Fare Daimi Orta Serebral Arter ligasyon Of Uygulama

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Orta serebral arter (MCA) ligasyonu, hayvan modellerinde fokal serebral iskemi çalışma bir tekniktir. Bu yöntemde, orta serebral arter kraniotomi maruz kalmaktadır ve koterizasyon tarafından bağlandı. Bu yöntem son derece tekrarlanabilir infarkt hacimleri ve mevcut diğer yöntemlere göre artış post-operatif sağkalım oranları verir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Colak, G., Filiano, A. J., Johnson, G. V. The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse. J. Vis. Exp. (53), e3039, doi:10.3791/3039 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fokal serebral iskemi, inme hastalarında görülen en yaygın türü arasında yer alıyor. Klinik önemi nedeniyle İskemiden sırasında ortaya çıkan olaylardan çalışmak için uygun hayvan modelleri geliştirmek için uzun bir çaba olmuştur. Bu tekniklerin en yaygın olan kemirgenler, birçok farklı hayvan modelleri kullanarak, geçici veya kalıcı fokal veya global iskemi modelleri içermektedir.

Kemirgenler 1-6 fokal iskemi modeli olarak da literatürde pMCAo denir kalıcı MCA ligasyonu yöntemi yaygın olarak kullanılır. Bu yöntem başlangıçta Tamura ve arkadaşları tarafından sıçanlarda için tarif edilmiştir. 1981 7. Bu protokol bir kraniotomi MCA ve proksimal bölgelerde elektrokoagülasyon tıkalı erişmek için kullanılır oldu. Infarktlar oklüzyonu konuma bağlı olarak çoğunlukla kortikal ve bazen striatal bölgeleri içerir. Bu teknik, şimdi iyi kurulmuş ve birçok laboratuvarda 8-13 kullanılmaktadır. Erken bu tekniğin kullanımı "infarkt çekirdek" ve "penumbra" 14-16 tanımı ve açıklaması yol açtı, ve genellikle, potansiyeli nöroprotektif bileşikler 10, 12, 13, 17 değerlendirmek için kullanılır . Sıçanlarda yapılan ilk çalışmalar olmasına rağmen, kalıcı MCA ligasyonu küçük modifikasyonlar 18-20 farelerde başarıyla kullanılmaktadır.

Bu model, tekrarlanabilir infarktlar ve artan sonrası sağ kalım oranları elde edilir. Iskemik inme insanlarda yaklaşık% 80 MCA alan 21 olur ve böylece bu vuruş çalışmaları için bir çok ilgili bir model . Şu anda, orada inmeli hastalarda etkili tedaviler oldukça kıt ve böylece potansiyel farmakolojik bileşikler test ve fizyolojik sonuçlarını değerlendirmek için iyi bir model için bir ihtiyaç vardır. Bu yöntem ayrıca, in vivo hücre içi hipoksi yanıt mekanizmaları eğitim için kullanılabilir .

Burada, bir C57/BL6 fare MCA ligasyonu cerrahi sunuyoruz. Biz ameliyat öncesi hazırlık, MCA ligasyonu cerrahi ve infarkt hacimleri ölçümü için 2,3,5 triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile boyanarak açıklar.

Protocol

Bu protokol, Rochester komitesinin araştırma hayvanların etik (UÇAR) ayrılmış Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aseptik teknikler protokol sırasında takip edilmelidir. Steril eldiven ve maske kullanılması gereklidir.

Protokol sırasında kullanılan ekipman, malzeme, kimyasallar, araçlar, Tablo 1'de açıklanmıştır.

1. Pre-cerrahi Hazırlık

  1. Hemen ameliyat sonrası ve ardından ilk 24 saat post-operatif dönem boyunca her 3-5 saat, 2 saat önce cerrahi buprenorfin (0.05mg/kg) subkutan farelere enjekte.
  2. Tüm cerrahi aletler, gazlı bez sünger, pamuk uçlu aplikatörler otoklav ile sterilize edin. Cerrahi aletler, sağ kullanmadan önce kuru steril gazlı bez cerrahisi ve hava içinde% 70 etanol içinde tutun. % 70 etanol ile çalışma alanı püskürtün.
  3. % 3 isofluorane-% 20 oksijen gaz karışımı ile bir anestezik vaporizatör kullanarak fare anestezisi. Debimetre ile oksijen miktarını ayarlayın. Parmak veya kuyruk pinching (tepkisiz) tarafından anestezi seviyesini test edin. % 2 (v / v) isofluorane ile anestezi seviyesini korumak.
  4. Farenin gözleri suni gözyaşları uygulayın ve cerrahi işlem sırasında gözün zarar görmesini önlemek için dikkatli kullanın. Lateral pozisyonda sağ tarafta fare yerleştirin.
  5. Tıraş, sol göz ve sol kulak hayvan kesme makineleri kullanarak taban arasındaki sol tarafındaki alanda. Betadin çözüm ve pamuk uçlu aplikatörler alan ve hafifçe ovuşturarak kullanarak% 70 etanol arasında değişen alan temizleyin. Gerektiği kadar tekrarlayın.
  6. 37 vücut ısısını korumak için bir rektal prob bağlı bir ısıtma yastığı ° C üzerinde fare yerleştirin. Mineral yağ kullanarak rektal prob yerleştirin.
  7. Mikroskop altında sağ tarafta fare konumunu ve bant ile sabitleyin. Bir gazlı bez sünger bir pencere kesin ve cerrahi alanı kapsayacak.

