Оптимизированная на основе ПЦР Выявление Mycoplasma

Biology
 

Summary

LookOut Mycoplasma ПЦР Kit используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая устанавливается как метод выбора при высокой чувствительности обнаружения микоплазма, Acholeplasma и Ureaplasma загрязнения в культурах клеток и других клеточных культур производным биологических препаратов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Обслуживание без загрязнения клеточных линий имеет важное значение для клеточных исследований. Среди крупнейших загрязнителей опасения микоплазмы загрязнения. Хотя микоплазмы обычно не убивают загрязненные клетки, их трудно обнаружить и может вызвать различные эффекты на культурах клеток, в том числе изменения метаболизма, замедление распространения и хромосомных аберраций. Короче говоря, микоплазмы загрязнения компромиссы стоимость этих клеточных линий в предоставлении точных данных для жизни научных исследований.

Источников загрязнения микоплазмы в лабораторных условиях очень сложно полностью контролировать. Поскольку некоторые микоплазмы виды встречаются на коже человека, они могут быть введены из-за плохого асептики. Кроме того, они могут прийти из загрязненных добавки, такие как эмбриональной телячьей сыворотки, и, самое главное из других загрязненных клеточных культурах. Как только микоплазмы загрязняет культуре, он может быстро распространиться на загрязнять других областях лаборатории. Строгое соблюдение надлежащей лабораторной практики, такие как хорошая асептики являются ключевыми, и регулярное тестирование на микоплазму настоятельно рекомендуется для успешной борьбы с микоплазмой загрязнения.

ПЦР-выявление микоплазмы стало очень популярным методом для текущего ремонта клеточной линии. ПЦР-методы обнаружения обладают высокой чувствительностью и может обеспечить быстрый результат, что позволяет исследователям быстро реагировать, чтобы изолировать и ликвидировать загрязнение, когда он будет обнаружен, по сравнению с Время, необходимое использованием микробиологических методов. LookOut Mycoplasma ПЦР Kit обладает высокой чувствительностью, с пределом обнаружения всего 2 геномов в мкл. Воспользовавшись весьма специфический JumpStart Taq ДНК-полимеразы и фирменным дизайном грунтовки, ложных срабатываний значительно снижается. Удобные 8-трубки формате, полоски предварительно покрытых дНТФ, и связанные с ними грунтовки позволяет увеличить пропускную способность удовлетворить потребности клиентов с большими коллекциями клеточных линий.

Учитывая крайнюю чувствительность комплект, большое внимание должны быть приняты для предотвращения случайного загрязнения образцов и реагентов. Шаг за шагом мы демонстрируем протокол подчеркивает меры предосторожности и практики, необходимых для надежного обнаружения микоплазм. Мы также показываем, и обсудить типичные результаты и их интерпретация. Наша цель заключается в обеспечении успеха исследователей, использующих LookOut Mycoplasma ПЦР Kit.

Protocol

1. Обнаружение Mycoplasma

  1. Супернатантах клеточных культур можно проверить прямо или образец может подготовленные для использования на более поздний срок. Для подготовки для дальнейшего использования месте 100 мкл надосадочной в стерильную пробирку усиления и инкубировать при температуре 95 ° С в течение 5 минут. После завершения этого образца можно хранить при температуре 2-8 ° С не более одной недели. Просто перед запуском центрифуги образец кратко (5 секунд) для осаждения любой сотовой мусора.
  2. Для подготовки образцов для ПЦР, определить общий объем Jumpstart Taq ДНК-полимеразы / регидратации буфера, который необходим для реакции. Мы будем готовить 5 всего реакций. Пять реакций потребует 2.5μl из Taq и 114.5μl регидратации буфера. Он будет содержать, как минимум, одну единицу Taq в реакцию и 22.5μl регидратации буфер на реакцию образца и отрицательного контроля плюс 24.5μl регидратации буфер для положительного контроля. 1 единица ДНК-полимеразы в реакции следует добавить соответствующий объем регидратации буфера. Это будет меняться с Taq используется.
  3. Место расчетный объем ДНК-полимеразы Taq в чистую пробирку микроцентрифужных и следовать с расчетным объемом регидратации буфера. ДНК-полимеразы / регидратации буфера следует смешивать аккуратно, щелкая трубки. Эта смесь не следует перемешать.
  4. Для подготовки отрицательного контроля и образцов использования прозрачных труб реакции представлены в комплекте. Реакция труб предусмотрено в комплекте уже содержат nuclueotides, грунтовки и внутренний контроль ДНК. 23 мкл Jumpstart Taq ДНК-полимераза / Регидратация буфера смеси, подготовленные на предыдущих этапах, должны быть размещены в каждом из отрицательного контроля и образцов труб. Добавить 2 мкл ДНК свободной воде отрицательного контроля и добавить 2 мкл образца к каждой из пробирок с образцами и этикетки. Перемешайте содержимое, щелкая труб. Содержание не следует перемешать.
  5. Для подготовки положительного контроля используют розовый труб реакции представлены в комплекте. Реакция труб предусмотрено в комплекте уже содержат nuclueotides, грунтовки и внутренний контроль ДНК. Добавьте 25 мкл Jumpstart Taq ДНК-полимеразы / Регидратация буфера микс, подготовленный на предыдущих этапах, чтобы реакция труб и этикетки. Перемешайте содержимое, щелкая труб. Содержание не следует перемешать. Инкубируйте отрицательного контроля, положительного контроля и пробирок с образцами при комнатной температуре в течение 5 минут.
  6. Для ПЦР состоится образцы должны быть помещены в термоциклер. При использовании JumpStart Taq активации шаг не требуется. Место реакции труб в термоциклер. Циклы должны быть установлены следующим образом: 94 ° С в течение 30 секунд, 55 ° С в течение 30 секунд и 72 ° С в течение 40 секунд. Эти циклы будут выполняться 40 раз.
  7. После ПЦР циклов завершили образцы должны быть охлаждены до 4-8 ° С, удаляя их из термоциклер и размещения их в лед. Когда образцы охлаждением они должны быть загружены на агарозном геле для электрофореза. Загрузка геля и красителя не являются необходимыми, поскольку они уже присутствуют в реакционной трубы. Непосредственно нагрузки 8 мкл каждого ПЦР в отдельную полосу движения. Стоп-электрофореза после миграции на 2,5 - 3,0 см.

2. Представитель Результаты

Отрицательный контроль должен показать полосы примерно 481 бп. Это можно увидеть в отрицательном колонки управления на гель-электрофореза, что показано в начале видео. Отсутствие отрицательной полосы контроля на 481 б.п. является хорошим показателем того, что активность полимеразы не sufficienttaq использовался недостаточно эффективны.

Mycoplasma положительных проб покажет полосы в диапазоне 270 ± 8 б.п.. Полоса будет тяжелым для сильно загрязненных проб и слабый для слегка загрязненных образцов. Вариации интенсивности можно увидеть в положительном колоннами образца на гель-электрофореза, что показано в начале видео. Все образцы содержат внутренний отрицательный контроль, чтобы продемонстрировать, что ПЦР произошло, как ожидалось. Это нормально, чтобы увидеть отсутствие внутреннего контроля на сильно загрязненные образцы.

Если нет полосы в положительном диапазоне или группы в отрицательном диапазоне на образец, это хороший показатель того, что ваши образцы запрещены. Если образец тормозится ПЦР ингибиторов могут быть удалены путем выполнения экстракции ДНК.

Рисунок 1
. Рисунок 1 Соответствующие полосы ампликона: Результаты обнаружения микоплазм методом ПЦР показаны. Переулок 2 является отрицательный контроль, который должен показать полосы примерно 481 бп. Отсутствие отрицательной полосы контроля на 481 б.п. является хорошим показателем того, что Taq использовался недостаточно эффективны. Mycoplasma-позитивных образцов покажет полосы в диапазоне 270 + 8 б.п., как показано на полосы 3 - 6. Полоса будет HEAиу для сильно загрязненных образцов (дорожка 6) и слабый для слегка загрязненных образцов (дорожка 4). Все образцы содержат внутренний отрицательный контроль (481 б.п.), чтобы продемонстрировать, что ПЦР произошло, как ожидалось. Это нормально, чтобы увидеть отсутствие внутреннего контроля на сильно загрязненные образцы.

Discussion

Из-за повышенной чувствительности комплект, когда они выполняются правильно комплект должны дать точные результаты, показывающие, действительно ли ваш образец микоплазмы загрязнения. Комплект был оптимизирован для использования с JumpStart Taq ДНК-полимеразы. Другие taqs могут быть использованы при подготовке образцов, но внутренняя группа контроля на 481 б.п. должны присутствовать, чтобы указать правильный чувствительность альтернативных Taq. Вполне возможно, для положительного полосы проявлять различной плотности в зависимости от уровня загрязнения. Это можно наблюдать отсутствие внутреннего контроля группы на сильно загрязненных проб. Использование осторожности и правильной технике при подготовке образцов для предотвращения загрязнения имеют решающее значение для правильной. Обнаружение при использовании LookOut Mycoplasma ПЦР Kit.

Disclosures

Авторы являются сотрудниками Sigma-Aldrich, что производится реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

Acknowledgements

Финансируемая Sigma-Aldrich

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics