Optimisé basé sur la PCR Détection de Mycoplasma

Biology
 

Summary

Le kit de détection par PCR LookOut Mycoplasma utilise la réaction en chaîne polymérase (PCR), qui est établi que la méthode de choix pour plus de sensibilité dans la détection de la contamination par Mycoplasma, Acholeplasma et Ureaplasma dans des cultures cellulaires et de culture de cellules dérivées d'autres produits biologiques.

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Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

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Abstract

L'entretien de lignées de cellules sans contamination est essentiel à la cellule de base de la recherche. Parmi les préoccupations les plus importantes de contaminants sont contamination par des mycoplasmes. Bien que les mycoplasmes ne sont généralement pas tuer les cellules contaminées, elles sont difficiles à détecter et peuvent causer une variété d'effets sur les cellules cultivées, y compris le métabolisme modifié, a ralenti la prolifération et des aberrations chromosomiques. En bref, contamination par des mycoplasmes compromet la valeur de ces lignées cellulaires en fournissant des données précises pour la recherche en sciences de vie.

Les sources de contamination par des mycoplasmes dans le laboratoire sont très difficiles à contrôler complètement. Comme certaines espèces de mycoplasmes sont trouvés sur la peau humaine, ils peuvent être introduits par une technique aseptique pauvres. En outre, ils peuvent provenir de compléments contaminés tels que le sérum de veau foetal, et surtout à partir d'autres cultures de cellules contaminées. Une fois que les mycoplasmes contamine une culture, il peut se propager rapidement à contaminer d'autres régions du laboratoire. Le strict respect bonnes pratiques de laboratoire telles que de bonnes techniques d'asepsie sont la clé, et les tests de routine pour le mycoplasme est fortement recommandé pour le contrôle réussie de contamination par des mycoplasmes.

Basées sur la PCR de détection des mycoplasmes est devenue une méthode très populaire pour l'entretien de lignée cellulaire de routine. Méthodes de détection basées sur la PCR sont très sensibles et peuvent fournir des résultats rapides, ce qui permet aux chercheurs de répondre rapidement à isoler et à éliminer la contamination une fois qu'il est détecté par rapport à la durée nécessaire en utilisant des techniques microbiologiques. Le kit de détection par PCR LookOut Mycoplasma est très sensible, avec une limite de détection de seulement 2 génomes par ul. Profitant de la polymérase très spécifiques JumpStart Taq ADN et une conception d'amorce de propriété, les faux positifs sont considérablement réduits. La pratique de 8 tubes de format, des bandes pré-enduites de dNTP et amorces associé contribue à augmenter le débit pour répondre aux besoins des clients avec de plus grandes collections de lignées cellulaires.

Compte tenu de l'extrême sensibilité de la trousse, le plus grand soin doit être pris pour prévenir la contamination accidentelle des échantillons et des réactifs. Le protocole étape par étape, nous démontrons souligne les précautions et les pratiques nécessaires pour la détection de mycoplasmes fiable. Nous montrons aussi et discuter des résultats typiques et leur interprétation. Notre objectif est d'assurer la réussite des chercheurs utilisant le kit de détection de Mycoplasma LookOut PCR.

Protocol

1. Détection de Mycoplasma

  1. Surnageants de culture cellulaire peuvent être testés directement ou de l'échantillon peut préparés pour être utilisés à une date ultérieure. Afin de préparer pour une utilisation ultérieure placer 100 pi de surnageant dans un tube d'amplification stérile et incuber à 95 ° C pendant 5 minutes. Une fois cette opération terminée, l'échantillon peut être conservé à 2-8 ° C pendant jusqu'à une semaine. Juste avant l'exécution de l'échantillon de centrifuger brièvement (5 secondes) pour culotter les débris cellulaires.
  2. Pour préparer les échantillons pour la PCR, de déterminer le volume total de l'ADN polymérase Taq Jumpstart / réhydratation tampon nécessaire pour les réactions. Nous allons préparer 5 réactions total. Cinq réactions, il faudra 2.5μl de Taq et 114.5μl de tampon de réhydratation. Celui-ci contiendra un minimum d'une unité de Taq par réaction et 22.5μl de tampon de réhydratation par réaction de l'échantillon et de contrôle négatif, plus de tampon de réhydratation 24.5μl pour le contrôle positif. 1 unité de la polymérase ADN par réaction doit être ajouté au volume approprié de tampon de réhydratation. Cela varie avec la Taq utilisé.
  3. Placez le volume calculé de Taq ADN polymérase dans un microtube propre et suivre avec le volume calculé de tampon de réhydratation. L'ADN polymérase / réhydratation tampon doit être mélangée doucement en tapotant le tube. Ce mélange ne doit pas être un vortex.
  4. Pour préparer le contrôle négatif et l'utilisation des échantillons des tubes de réaction transparente fournie dans le kit. Les tubes de réaction fourni dans le kit contiennent déjà les nuclueotides, amorces et l'ADN de contrôle interne. 23 pl d'ADN Jumpstart tampon Taq polymérase mélanger / réhydratation, tel que préparé dans les étapes précédentes, doit être placé dans chacun des témoins négatifs et des tubes d'échantillons. Ajouter 2 ul d'ADN d'eau libre pour le contrôle négatif et ajouter 2 pl de l'échantillon de chacun des tubes d'échantillon et l'étiquette. Mélangez le contenu en feuilletant les tubes. Contenu ne doit pas être un vortex.
  5. Pour préparer le contrôle positif utiliser les tubes de réaction roses fourni dans le kit. Les tubes de réaction fourni dans le kit contiennent déjà les nuclueotides, amorces et l'ADN de contrôle interne. Ajouter 25 ul d'ADN Jumpstart mélange de Taq polymérase tampon / réhydratation, tel que préparé dans les étapes précédentes, pour les tubes de réaction et l'étiquette. Mélangez le contenu en feuilletant les tubes. Contenu ne doit pas être un vortex. Incuber le contrôle négatif, contrôle positif et les tubes d'échantillon à température ambiante pendant 5 minutes.
  6. Pour la PCR qui aura lieu les échantillons doivent être placés dans un thermocycleur. Lorsque vous utilisez JumpStart Taq une étape d'activation n'est pas nécessaire. Placer les tubes de réaction dans le thermocycleur. Les cycles doivent être définis comme suit: 94 ° C pendant 30 secondes, 55 ° C pendant 30 secondes et 72 ° C pendant 40 secondes. Ces cycles se dérouleront de 40 fois.
  7. Une fois les cycles de PCR ont terminé les échantillons doivent être refroidis à 4-8 ° C en les retirant du cycleur thermique et de les placer dans la glace. Lorsque les échantillons sont refroidis, ils doivent être chargés sur le gel d'agarose pour électrophorèse. Gel de chargement et de colorants ne sont pas nécessaires car ils sont déjà présents dans les tubes de réaction. Directement charge de 8 ul pour chaque PCR dans un couloir distinct. Arrêtez l'électrophorèse après la migration de 2,5 - 3,0 cm.

2. Les résultats représentatifs

Le contrôle négatif doit montrer une bande à environ 481 pb. Ceci peut être vu dans la colonne de contrôle négatif sur le gel d'électrophorèse qui est montré au début de la vidéo. L'absence de la bande de contrôle négatif à 481 pb est un bon indicateur que l'activité de la polymérase n'a pas été utilisé sufficienttaq n'était pas assez sensible.

Mycoplasma échantillons positifs indique les bandes dans la gamme de 270 ± 8 pb. Le groupe sera lourde pour les échantillons fortement contaminés et faible pour les échantillons légèrement contaminé. Les variations de l'intensité peut être vu dans les colonnes de l'échantillon positif sur le gel d'électrophorèse qui est montré au début de la vidéo. Tous les échantillons contiennent un contrôle interne négative de démontrer que le PCR s'est produite comme prévu. Il est normal de voir l'absence de contrôle interne sur des échantillons hautement contaminés.

S'il n'ya pas une bande dans la gamme positive ou une bande dans la gamme négatif sur votre échantillon ceci est un bon indicateur que vos échantillons sont inhibés. Si l'échantillon est inhibé les inhibiteurs de la PCR peut être enlevée en effectuant une extraction d'ADN.

Figure 1
Bandes de la figure 1 Amplicon pertinents:. Résultats de la détection des mycoplasmes par PCR sont représentées. Voie 2 est le contrôle négatif, qui devrait montrer une bande à environ 481 pb. L'absence de la bande de contrôle négatif à 481 pb est un bon indicateur que la Taq utilisé n'était pas assez sensible. Mycoplasma échantillons positifs indique les bandes dans la gamme de 270 + 8 pb, comme indiqué dans les couloirs 3 - 6. Le groupe sera HEAvy pour les échantillons fortement contaminés (piste 6) et faible pour les échantillons légèrement pollués (piste 4). Tous les échantillons contiennent un contrôle interne négative (481 pb) pour démontrer que le PCR s'est produite comme prévu. Il est normal de voir l'absence de contrôle interne sur des échantillons hautement contaminés.

Discussion

En raison de l'extrême sensibilité de la trousse, lorsqu'il est effectué correctement le kit devrait donner des résultats précis indiquant si oui ou non votre échantillon a contamination par des mycoplasmes. Le kit a été optimisé pour une utilisation avec la polymérase Taq ADN JumpStart. Taqs autres peuvent être utilisés lors de la préparation des échantillons, mais la bande de contrôle interne à 481 pb devrait être présent pour indiquer la sensibilité propre de l'alternative Taq. Il est possible pour les bandes positives pour exposer différentes densités en fonction du niveau de contamination. Il est possible d'observer l'absence de la bande de contrôle interne sur des échantillons fortement contaminés. En utilisant la prudence et la bonne technique pour préparer les échantillons pour prévenir la contamination sont cruciales pour bon. de détection en utilisant le kit de détection de Mycoplasma LookOut PCR.

Disclosures

Les auteurs sont des employés de Sigma-Aldrich qui a produit les réactifs et les outils utilisés dans cet article.

Acknowledgements

Financé par Sigma-Aldrich

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

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References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

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