2. Cerrahi Prosedür ve MCA ligasyon

  1. Sol göz ve ince düz makas kullanılarak sol kulak tabanı arasındaki dikey bir kesi olun. Kavisli hemostat cerrahi alanında açık tutmak için kullanın.
  2. Yaylı makas kullanılarak temporal kas yatay bir kesi yapmak ve biraz forseps ile yavaşça çekerek kafatası temporal kas ayrı.
  3. Kavisli bir forseps ile çene kemiği tutarak bir 18G iğne kullanarak zigomatik ark ve squamosal kemiğin birleştiği küçük bir subtemporal kraniyotomi olun.
  4. MCA ile kafatası kemik rongeurs küçük parçalara kaldırarak Açığa. Zigomatik ark ve orbital içeriği bu işlem sırasında hasar olmamalıdır. Bu işlem sırasında doku aşırı kuruma oluşursa, pamuk uçlu aplikatörler ile steril PBS geçerlidir.
  5. Küçük damar cauterizer kullanarak MCA distal kısmının Arter.
  6. Temporal kas orijinal konumuna geri koyun ve 5-0 naylon sütür cerrahi kesi sitenizi kapatın.
  7. Anestezi durdurun ve rektal prob kaldırmak. 2. doz subkutan buprenorfin (0.05mg/kg) bir fare enjekte edilir. Bir ısıtma paneli ile 37 ° C tutuldu kafesine fare dön.
  8. Sonraki 24 saat süreyle herhangi bir rahatsızlık (iştah azalması / su tüketimi, hunched duruş, artan solunum, saç Pilo-dikilen) için fare yakından izlemek. 24 saat için buprenorfin subkutan her 3-5 saatlik bir ameliyat sonrası fare enjekte edilir. Bu dönemde kurtarma jel ile fare sağlayın.

3. TTC Boyama ve İnme Hacminin Belirlenmesi

  1. Ameliyat sonrası yirmi dört saat derin fare uyutmak transcardially fosfat% 4 TTC (w / v) kullanarak 15 dakika sonra 10 dakika için% 4 paraformaldehid çözüm için tamponlu salin (PBS) ile fare serpmek orta akış hızında mini peristaltik pompa. Beyin çıkarın ve bir gecede% 4 paraformaldehid çözüm içine yerleştirin.
  2. Beyin kesit bloğu içine yerleştirin. Beyin tıraş bıçakları kullanarak 1mm kalınlığında dilimler halinde dilimleyin.
  3. Milimetrenin ölçekli cetvel yanında dilimleri yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu bağlı bir dijital kamera kullanarak dilimleri Fotoğraf.
  4. Görüntü J Yazılım (http://rsbweb.nih.gov/ij/) kullanarak karşı sitenin toplam alanı ipsilateral sitesi olmayan enfarkte alan çıkarılarak vuruş alanını hesaplayınız. Atım hacmi dilimleri 22 kontur istifleme alanı hesaplayın.

4. Yol Görüntü J yazılım kullanımı

  1. Dosya menüsünde tıklayarak Görüntü J yazılım analiz edilecek görüntü dosyasını açın.
  2. Programında 'düz çizgi' sekmesini tıklayın. Cetvel üzerinde iki kenar boşlukları arasındaki düz bir çizgi çizin. 'Analiz' menüsünü tıklayın ve 'set ölçekli' seçeneğini seçin. 1 olarak bilinen mesafe, mm gibi uzunluk birimi ayarlayın.
  3. 'Freehand daire' sekmesini tıklayın. Kontralateral yarımkürede anahat bir daire çizin. 'Analiz' menüsünü tıklayın ve 'tedbir' seçeneğini seçin. Çizilen dairenin alanı gösteren hesaplama penceresi açılır.
  4. Ipsilateral hemisferde hariç inme (beyaz) alanı çevresinde başka bir daire çizin. Adım 4.3 'te belirtilen bölge ölçün. Yeni değeri hesaplama penceresine eklenecektir. 1. ve 2. değerler arasındaki fark, aşağıdaki formül olarak gösterilir infarkt alanında temsil eder.
  5. Adımları 4.2-4.4 tekrarlayarak her dilim vuruş alanını hesaplayınız. (ΣA n) her dilim hesaplanan inme alanının toplamı alın. Bu her dilim kalınlığı 1mm olduğu gerçeğini bilerek atım hacmi temsil eder.
    ΣA n x 1mm (her dilim kalınlığı) = Strok hacmi

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Fare kalıcı MCA ligasyonu ile elde infarktlar genellikle kortikal. Ancak, MCA lentikülostriat dal proksimalinde bağlandı ise subkortikal lezyonlar elde etmek mümkündür. MCA ligasyonu sonrası felç hacimleri, 10mm ³, 35mm ³ 19, 23 değişebilir. Inme hacimleri ise 23 20mm, 35mm ³ ³ arasında Filiano ark MRI görüntülerinden tespit Moyanova ark TTC boyama ile hesaplanan atım hacimlerine 19, 10mm, 22mm ³ ³ arasında. Belki ligasyon tam yerini ve inme hacimlerini ölçmek için kullanılan farklı yöntemler bu farklılıkların olası nedeni.

Şekil 1, vahşi tip C57/BL6 fare TTC boyanmış beyin 24 saat yazılan kalıcı MCA ligasyonu gösterilmiştir. İnme sitesi görünümü (Şekil 1A, B) beyaz. Şekil 1A ve B farklı açılardan infarkt sitesi göstermektedir. Şekil 2 (Şekil 2A-G) posterior anterior gelen TTC lekeli inme beynin 1mm kalınlığında dilimler gösterir. 24 saat ameliyat sonrası infarkt hacmi hesaplandı. Infarkt hacmi ~ 23mm ³.

Şekil 1
Şekil 1. İnme sitesi. AB Temsilciliği, TTC MCA ligasyonu sonrası tüm beyin görüntüleri, 24 saat boyandı. Beyaz alan infarkt temsil eder.

Şekil 2
Şekil 2. Temsilcisi sonuçları (A> G), TTC lekeli 1mm beyin bölümleri, 24 saat sonra MCAL. Dilimler posterior anterior hizalanır. Beyaz alan infarkt temsil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kalıcı MCA ligasyonu yöntemi yüksek tekrarlanabilir infarkt hacmi ve mevcut diğer yöntemlere göre artış post-operatif sağkalım oranları verir. Prosedürün kolay ve kısa bir süre (~ 30 dakika) daha pratik hale getirir. Bu yöntem yaygın olarak, hem de fare ve sıçanlar kullanılır.

Bu teknik bir stereomikroskop altında bir invaziv cerrahi gerektirir. Bu nedenle, bir mikroskop altında faaliyet gösteren ve başarılı bir kraniotomi mükemmelleştirmek tecrübesi çok önemlidir. Laboratuarda deneyler önce tutarlı infarktlar kurmak için en iyisidir. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için her zaman aynı yerde MCA Arter önemlidir. MCA subkortikal infarktlar istendiğinde dalları lentikülostriat proksimal bağlandı olmalıdır. Arter tamamen bağlandı ve oklüzyon kalıcıdır. Bu nedenle bu model, MCA ile reperfüzyon izin vermez. Bu gösteriye dahil olmamakla birlikte, arter ligasyonu doğrulamak için etkilenen bölgede kan akışını ölçmek için kullanılan bir doppler prob ise iyi.

Teşhir ve arter pıhtılaştırma sırasında operatör, hasar veya delinme MCA çok dikkatli olunmalıdır. Kraniotomi, elmacık kemiği herhangi bir zarar görmesini önlemek için kapsamlı bir bakım yapılmalıdır. Cerrahi alan infarkt alanında çok yakın olduğundan, kortikal yüzeye herhangi bir zarar kraniotomi veya koterizasyon sırasında kaçınılmalıdır. Bu gösteride kullanılan FST 18.000-00 FST 18.015-00 cateurizer birim ya da iki kutuplu bir cateurizer yerine kullanılabilir. FST 18.015-00 kullanıcı kortikal doku zarar engelleyebilir düşük ısı cauterizer ucunun sıcaklığını ayarlamak için izin verir. FST 18.015-00 da pille çalışan koterizasyon araçları görülen sıcaklık dalgalanmaları önler. Koterizasyon sırasında, kullanıcı oksijen akışını cauterizer dışarıda tutmak için çok dikkatli olmalı ve bir an için O 2 / isofluorane ateşleme riski önlemek için kapatıldı. Bu fare anestezi durumunu etkilemez. Bu riski önlemek için, biz yanı sıra, yeterli hava sirkülasyonu artırır havada herhangi bir fazla O 2 / isofluorane çekiyor cerrahi alana açılan bir havalandırma borusu kullanın .

Kalıcı MCA ligasyonu modeli iskemik inme eğitim son derece yararlı. Neuroprotectants testi veya transgenik fare modelleri üzerinde in vivo iskemi moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. In vivo yaklaşım bu kullanmak için bariz faydası, bu, iskemik hakaret iskemik hasar sonrası mevcut yöntemine işaret süreçlerine ek olarak intakt nöron ağları üzerinde çalışma ve davranışsal tepki sonrası hakaret, sağlar. Bu nedenle, bu in vivo inme modelinde iskemi, hücre kültürü taklit etmek için kullanılır yerinde modelleri için kritik bir tamamlayıcı bir yaklaşım sağlar .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Cerrahi teknik, başlangıçta, Medical College of Georgia Dr William D. Hill laboratuvarda elde edildi. Yazarlar ayrıca, Dr. David A. Rempe ve Landa Prifti diseksiyon kamera kullanımı için teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüsü, NS041744, NS051279, F31 NS064700 ve AHA 30815697D tarafından desteklenmiştir.

References

  1. Britton, M., Rafols, J., Alousi, S., Dunbar, J. C. The effects of middle cerebral artery occlusion on central nervous system apoptotic events in normal and diabetic rats. Int J Exp Diabesity Res. 4, 13-20 (2003).
  2. Ciceri, P., Rabuffetti, M., Monopoli, A., Nicosia, S. Production of leukotrienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat. Br J Pharmacol. 133, 1323-1329 (2001).
  3. Jin, K. Delayed transplantation of human neural precursor cells improves outcome from focal cerebral ischemia in aged rats. Aging Cell. 9, 1076-1083 (2010).
  4. McCaig, D. Evolution of GADD34 expression after focal cerebral ischaemia. Brain Res. 1034, 51-61 (2005).
  5. Shirotani, T., Shima, K., Chigasaki, H. In vivo studies of extracellular metabolites in the striatum after distal middle cerebral artery occlusion in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Stroke. 26, 878-884 (1995).
  6. Wu, Y. P., Tan, C. K., Ling, E. A. Expression of Fos-like immunoreactivity in the brain and spinal cord of rats following middle cerebral artery occlusion. Exp Brain Res. 115, 129-136 (1997).
  7. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
  8. Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
  9. Carswell, H. V. Genetic and gender influences on sensitivity to focal cerebral ischemia in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Hypertension. 33, 681-685 (1999).
  10. Mary, V., Wahl, F., Uzan, A., Stutzmann, J. M. Enoxaparin in experimental stroke: neuroprotection and therapeutic window of opportunity. Stroke. 32, 993-999 (2001).
  11. Menzies, S. A., Hoff, J. T., Betz, A. L. Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model. Neurosurgery. 31, 100-107 (1992).
  12. Iaci, J. F. Glial growth factor 2 promotes functional recovery with treatment initiated up to 7 days after permanent focal ischemic stroke. Neuropharmacology. 59, 640-649 (2010).
  13. Richard, M. J. P., Khan, B. V. C. B. J., Saleh, T. M. Cellular mechanisms by which lipoic acid confers protection during the early stages of cerebral ischemia: A possible role for calcium. Neuroscience Research. (2011).
  14. Heiss, W. D. Progressive derangement of periinfarct viable tissue in ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 193-203 (1992).
  15. Nedergaard, M., Gjedde, A., Diemer, N. H. Focal ischemia of the rat brain: autoradiographic determination of cerebral glucose utilization, glucose content, and blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 414-424 (1986).
  16. Nowicki, J. P., Assumel-Lurdin, C., Duverger, D., MacKenzie, E. T. Temporal evolution of regional energy metabolism following focal cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 462-473 (1988).
  17. Butcher, S. P., Bullock, R., Graham, D. I., McCulloch, J. Correlation between amino acid release and neuropathologic outcome in rat brain following middle cerebral artery occlusion. Stroke. 21, 1727-1733 (1990).
  18. Arlicot, N. Detection and quantification of remote microglial activation in rodent models of focal ischaemia using the TSPO radioligand CLINDE. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, 2371-2380 (2010).
  19. Moyanova, S. G. Protective role for type 4 metabotropic glutamate receptors against ischemic brain damage. J Cereb Blood Flow Metab. (2010).
  20. Ortolano, F. Advances in imaging of new targets for pharmacological intervention in stroke: real-time tracking of T-cells in the ischaemic brain. Br J Pharmacol. 159, 808-811 (2010).
  21. O'Neill, M. J., A, C. J. Rodent models of focal cerebral ischemia. Current Protocols in Neuroscience. 9.6.1-9.6.32 (2000).
  22. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  23. Filiano, A. J., Tucholski, J., Dolan, P. J., Colak, G., Johnson, G. V. Transglutaminase 2 protects against ischemic stroke. Neurobiol Dis. 39, 334-343 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics