinet godkendt til arbejde med BSL-2 organismer.

Discussion

Aseptisk teknik henviser til et sæt af rutinemæssige procedurer udføres for at forhindre sterile opløsninger og kulturer bliver forurenet med uønskede mikroorganismer i laboratoriet. Sådanne teknikker er afgørende for eksperimenter, der kræver voksende celler. Skønt et værk indstilling, der er fuldstændig sterile ikke kan opnås, procedurer, såsom desinfektion laboratorie overflader, hvilket skaber et sterilt område ved hjælp af en bunsenbrænder, begrænse eksponeringen af ​​ikke-reducerede kulturer og medier til luften, steriliserende materiale, såsom flasker, rør og glaspipetter, og at undgå kontakt af sterile redskaber med ikke-sterile overflader reducerer muligheden for kontaminerende opløsninger og kulturer i et eksperiment. Målet er, at disse forholdsregler procedurer for at blive anden karakter, hvilket kommer med uddannelse og praksis, mens du arbejder i et laboratorium.

Volume overførsler med sterile opløsninger og kulturer ved hjælp af instrumenter såsom serologiske pipetter og micropipettors er en af ​​mange typer af rutinemæssige teknikker udføres i et laboratorium. Forskellige eksperimentelle applikationer kræver instrumenter, der kan overføre forskellige, men alligevel præcise og korrekte, mængder. Serologiske pipetter anvendes i mikrobiologiske laboratorier til fremstilling cellekulturer kræver medier præparater omfatter milliliter mængder, mens micropipettors er afgørende for molekylær biologi eksperimenter, der kræver kun mikroliter mængder af opløsninger. Når aseptisk teknik udøves med disse instrumenter er kontaminering minimeres under volumen overførsel uanset mængden af ​​væske eller type af eksperiment.

Selvom det ikke er diskuteret i denne protokol, et andet middel almindeligvis anvendes til at forhindre forurening er at arbejde inden for en laminar flow-bænk (figur 10). Dette udstyr er kritisk for vævskultur og eksperimenter udført med mikroorganismer klassificeret som BLS-2 eller højere. En laminar strømningshætte indeholder et HEPA (højeffektivpartikler luft) filter, som fjerner luftbårne forurenende stoffer fra luften strømmer ind i hætten og samtidig forhindre ufiltreret luft fra rummet i at trænge arbejdsområdet. Bestemmelse, kan en bunsenbrænder ikke anvendes i en laminar strømningshætte, fordi varmen fra flammen forstyrrer luftstrømmen afgørende for funktionen af ​​hætten.

Det er ofte nyttigt at kontrollere kvaliteten af ​​dit aseptisk teknik, når du udfører eksperimenter. For at bekræfte opløsninger og dyrkningsmedier ikke bliver forurenet under eksperimentelle manipulationer, altid fremstille en negativ kontrol. For eksempel, hvis fremstilling rør bouillon for vækst af bakteriekulturer ikke inokulere et rør så kun sterile medier. Inkubere mediet sammen med podede rørene derefter inspicere uinokuleret kontrol rør for tegn på kontaminering såsom uklarhed af væksten af ​​uønskede celler utilsigtet føres ind i røret. Hvis kontrollen røret er forurenet, den eksperimentelle rørets sandsynlighed er forurenet så godt, og forsøget skal gentages. Disse forholdsregler bør ske med hvert forsøg.

Disclosures

Jeg har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Særlig tak til Cori Sanders på Iroc Designs for at forberede illustrationer og Kris Reddi ved UCLA for at oprette prøve kulturer til figurer. Finansieringen af ​​dette projekt blev leveret af HHMI (HHMI Grant nr. 52.006.944).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Difco Laboratories 244620 Recipe also available in reference 6
TE Buffer:
EDTA disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Trizma-HCl Sigma-Aldrich T-3253
CiDecon Decon Laboratories 8504 Disinfectant
Ethanol Fisher Scientific A406 For use as disinfectant, prepare 70%(v/v) with distilled water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. (1998).
  2. Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL). 5th Ed, US Department of Health and Human Services (DHHS), Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and National Institutes of Health (NIH), U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm (2009).
  3. Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic Technique. Current Protocols in Microbiology. Appendix 4, Appendix 4D (2008).
  4. Coté, R. J. Aseptic Technique for Cell Culture. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
  5. Grimes, S. E. A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine. RAP Publication. AC802/E, 12-13 (2002).
  6. Guzman, K. Pipetting: A Practical Guide. The American Biology Teacher. 63, (2), 128-131 (2001).
  7. Jordan, T., et al. RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual. Howard Hughes Medical Institute. (2008).
  8. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 978-087969576 (2001).
  9. Seidman, L. A., Moore, C. J. Basic Laboratory Methods for Biotechnology: Textbook and Laboratory Reference. Prentice Hall, Inc. Upper Saddle River, New Jersey. (2000).
  10. Pipettes, Calibration & Repair Service - Pipette.com [Internet]. Available from: http://pipette.com/public/staticpages/guidetopipetting.aspx (2012).
  11. On-Line Resources for Biology: Table of Contents [Internet]. Available from: http://abacus.bates.edu/~ganderso/biology/resources/index.html (2012).
  12. PIPETMAN P User's Guide. Gilson Inc. Available from: http://www.gilson.com/Resources/LT801120_a_eng_030209%20BD.pdf (2012).
  13. Sterile Technique - Laboratory Wiki [Internet]. Available from: http://lab.wikia.com/wiki/Sterile_Technique (2012).
  14. Air displacement pipette - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Air_displacement_pipette (2012).
  15. Disinfectant - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Disinfectant (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics