Detecção otimizada baseados em PCR de Mycoplasma

Biology
 

Summary

O LookOut Mycoplasma Kit de Detecção de PCR utiliza a reação em cadeia da polimerase (PCR), que é estabelecido como o método de escolha para maior sensibilidade na detecção de contaminação por Mycoplasma, Acholeplasma e Ureaplasma em culturas de células e cultura de células derivadas outros produtos biológicos.

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Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

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Abstract

A manutenção de linhas livres de contaminação de células é essencial para a célula-base da pesquisa. Entre as maiores preocupações são a contaminação por micoplasma contaminante. Apesar de micoplasma geralmente não matar células contaminadas, elas são difíceis de detectar e pode causar uma variedade de efeitos sobre as células cultivadas, incluindo o metabolismo alterado, diminuiu a proliferação e aberrações cromossômicas. Em suma, a contaminação por micoplasma compromete o valor dessas linhas celulares em fornecer dados precisos para pesquisa de ciências biológicas.

As fontes de contaminação por micoplasma em laboratório são muito difíceis de controlar completamente. Como certas espécies de micoplasmas são encontradas na pele humana, eles podem ser introduzidas através de uma técnica asséptica pobres. Além disso, eles podem vir de suplementos contaminados, tais como soro fetal bovino, e mais importante de outras culturas de células contaminadas. Uma vez por micoplasma contamina uma cultura, ela pode se espalhar rapidamente para contaminar outras áreas do laboratório. Estrita adesão às práticas de laboratório, tais como a boa técnica asséptica são a chave, e testes de rotina para micoplasma é altamente recomendado para o sucesso do controle de contaminação por micoplasma.

PCR baseada em detecção de micoplasma tornou-se um método muito popular para manutenção de rotina de linha celular. Métodos baseados em PCR de detecção são muito sensíveis e pode fornecer resultados rápidos, o que permite aos pesquisadores responder rapidamente para isolar e eliminar a contaminação, uma vez que é detectada em comparação com o tempo necessário utilizando técnicas microbiológicas. O LookOut Mycoplasma Kit de Detecção de PCR é altamente sensível, com um limite de detecção de apenas 2 genomas por microlitro. Aproveitando-se da Polimerase DNA altamente específicas JumpStart Taq e um desenho de primers proprietário, falsos positivos são muito reduzidas. O formato de 8-tubo conveniente, tiras pré-revestida com dNTPs, primers e associado ajuda a aumentar o rendimento para satisfazer as necessidades dos clientes com maiores coleções de linhagens celulares.

Dada a extrema sensibilidade do kit, muito cuidado deve ser tomado para evitar a contaminação acidental das amostras e reagentes. O protocolo passo a passo, demonstramos destaca as precauções e práticas necessárias para a detecção de micoplasma confiável. Nós também mostrar e discutir os resultados típicos e sua interpretação. Nosso objetivo é garantir o sucesso de pesquisadores utilizando o Kit de Detecção de Mycoplasma LookOut PCR.

Protocol

1. Detecção de Mycoplasma

  1. Sobrenadantes de cultura de células pode ser testado diretamente ou se a amostra pode preparados para uso em uma data posterior. Para se preparar para uso posterior mL colocar 100 do sobrenadante em um tubo de amplificação estéril e incubar a 95 ° C por 5 minutos. Uma vez completada essa amostra pode ser armazenado a 2-8 ° C por até uma semana. Pouco antes de executar a centrifugação breve amostra (5 segundos) para pellet quaisquer detritos celulares.
  2. Para preparar as amostras para PCR, determinar o volume total de Jumpstart DNA polimerase Taq tampão / reidratação necessária para as reações. Estaremos preparando cinco reações total. Cinco reações exigirá 2.5μl de Taq e 114.5μl de tampão de reidratação. Isto irá conter um mínimo de uma unidade de Taq por reação e 22.5μl de tampão de reidratação por reação de amostra e controle negativo acrescido 24.5μl de tampão de reidratação para o controle positivo. 1 unidade de DNA polimerase por reação deve ser adicionado ao volume adequado de tampão de reidratação. Isso vai variar com o Taq usado.
  3. Coloque o volume calculado de Taq DNA polimerase em um tubo de microcentrífuga limpo e seguir com o volume calculado de tampão de reidratação. A DNA polimerase tampão / reidratação deve ser misturado delicadamente sacudindo o tubo. Essa mistura não deve ser agitadas.
  4. Para preparar o controle negativo e amostras de usar os tubos de reacção transparente fornecido no kit. Os tubos de reação fornecido no kit já contêm a nuclueotides, primers e DNA controle interno. 23 mL de Jumpstart Taq DNA polimerase mix de buffer / reidratação, elaborado nas etapas anteriores, deve ser colocado em cada um dos controle negativo e tubos de amostra. Adicionar 2 l da DNA água livre para o controle negativo e adicionar 2 mL da amostra para cada um dos tubos de amostra e etiqueta. Misture o conteúdo sacudindo os tubos. Conteúdos não devem ser agitadas.
  5. Para preparar o controlo positivo use os tubos de reacção rosa fornecido no kit. Os tubos de reação fornecido no kit já contêm a nuclueotides, primers e DNA controle interno. Adicionar 25 mL de Jumpstart Taq DNA polimerase mix de buffer / reidratação, elaborado nas etapas anteriores, para os tubos de reação e de etiqueta. Misture o conteúdo sacudindo os tubos. Conteúdos não devem ser agitadas. Incubar o controle negativo, controle positivo e tubos de amostras à temperatura ambiente por 5 minutos.
  6. Para a PCR para ocorrer as amostras precisam ser colocados em um termociclador. Ao usar JumpStart Taq uma etapa de ativação não é necessária. Coloque os tubos de reação no termociclador. Os ciclos deve ser definido da seguinte forma: 94 ° C por 30 segundos, 55 ° C por 30 segundos e 72 ° C por 40 segundos. Estes ciclos serão executados 40 vezes.
  7. Uma vez que os ciclos de PCR ter concluído as amostras devem ser resfriado a 4-8 ° C, removendo-os do termociclador e colocá-los no gelo. Quando as amostras terem arrefecido devem ser carregados em gel de agarose para eletroforese. Carregando gel e tintura não são necessários uma vez que já estão presentes nos tubos de reação. Diretamente carga de 8 mL para cada PCR em uma faixa separada. Parar a eletroforese após a migração de 2,5-3,0 cm.

2. Resultados representante

O controle negativo deverá mostrar uma banda em aproximadamente 481 pb. Isto pode ser visto na coluna de controle negativo na eletroforese em gel que é mostrado no início do vídeo. A ausência da banda de controlo negativo em 481 pb é um bom indicador de que a atividade da polimerase não foi sufficienttaq utilizado não foi sensível o suficiente.

Mycoplasma amostras positivas mostrarão bandas na faixa de 270 ± 8 pb. A banda vai ser pesado para amostras altamente contaminadas e fraco para amostras levemente contaminados. As variações na intensidade pode ser visto nas colunas amostra positiva no gel de eletroforese que é mostrado no início do vídeo. Todas as amostras contêm um controle interno negativo para demonstrar que a PCR ocorreu como esperado. É normal ver a ausência do controle interno em amostras altamente contaminadas.

Se não houver uma banda na faixa positiva ou uma banda na faixa de negativo em sua amostra este é um bom indicador de que as amostras são inibidas. Se a amostra for inibido os inibidores da PCR pode ser removido através da realização de uma extração de DNA.

Figura 1
. Figura 1 bandas Amplicon relevantes: Resultados de detecção de micoplasmas por PCR são mostrados. Faixa 2 é o controle negativo, que deve mostrar uma banda em aproximadamente 481 pb. A ausência da banda de controlo negativo em 481 pb é um bom indicador de que a usada taq não foi sensível o suficiente. Mycoplasma amostras positivas mostrarão bandas na faixa de 270 pb + 8 como mostrado em faixas 3-6. A banda será heavy para amostras altamente contaminadas (faixa 6) e fraca para as amostras levemente contaminados (faixa 4). Todas as amostras contêm um controle interno negativo (481 bp) para demonstrar que a PCR ocorreu como esperado. É normal ver a ausência do controle interno em amostras altamente contaminadas.

Discussion

Devido à extrema sensibilidade do kit, quando realizada corretamente o kit devem produzir resultados precisos indicando se ou não a sua amostra tem contaminação por micoplasma. O kit foi otimizado para uso com JumpStart Taq DNA polimerase. Taqs outros podem ser usados ​​quando preparar as amostras, mas a banda de controlo interno a 481 bp deve estar presente para indicar a sensibilidade adequada do taq alternativa. É possível para as bandas positivas para expor várias densidades, dependendo do nível de contaminação. É possível observar a ausência da banda de controlo interno em amostras contaminadas. Usando cautela e boa técnica ao preparar as amostras para evitar a contaminação são cruciais para a adequada. detecção ao usar o Kit de Detecção de Mycoplasma LookOut PCR.

Disclosures

Os autores são funcionários da Sigma-Aldrich, que produziu os reagentes e as ferramentas usadas neste artigo.

Acknowledgements

Financiado pela Sigma-Aldrich

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

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References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

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