Técnicas de laboratorio asépticas: Métodos de Revestimiento

Biology
 

Summary

Cuando se trabaja con medios y reactivos utilizados para los microorganismos de cultivo, una técnica aséptica debe ser practicada para asegurar la contaminación se minimiza. Una variedad de métodos de enchapado se utilizan habitualmente para aislar, propagar, o bacterias enumerar y fagos, todos los cuales incorporan procedimientos que mantienen la esterilidad de materiales experimentales.

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Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064, doi:10.3791/3064 (2012).

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Abstract

Los microorganismos están presentes en todas las superficies inanimadas creando fuentes ubicuos de posible contaminación en el laboratorio. Experimental éxito depende de la capacidad de un científico para esterilizar las superficies de trabajo y equipos, así como evitar el contacto de los instrumentos y soluciones estériles con superficies no estériles. A continuación les presentamos los pasos a seguir para varios métodos de galvanoplastia usados ​​rutinariamente en el laboratorio para aislar, propagar, o enumerar los microorganismos como las bacterias y fagos. Los cinco métodos incorporar una técnica aséptica, o procedimientos que mantienen la esterilidad de materiales experimentales. Los procedimientos descritos incluyen (1) planchas de rayas cultivos bacterianos para aislar colonias individuales, (2) verter planchas-y (3) difusión de galvanoplastia para enumerar las colonias de bacterias viables, (4) superposiciones de agar blando para aislar fagos y placas de enumerar, y ( 5) réplica de galvanoplastia para transferir las células de una placa a otra en un patrón espacial idéntica. Estos procedimientos se pueden realizar en el instante tque banco de laboratorio, siempre que implican cepas no patógenas de microorganismos (Nivel de Bioseguridad 1, BSL-1). Si se trabaja con organismos BSL-2, a continuación, estas manipulaciones debe tener lugar en un gabinete de bioseguridad. Consulte la edición más actual de la Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos (BMBL), así como las Hojas de Datos de Seguridad (MSDS) para sustancias infecciosas para determinar la clasificación de riesgo biológico, así como las medidas de seguridad e instalaciones de contención necesarios para el microorganismo en cuestión. Cepas bacterianas y las poblaciones de fagos se pueden obtener de los investigadores de investigación, empresas y colecciones mantenidas por organizaciones particulares, tales como la American Type Culture Collection (ATCC). Se recomienda que no patógenas cepas se utiliza cuando el aprendizaje de las diferentes métodos de enchapado. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los estudiantes deben ser capaces de:

  • Realizar procedimientos de planchas sin contaminating los medios de comunicación.
  • Aislar un solo colonias de bacterias por el método de rayas placas.
  • Utilizar métodos de vertido de placas y propagación deposición electrolítica para determinar la concentración de bacterias.
  • Realizar superposiciones agar blando cuando se trabaja con fagos.
  • Transferencia de células bacterianas de una placa a otra mediante el procedimiento de réplica de galvanoplastia.
  • Dada una tarea experimental, seleccione la técnica de siembra adecuada.

Protocol

1. Prepare un área de trabajo segura y estéril

  1. Estar familiarizado con todas las reglas de laboratorio y medidas de seguridad que se deben tomar cuando se trabaja con microorganismos. Independientemente de la clasificación de riesgo biológico, todos los materiales que entran en contacto con los microorganismos se consideran residuos infecciosos y deben ser descontaminados antes de su eliminación. Siga las pautas de seguridad, de conformidad con los proporcionados por la salud institucional del medio ambiente y los departamentos de seguridad, la creación de recipientes adecuados de residuos para su eliminación inmediata y adecuada de los materiales potencialmente contaminados (riesgos biológicos).
  2. Esterilice todos los instrumentos, las soluciones y los medios de comunicación antes de su uso para los procedimientos de galvanoplastia.
  3. A retirar todos los materiales que saturan su área de trabajo en el banco de laboratorio.
  4. Limpie el área de trabajo con un desinfectante para reducir al mínimo la posible contaminación.
  5. Establecer un mechero de Bunsen y trabajar lentamente, con cuidado, y deliberadamente dentro del área de campo estéril creada por el updrapie de la llama.
    • Si se trabaja con organismos BSL-2, configurar su espacio de trabajo en un gabinete de bioseguridad. Un quemador Bunsen no se puede utilizar dentro del armario porque el calor de la llama interrumpe el flujo de aire esencial para su funcionalidad.
  6. Organizar todos los suministros necesarios para el procedimiento en el banco de laboratorio, cerca del campo estéril. Asegúrese de que todos los materiales estén debidamente etiquetados. Organizar el área de trabajo para maximizar la eficiencia en el trabajo y evitar movimientos innecesarios reducirá al mínimo el tiempo de exposición de materiales experimentales a contaminantes en el aire.
    • Coloque el mechero de Bunsen a la derecha en el banco.
    • Colocar las placas de agar o placas de Petri de la izquierda.
    • Organizar cultivos celulares, tubos, frascos y botellas en el centro de la banca.
    • Afloje las tapas de los tubos, frascos y botellas por lo que se puede abrir fácilmente con una mano durante las manipulaciones posteriores.
  7. Lávese bien las manos con jabón antiséptico y cálidoel agua antes de manipular los microorganismos.

2. Streak Procedimiento de la placa: El aislamiento de las colonias bacterianas mediante el método cuadrante

El procedimiento racha de la placa está diseñada para aislar cultivos puros de bacterias, o colonias, de las poblaciones mixtas de la separación mecánica simple. Las colonias individuales se componen de millones de células que crecen en un grupo en o dentro de una placa de agar (Figura 1). Una colonia, a diferencia de una sola célula, es visible para el ojo desnudo. En teoría, todas las celdas de una colonia se derivan de una sola bacteria inicialmente depositado sobre la placa y por lo tanto se conocen como un clon, o grupo de células genéticamente idénticos.

  • Las bacterias existen en una variedad de formas y tamaños. Por ejemplo, las células individuales de Escherichia coli son en forma de varilla con una longitud media de 2 micras y anchura de 0,5 micras, mientras que las células de Streptococcus son esféricas con un diámetro medio de 1 micra. Algunas bacterias (such como E. coli) existen como células individuales, mientras que otros forman distintos patrones de asociación. Streptococcus, por ejemplo, crecen en pares o cadenas de formulario o grupos de células. En general se supone que una sola colonia surge de una sola célula sometido a fisión binaria, sin embargo, este supuesto no es cierto para las bacterias que naturalmente existen como pares, cadenas, o grupos o que se dividen por otros mecanismos. Alternativamente, si las bacterias son demasiados chapado, a continuación, se solapan de las células puede ocurrir y aumentar la probabilidad de que dos o más bacterias que dan lugar a lo que parece ser una sola colonia. Para evitar estas complicaciones al describir o enumerar cultivos bacterianos que crecen en un medio sólido, las colonias se conocen como unidades formadoras de colonias (ufc).

Con el procedimiento de rayas placa, una mezcla de células se extiende sobre la superficie de un semi-sólido, basado en agar medio nutriente en una placa de Petri de tal manera que cada vez menos bacterianaLas células se depositan en los puntos ampliamente separados sobre la superficie del medio y, tras la incubación, se desarrollan en colonias. El método de cuadrante para aislar colonias individuales de una mezcla de células se describen aquí.

  1. Raya de galvanoplastia se puede lograr con una serie de instrumentos diferentes (Figura 2). Un bucle de metal se puede volver a utilizar varias veces y se utiliza para las cepas de enchapado rayas de laboratorio de rutina. Desechables de plástico bucles están disponibles comercialmente y se utilizan con más frecuencia cuando se trabaja con BSL-2 cepas en un gabinete de Seguridad de la Biotecnología. Muchos científicos de investigación prefieren usar desechables, pre-esterilizados palos de madera o palillos de dientes planos para la racha de galvanoplastia. Se trata de una alternativa económica a los bucles de plástico desechables y puede ser especialmente útil cuando se trabaja con una muestra del medio ambiente tales como el suelo que probablemente contiene bacterias formadoras de esporas.
    • Desechables pre-esterilizados palos y palillos de dientes no tiene por qué ser flameado con el jue mechero de Bunsens la prevención de aerosolización innecesaria de bacterias formadoras de esporas y la contaminación cruzada de las superficies de laboratorio o las placas de agar con las esporas.
  2. Etiqueta alrededor del borde de la parte inferior (no la tapa) de una placa de agar con por lo menos su nombre, la fecha, el tipo de medio de crecimiento, y el tipo de organismo que se sembraron en el medio.
    • Las placas debe estar completamente seco sin condensación en la tapa y pre-calentado a la temperatura ambiente antes de la raya de galvanoplastia. Si las placas se almacenan a 4 ° C, eliminarlos varias horas o incluso el día antes. Corre a cabo en pequeños montones, se tambaleó de no más de 2-3 platos y déjelos secar.
  3. La muestra de la que se raya la placa inoculada podría ser o bien una suspensión de células en caldo o una colonia existente de otra placa de agar. Para empezar, se recomienda que sólo una muestra se utilizó para inocular una placa única. Para ahorrar tiempo y materiales, una sola placa puede ser utilizado para múltiples SAMPles pero sólo una vez que lleguen a dominar en las rayas de una muestra en un plato.
  4. Para el primer cuadrante, la muestra se recogió y se extienden por aproximadamente una cuarta parte de la superficie del medio utilizando una rápida, suave, atrás y hacia adelante de movimiento (Grupo A de la Figura 3). Levante la parte inferior de un plato invertido desde el banquillo. Mueva el bucle, palo, o un palillo de ida y vuelta muchas veces a través de la superficie de agar de la llanta hasta el centro de la placa.
    • Si el inóculo es una suspensión de células, obtener un asa con un bucle de metal o de 5 a 10 l con una micropipeta. Asegúrese de remolino o vórtice de la suspensión celular antes de retirar una alícuota para la siembra. Utilizar una técnica aséptica al realizar este paso, no sólo la llama de bucle, sino también el borde de la botella o tubo antes y después de retirar el inóculo. Además, no toque los lados del tubo o la botella con el lazo o el cañón de la micropipeta. Si pipetear el inóculo, prescindir de la suspensión de células en el appropriate lugar en la placa a continuación, utilizar un bucle, un palo o palillo para extenderse sobre el primer cuadrante de la placa.
    • Si el inóculo es una colonia de otra placa, toque suavemente la colonia con el bucle, palo o un palillo luego se extendió sobre el primer cuadrante de la placa. Asegúrese de que el aro de metal se enfría antes de tocar la colonia. Para asegurar el bucle no está demasiado caliente, lo toca suavemente sobre la placa de agar en un área designada donde no se produzcan rayas. Sólo unas pocas células se necesitan de la colonia, no toda la colonia.
    • Si se utiliza un bucle de metal, la llama se utiliza un mechero Bunsen antes de obtener el inóculo para la placa (panel B de la Figura 3). Empezar aproximadamente 3-4 pulgadas desde el bucle, con el alambre en la punta del cono azul, la parte más caliente de la llama. El metal debe ser al rojo vivo. Mueva el alambre de modo que la llama se aproxima al bucle. Esta manipulación evita la aerosolización de las bacterias que quedan en el circuito de la utilización anterior.
    • Flaming mata albacterias (aunque no las esporas) y de las corrientes de convección del aire caliente prevenir otros contaminantes en el aire se depositen en el alambre de metal durante las manipulaciones posteriores.
    • Si se utiliza un palillo de dientes estéril plana, mantenga el extremo más estrecho suavemente entre el pulgar y el dedo anular en un ángulo de 10 ° a 20 para el medio, y use el extremo gran racha de los cuadrantes. Si se utiliza un bucle o varilla de madera, se mantenga como un lápiz en el mismo ángulo. No presione tan fuerte que el lazo de las excavaciones, un palo o palillo de dientes en el agar.
  5. Después de completar el primer cuadrante, invertir y establecer en la parte posterior la placa en la tapa en el banquillo. Deseche el palo o un palillo o volver a la llama el lazo de metal, como se describe en el paso # 4.
  6. Gire la placa de Petri de 90 ° a la raya el segundo cuadrante. Levante la mitad inferior de una placa invertida desde el banco luego toca el bucle, palo o palillo para el primer cuadrante cerca del final de la raya pasado. Uso de la parte de atrás-adelante y hacia atrás patrón, cruzar la last medio de las rayas en el primer cuadrante a continuación, entrar en el segundo cuadrante vacío. Invertir y dejó la placa trasera en la tapa en el banco una vez que el segundo cuadrante se llena.
    • El lazo, un palo o palillo de dientes nunca deben volver a entrar en la primera mitad de las rayas en el primer cuadrante donde la mayor parte del inóculo original se depositó.
    • Un nuevo bucle de plástico, varilla de madera o palillo de dientes debe ser utilizado para cada cuadrante.
  7. Repita el paso # 6 dos veces para los cuadrantes tercero y cuarto.
    • Asegúrese de disponer de la varilla o palillo de dientes o volver a la llama el lazo de metal entre cada cuadrante.
    • Evite entrar en el primer cuadrante cuando empiezan a rayar el cuarto cuadrante.
  8. Se incuba la placa boca abajo para que la condensación que se acumula en la tapa no gotea sobre las colonias.

3. Vierta el procedimiento de la placa: Enumeración de las células bacterianas en una muestra mixta

Este método es a menudo utilizard para contar el número de microorganismos en una muestra mixta, que se añade a un medio de agar fundido antes de su solidificación. Los resultados del proceso en colonias distribuidas uniformemente por todo el medio sólido cuando la dilución de la muestra apropiada está chapada. Esta técnica se utiliza para realizar recuentos viables de placa, en las que se enumeran en el número total de unidades formadoras de colonias en el agar y en la superficie del agar en una sola placa. Recuentos viables placa proporcionar a los científicos un medio normalizado para generar curvas de crecimiento, para calcular la concentración de células en el tubo desde el que se sembró la muestra, y para investigar el efecto de diversos ambientes o condiciones de crecimiento sobre la supervivencia de células bacterianas o tasa de crecimiento.

  1. Etiqueta alrededor del borde de la parte inferior (no la tapa) de una placa de Petri estéril vacía pero con al menos su nombre, la fecha, el tipo de medio de crecimiento, y el tipo de organismo que se añade al medio de agar fundido.
    • Incluir el factor de dilución, si platIng diluciones seriadas, o una serie de diluciones repetidas, lo cual resulta en una reducción sistemática de la concentración de células en la muestra. Preparación de diluciones seriadas es necesario si el número de células en la muestra excede la capacidad de la placa de agar, en el que el rango estadísticamente significativo es 30 a 300 ufc. Si hay más de 300 ufc en un plato, a continuación, las colonias se aglomera y la superposición.
  2. Obtener un tubo que contiene 18 ml de medio de agar fundido.
    • El medio de agar debe ser dispensado en tubos de ensayo y pre-esterilizado en un autoclave. En el mismo día que se necesita para un experimento, el agar debe ser fundido en un vaporizador durante 30 minutos y luego transferidos a un baño de 55 ° C el agua. Sólo agar tanto como es necesario para el experimento debe ser fundido, ya que no se puede volver a utilizarse.
    • Diez minutos antes de verter las placas, los tubos de agar fundido debe ser transferida desde el 55 ° C baño de agua a un bloque de calor en el trabajobanco exploratorios fijado en 48 ° C. Una vez que el agar alcanza esta temperatura, está listo para verter. Si el agar es demasiado caliente, las bacterias en la muestra pueden ser asesinados. Si el agar es demasiado frío, el medio puede ser grumosa una vez solidificado.
  3. Obtener la muestra, que debe ser o bien un caldo de cultivo o una suspensión de células producidas por las células de mezcla de una colonia en tampón o solución salina.
    • Las muestras se pueden derivar de una serie de diluciones de una sola muestra.
    • Volumen de muestra que se sembraron debe estar entre 0,1 y 1,0 ml.
  4. Abrir la tapa de la placa de Petri vacía, y dispensar la muestra en el centro de la placa (panel A de la Figura 4). Cierre la tapa.
    • Utilice una técnica aséptica durante todo este procedimiento.
    • Utilice una pipeta serológica o micropipeta para transferir la muestra a la placa. Controlar el flujo de la muestra para que no salpique fuera de la placa.
  5. Retire el tapón de la bañerae del agar derretido, y pasar el borde del tubo abierto a través de la llama del mechero Bunsen.
  6. Abra la tapa de la caja de Petri que contiene la muestra y verter el agar en el cuidado (Grupo B de la Figura 4). Cerrar la tapa luego mezclar la muestra con el agar girando suavemente la placa.
  7. Permitir el agar para solidificar completamente antes de invertir la placa para la incubación.

4. Spread Procedimiento de la placa: La formación de colonias bacterianas discretos para los recuentos en placa, Enriquecimiento, selección o cribado

Esta técnica se utiliza típicamente para los microorganismos separados contenidas dentro de un pequeño volumen de muestra, que se extiende sobre la superficie de una placa de agar, lo que resulta en la formación de colonias discretas distribuidas uniformemente a través de la superficie del agar cuando la concentración apropiada de las células se sembraron. Además de utilizar esta técnica para recuentos de placas viables, en el que el número total de unidades formadoras de colonias en un cantoLe placa se enumera y se utiliza para calcular la concentración de células en el tubo desde el que se sembró la muestra, la propagación de galvanoplastia se utiliza rutinariamente en experimentos de enriquecimiento, la selección y detección. El resultado deseado para estos tres experimentos es generalmente el mismo que para los recuentos de placas, en la que una distribución de colonias discretas forman sobre la superficie del agar. Sin embargo, el objetivo no es asegurar que todas las células viables formar colonias. En su lugar, sólo aquellas células dentro de una población que tienen un genotipo particular deben crecer. El procedimiento de placa de propagación puede ser empleado en la técnica de placa de vertido para un experimento enumeración si el objetivo final es aislar colonias para su posterior análisis, porque las colonias crecen accesible sobre la superficie del agar, mientras que se incrustan en el agar con el procedimiento de placa de vertido.

Hay dos estrategias descritas aquí para el procedimiento de la placa de propagación. La primera (Método A) implica el uso de una plataforma giratoria y de vidrio o de metal de transbordod la forma de un palo de hockey. El segundo (Método B), referido como el "Método de Copacabana", implica agitación pre-esterilizados perlas de vidrio. Tanto facilitar aún propagación de las células a través de la superficie del agar.

Método A: Propagación de galvanoplastia con un plato giratorio y el vidrio o barra de metal

  1. Etiqueta alrededor del borde de la parte inferior (no la tapa) de una placa de agar con por lo menos su nombre, la fecha, el tipo de medio de crecimiento, y el tipo de organismo que se sembraron en el medio.
    • Incluir el factor de dilución, si plaqueo de diluciones.
    • Las placas debe estar completamente seco sin condensación en la tapa y pre-calentado a la temperatura ambiente antes de la propagación de galvanoplastia. Si las placas se almacenan a 4 ° C, eliminarlos varias horas o incluso el día antes. Corre a cabo en pequeños montones, se tambaleó de no más de 2-3 platos y déjelos secar.
  2. Centro de la placa sobre la mesa giratoria (Figura 5).
  3. Obtener quemuestra r, que debería ser un caldo de cultivo o una suspensión de células producidas por las células de mezcla de una colonia en tampón o solución salina.
    • Las muestras se pueden derivar de una serie de diluciones de una sola muestra.
    • Volumen de muestra que se sembraron debe estar entre 0,1 y 0,2 ml.
  4. Abrir la tapa de la cápsula de Petri, y dispensar la muestra en el centro del agar. Cierre la tapa.
    • Utilice una técnica aséptica durante todo este procedimiento.
    • Utilizar una micropipeta para transferir la muestra a la placa. Controlar el flujo de la muestra para que no salpique fuera de la placa.
  5. Sumergir la varilla de vidrio o metal varilla (también llamado un esparcidor) en un vaso de precipitados de 70% (v / v) de etanol.
    • PRECAUCIÓN: No introduzca nunca un difusor de calor en un vaso de alcohol.
    • El etanol sólo debe tocar la parte inferior de la cruceta y la primera pulgada del tallo.
  6. Escurrir el exceso de etanol y encender pasándolo a través de la llama de una Bollosen quemador.
    • La llama debe recorrer la longitud de la cruceta y el vástago que entró en contacto con el etanol luego rápidamente extinguir.
    • Si el vaso de precipitados de fuego de etanol de captura, no se asuste! Coloque una cubierta de vidrio en el vaso, que rápidamente extinguir el fuego.
  7. Abra la tapa de la placa de agar, la celebración de la tapa con la mano izquierda con el pulgar y el dedo índice. Enfriar la cruceta tocando al agar a lo largo del borde cerca del borde.
    • No toque el agar donde las células se han añadido. El esparcidor caliente para que mate las células.
  8. Con la mano izquierda (mientras que mantiene la tapa de la placa de agar), gire el plato lentamente.
    • Aunque es mejor evitar, si hay que poner la tapa hacia abajo, colóquelo boca abajo sobre una superficie desinfectada en el campo estéril del mechero Bunsen. Con una tapa que está hacia arriba, existe una mayor posibilidad de contaminación de los movimientos de los objetos o las manos, creando corrientes de aire que causanmicroorganismos y partículas de polvo a descender a la superficie interior de la tapa.
  9. Con la mano derecha, mantenga el separador suavemente sobre la superficie del agar y se extendió gradualmente la muestra de manera uniforme sobre toda la placa. Mueva el esparcidor de un lado a otro a través de la placa como el plato está girando.
  10. Permitir la muestra para absorber completamente (al menos 5 minutos) antes de invertir la placa para la incubación.

Método B: Propagación de galvanoplastia con cuentas de vidrio: el "Método de Copacabana"

  1. Etiqueta alrededor del borde de la parte inferior (no la tapa) de una placa de agar con por lo menos su nombre, la fecha, el tipo de medio de crecimiento, y el tipo de organismo que se sembraron en el medio.
    • Incluir el factor de dilución, si plaqueo de diluciones.
  2. Abra la tapa de la placa de agar, la celebración de la tapa con la mano izquierda con el pulgar y el dedo índice. A continuación, abra el tubo de vidrio o una botella que contiene pre-esterilizados glcuentas de culo. Con la mano derecha de llama, el borde del tubo o botella luego cuidadosamente dispensar 10-12 perlas de vidrio estéril sobre una placa de agar (Figura 6). Cerrar la tapa de la placa, y la llama borde del tubo o botella, una vez más antes de reemplazar la tapa y el establecimiento de un lado.
    • Verter suavemente las perlas fuera del tubo o botella de unos pocos centímetros por encima del agar por lo que las perlas no rebote hacia fuera de la placa de Petri.
    • Utilizar cuentas de vidrio que son 4 mm de diámetro. Esterilizar en botellas de vidrio o tubos de ensayo en el autoclave a 121 ° C en el ciclo de secado (ajuste de la gravedad) durante 30 minutos.
    • Una ventaja de usar bolas en lugar de un esparcidor es que no hay contenedores abiertos de etanol se requieren para flamear repetido.
  3. Abrir la tapa de la placa de agar, y dispensar la muestra en el centro del agar. Cierre la tapa.
    • Utilice una técnica aséptica durante todo este procedimiento.
    • Alícuota 100 a 150 l de muestra por placa. Estevolumen facilitará incluso propagación de las células. Utilizar una micropipeta para transferir la muestra a la placa. Controlar el flujo de la muestra para que no salpique fuera de la placa.
  4. Extender la muestra agitando suavemente las perlas a través de la superficie del agar de 6 a 7 veces. Para garantizar que las células distribuyan de forma equilibrada, con un movimiento horizontal, temblando.
    • No girar las bolas o de lo contrario todas las celdas el resultado final será en el borde de la placa.
    • SUGERENCIA: Si se realiza correctamente, el procedimiento suena como "maracas zarandeo".
  5. Gire la placa de 60 ° y luego horizontalmente agitar de nuevo de 6 a 7 veces.
  6. Gire la placa de 60 ° por segunda vez y en sentido horizontal agitar de nuevo. A estas alturas, usted debe lograr aún la propagación de células a través de la superficie del agar.
  7. Cuando haya terminado propagación de galvanoplastia, la muestra debe ser absorbida y la superficie del agar debe estar seco. Retirar los granos contaminados en un vaso de colección de marcado contiene 10% de cloro.
    • Nodescartar los granos en la basura! Las perlas se enjuagan utilizados y autoclave, volver a esterilizar ellos para uso repetido.
    • NOTA: Si la superficie de agar está todavía húmeda después de agitar tres veces, permitir que la placa de sentarse durante varios minutos para permitir que el líquido sea absorbido por el agar, a continuación, repita los pasos # 4-6 hasta que la superficie de la placa aparece seca.
  8. Invertir la placa para la incubación.

5. Agar blando procedimiento de superposición: la formación de placas para el aislamiento y recuento de los fagos (la placa de ensayo)

Esta técnica se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar bacteriófagos (fagos), o virus bacterianos que varían en tamaño desde 100 a 200 nm. Un microscopio electrónico es necesario para ver las partículas individuales de fagos. Sin embargo, la presencia de partículas de fagos infecciosos puede ser detectada como placas en una placa de agar (Figura 7A). Los fagos no puede replicarse fuera de sus células huésped bacterianas, por lo que la propagación de unadetección d requiere mezclar fagos y células huésped juntos antes de chapado. Para el procedimiento de agar de recubrimiento suave, un volumen pequeño, generalmente en el intervalo de 50 l de 200 l, de una suspensión de fagos se dispensa en un tubo que contiene aproximadamente 10 8 bacterias (células huésped) que están uniformemente dispersas en 2.5-3.0 ml de blandos (0,5 a 0,7% [w / v]), agar nutritivo fundido. La mezcla resultante se vierte sobre la superficie de un duro (1,5 a 1,9% [w / v]) placa de agar nutriente. La placa se sacudió lo suficiente como para asegurar que el agar blando cubre toda la superficie del agar duro. Entonces la placa se coloca sobre una superficie plana hasta que la capa de agar superior ha tenido tiempo de solidificarse y, posteriormente, se puede colocar en la incubadora.

Con el tiempo, una suspensión turbia de células bacterianas, referido como un césped, se hace visible en todo el medio de agar blando (Figura 7B). Las placas formar si un fago infecta una de las células bacterianas, se replica dentro ªcelular e, a continuación, lisa la célula liberar hasta 100 fagos (también conocido como el tamaño de ráfaga). Las partículas de fago nuevos difundir en el agar blando, infectando a las bacterias en el área que rodea a la célula bacteriana lisada. Después de varios ciclos de infección y lisis, la suspensión turbia de células bacterianas en el agar blando desaparece, dejando una zona de compensación llamado placa. Cada placa contiene más de 10 9 partículas de fago, todos genéticamente idénticos a la partícula fago infeccioso original. Debido a que una placa surge de una sola partícula de fago, el número resultante de unidades formadoras de placa (ufp) pueden ser contados y la concentración original, o título, de la suspensión de fago puede ser calculado. Este tipo de experimento, llamado un ensayo en placa, también proporciona a los científicos un medio estandarizado para generar un paso curvas de crecimiento, para investigar la especificidad del huésped gama, y ​​para transducir células bacterianas para los experimentos genéticos.

  1. <strong> Preparar las bacterias indicadoras de contaminación: Una cultura de crecimiento exponencial de la cepa bacteriana de acogida tiene que estar preparado para el experimento de agar de recubrimiento suave. Cada host tiene sus propias necesidades de crecimiento. Entre 0,3 ml y 0,5 ml de una suspensión de bacterias indicadoras se requiere para cada placa. Si un matraz de bacterias indicadoras se prepara (por ejemplo, 25 ml), el cultivo debe ser dividido en pequeñas partes alícuotas (por ejemplo, alícuotas de 5 ml dispensados ​​en estériles con tapón de rosca tubos) para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación cruzada. Los tubos pueden estar en hielo (4 ° C) hasta que esté listo para usar en el experimento. Utilice una técnica aséptica para inocular caldo nutritivo estéril, luego incubar de acuerdo a las especificaciones de la cepa bacteriana. Culturas sobrantes deben ser desechados al final del día.
  2. Preparar los tubos de adsorción: Coloque dos tubos de microcentrífuga estériles en un bastidor. Etiquete la tapa del primer tubo "fago" y la tapa del segundo tubo "control".
    • Típicodiluciones seriadas de ly lisados ​​de fagos se preparan y se sembraron en cuyo caso los tubos de microcentrífuga adicionales se añaden a la cremallera y etiquetados con el factor de dilución.
    • Poblaciones de fagos debe hacerse fresco a partir de placas individuales y se almacenan a 4 ° C. Para desagregar partículas de fago, las existencias se debe calentar hasta temperatura ambiente antes de realizar un experimento.
    • Las poblaciones de fagos deben ser manejados con cuidado - no vórtice o pipeta vigorosamente.
  3. Añadir 50 l de la muestra fago al primer tubo a continuación, añadir 50 l de tampón de fago para el segundo tubo, que servirá como un control negativo para el ensayo en placa.
    • Utilice una técnica aséptica durante todas las manipulaciones de fagos y bacterias.
  4. A continuación se añaden 500 l de bacterias indicadoras en cada tubo de adsorción.
    • Las células bacterianas se depositarán en el fondo de un tubo si se sienta en el hielo o el banco durante largos períodos de tiempo. Si la cultura no se mezclaned antes de retirar una parte alícuota para el experimento, no hay suficientes células bacterianas se transfiere al tubo de adsorción. Debe haber un número suficiente de colonias bacterianas formadas en el agar blando (es decir, un césped) para la detección de las placas. Use un vórtex suavemente volver a suspender las bacterias indicadoras de contaminación en una suspensión homogénea antes de transferir alícuotas a los tubos de adsorción.
  5. Mezclar las células bacterianas y de fago suavemente agitando los tubos.
  6. Incubar los fagos / mezcla bacterias durante 15-20 minutos (no más de 30 minutos) a una temperatura apropiada para la cepa indicadora.
  7. Preparar agar nutritivo suave y placas de agar duro: Mientras que la adsorción se está produciendo, lugar dos tubos de agar blando (previamente fundida y se almacenó a 55 ° C) en un bloque de calentamiento a su banco de laboratorio fijado en 46-48 ° C.
    • El agar blando fundido debe equilibrarse a la temperatura del bloque de calefacción durante 10-15 minutos. Si el suave fundidoagar se sienta más de 15 minutos, se empiezan a solidificar y se forman grumos cuando se vierte sobre el agar duro. Si el agar blando fundido se sienta menos de 10 minutos, será demasiado caliente cuando se añade a los fagos / mezcla bacterias, matando las células huésped antes de la siembra. En consecuencia, un césped no puede formar placas y pocas o ninguna puede ser detectable.
    • Preparar adicionales tubos de agar blando si placas de diluciones seriadas del lisado del fago.
  8. Etiqueta alrededor del borde de la parte inferior (no la tapa) de dos nutriente de agar duro placa placas con al menos su nombre, la fecha, el tipo de medio de crecimiento, y "Fago" o "control" correspondiente a los tubos de adsorción.
    • Incluye placas adicionales etiquetados con el factor de dilución, si plaqueo de diluciones.
    • Las placas de agar duro debe estar completamente seco sin condensación en la tapa y pre-calentado a la temperatura ambiente antes de añadir el agar blando. Si las placas se almacenan a 4 ° C, eliminarlos varias horas o incluso da ely antes. Corre a cabo en pequeños montones, se tambaleó de no más de 2-3 platos y déjelos secar. El exceso de humedad en la capa de agar duro hará que la dilución del agar blando, permitiendo fago para difundir más fácilmente a través del agar blando durante la formación de placa. En consecuencia, el tamaño de la placa se incrementará.
  9. Placa de adsorción de los tubos a la vez de la siguiente manera: Utilice una micropipeta P1000 para transferir asépticamente el fago / mezcla de bacterias (debe ser de aproximadamente 550 l) a un tubo de agar blando luego rápidamente se rotan entre las palmas de las manos para mezclar los contenidos. No agitar el tubo de manera que las burbujas de aire se introducen. Sosteniendo el tubo en su mano izquierda, abra la tapa de una placa de agar con fuerza con su mano derecha e inmediatamente verter todo el contenido del tubo sobre la superficie de una placa de agar duro. Antes de cerrar la tapa, oscilar suavemente la placa, pero rápidamente para difundir el agar blando fundido sobre toda la superficie de la placaantes de que tenga tiempo para solidificar. Evite salpicar el agar blando fundido en los lados de la placa de Petri. Cierre la tapa.
  10. Repetir el paso # 9 para todos los tubos de adsorción, un tubo a la vez.
  11. Coloque las placas sobre una superficie plana y permitir que repose hasta que el agar blando que se solidifica.
    • Generalmente es de 30 minutos es suficiente.
  12. Invertir las placas de incubación.
    • Placas de múltiples pueden ser apilados y se pegan a continuación invertida para la incubación.

Después de la incubación, las placas pueden ser inspeccionadas para placas. El control negativo debe tener sólo un césped de bacterias (sin orificios de las placas indicativas). Las placas varían en términos de apariencia tamaño, forma y, en general. Un tipo fago dado se puede aislar de una mezcla heterogénea de las placas por punzonado cuidadosamente el centro de una placa con un palillo estéril y transferir el inóculo a un t microcentrífuga estérilesUbe contiene 100 hasta 1000 l de caldo o tampón de fago. Este lisado puede ser chapado usando el mismo procedimiento descrito anteriormente. Por lo menos 3 a 6 sucesivas de una sola placa aislamientos son necesarios para asegurar que un fago puro se ha obtenido. A menudo, el lisado se diluyó en una amplia gama (10 -1 a 10 -10) para encontrar un título que produce la no superposición placas en una placa. El número varía dependiendo del tamaño de la placa.

6. Réplica de Procedimiento de la placa: la transferencia de células mutantes de detección y auxótrofos

Esta técnica permite la comparación del crecimiento de células en una placa primaria a las placas secundarias, generando un medio a las células de pantalla para un fenotipo seleccionable. En primer lugar un primario, o maestro, la placa se inoculó con células, ya sea por difusión de galvanoplastia una dilución que produce colonias individuales o por transferencia a una placa en un patrón espacial especificado por las marcas de la cuadrícula. Placas secundarias con los medios de comunicación con los inh el crecimientoITORS o medios que carece de un nutriente en particular se inocularon con células de colonias en la placa principal. El patrón espacial de las colonias se reproduce primero pulsando un trozo de terciopelo a la placa principal. Las células bacterianas se adhieren a la terciopelo porque tienen una mayor afinidad por el terciopelo que para el agar. La huella de las células en el terciopelo luego se transfiere a múltiples placas secundarias con el crecimiento celular que refleja el patrón colonia misma que la de la placa principal. En otras palabras, es como tener un sello de caucho, replicando el patrón de crecimiento de una placa a otra. Esta técnica es ventajosa porque permite que un número relativamente grande de las colonias que se proyectarán simultáneamente para muchos fenotipos en un solo experimento.

  1. Preparar primaria placa: Discográfica alrededor del borde de la parte inferior (no la tapa) de una placa de agar con por lo menos su nombre, la fecha, y el tipo de medio de crecimiento.
  2. Mark fuera de una rejilla en la parte inferior de la placa conal menos dos líneas verticales equidistantes y al menos dos líneas horizontales equidistantes. Número de las plazas resultantes.
  3. Utilizar un pre-esterilizado palillo para inocular cada cuadrado con una muestra de células. Para cada muestra, aplique el centro de la plaza. No cubra toda la plaza con las células (Figura 8) o bien la muestra se crecen en exceso cuando se incuba y contaminar plazas que la rodean.
    • Cada cuadrado se inocula con una muestra diferente, derivada de los cultivos de caldo o colonias sobre otra placa.
  4. Invertir e incubar la placa principal, que se utiliza para inocular diversos medios secundarios.
  5. Inocular las placas secundarias: Pila de la placa principal y todas las placas secundarias. Con un marcador, hacer una marca de orientación en el lado de las placas. Asegúrese de que la marca está en el lado inferior de cada placa, no la tapa.
  6. Obtener un paño de terciopelo estéril y colóquelo en el bloque cilíndrico (Figura 9). Bloqueo de la tela de pana en su lugar con el titular. Tenga en cuenta la marca de orientación en el bloque.
    • El bloque debe ser del mismo tamaño que la parte inferior de una placa de Petri (10,2 cm de diámetro). Debe venir con un anillo de seguridad que se sujeta el paño de terciopelo, mientras que en el bloque de placas de réplica.
    • El paño de terciopelo (15,2 x 15,2 cm cuadrado) debe ser previamente esterilizados. Pila de 10 o 12 plazas limpias luego envolver en papel de aluminio y luego colocarlos en el autoclave a 121 ° C en el ciclo de secado (ajuste de la gravedad) durante 30 minutos. Antes de utilizarlos en un experimento de siembra de réplica, asegúrese de que estén completamente secas, colocándolas en un horno caliente durante varias horas. Tenga en cuenta que los cuadrados de pana posible que tenga que ser de-linted con cinta adhesiva antes de la esterilización.
    • Cuadrados Velveteen puede ser re-utilizada. Después utilizados cuadrados pana han sido descontaminados en el autoclave, deben ser lavadas en agua corriente y volver a esterilizar como se describió anteriormente.
    • El bloque cilíndricok y la abrazadera se debe desinfectar entre usos con un breve enjuague en el 70% (v / v) de etanol o 10% de lejía de cloro.
  7. Retire la tapa e invierta la placa principal. Alinee la marca de orientación de la placa con la marca de la manzana. Bajo la placa de modo que la superficie del agar está en contacto con la tela de pana en el bloque cilíndrico. Ligeramente, pero de manera uniforme, presione hacia abajo con las yemas de los dedos en la parte posterior de la placa principal y luego levante con cuidado el plato principal fuera del bloque. Colocar la tapa sobre la placa.
    • La impresión de terciopelo de células de la placa primaria puede ser utilizado para inocular aproximadamente 7-8 placas secundarias antes de una impresión con un terciopelo necesidades nuevas que se harán.
  8. Repetir el paso # 7 con cada una de las placas secundarias.
    • Como control positivo, la última placa de la serie debe ser un medio de agar en el que todas las cepas ensayadas deben crecer. De esta manera usted puede confirmar que las células fueron transferidas a todas las escuelas secundarias plAtes de la serie. De lo contrario, la falta de crecimiento en un medio de ensayo en particular puede ser atribuida a la transferencia de células insuficiente en lugar de un fenotipo de la cepa.
    • Para evitar falsos positivos, las placas secundarias deben ser ordenados de menor a sustrato más favorable. De lo contrario, los nutrientes pueden ser transferidos entre las placas permitiendo que las células crecen en un medio desfavorable.
  9. Invertir las placas e incubar.
    • Nota: Cuando la inspección de las placas para impulsar su crecimiento, asegúrese de distinguir entre el crecimiento y la impresión de un archivo. Este último es un resultado negativo.

7. La limpieza del espacio de trabajo

  1. Apague el mechero de Bunsen quitad todos los suministros, incluyendo las culturas en las placas o en tubos, medios de comunicación adicionales, y otros reactivos.
    • No permita que las culturas antiguas, ya sea en placas o en tubos, que se acumulan en la mesa de laboratorio o en las áreas de almacenamiento. Estas muestras, que son una importante fuente de contaminacióntales como moldes y no deseados especies bacterianas, debe desecharse tan pronto como ya no son necesarios.
  2. Coloque el material de laboratorio contaminados (guantes, puntas de pipeta, los Kimwipes), artículos de vidrio (tubos, frascos, botellas), y los residuos peligrosos (cultivos de bacterias o soluciones de fagos, placas utilizadas) en el receptáculo de su eliminación adecuada. Cuando se trabaja con una no patógena E. coli cepa (BSL-1), sólo no infecciosa residuos peligrosos se genera. Al realizar estos mismos procedimientos con los organismos patógenos (BSL-2 o superior), los residuos peligrosos infecciosos se genera. Independientemente de la clasificación de riesgo biológico, los residuos peligrosos deben ser esterilizados en autoclave o desinfectados antes de ser descartado. Sigue las instrucciones descritas en el BMBL (5 ª ed.), Así como los previstos por su salud institucional del Medio Ambiente y el departamento de seguridad para la eliminación inmediata y adecuada de los riesgos biológicos generados durante un experimento.
  3. Limpie el área de trabajo con desinfectante.
  4. Lávese las manosa fondo con jabón antiséptico y agua tibia antes de salir del laboratorio.

8. Los resultados representativos

Raya de la placa técnica. Una aplicación de la muestra para chapado racha se muestra en la Figura 1. Este procedimiento se utiliza para aislar colonias de bacterias a partir de cultivos de células mixtas y es por lejos una de las técnicas más importantes para dominar en microbiología y genética molecular. Cada colonia representa una población de células que son genéticamente idénticos. Para muchas aplicaciones posteriores es imperativo empezar con una sola colonia o un cultivo puro bacteriana generada por inoculación de los medios de comunicación con células de una sola colonia. Por ejemplo, la morfología de las células individuales dentro de una colonia puede ser inspeccionados utilizando un microscopio de luz. Identidad genética puede ser asignada por la secuenciación del gen de la subunidad pequeña de ARN ribosomal de ADN genómico aislado de un cultivo celular se inició con una sola colonia.Y características metabólicas puede ser descrito sometiendo las células a diversos ensayos bioquímicos y fisiológicos. Sólo mediante la realización de estos experimentos con cultivos puros se puede estar seguro de las propiedades atribuidas a un determinado microorganismo. Los resultados no están oscurecidos por la posibilidad de que la cultura está contaminada. Los errores técnicos pueden ocurrir si la esterilidad del instrumento utilizado a la raya de las células a través de la placa no se mantiene durante todo el procedimiento. Olvidando a la llama un bucle o recuperar un palillo de dientes fresca entre los cuadrantes hacen que sea difícil obtener colonias individuales. Algunas especies bacterianas no pueden ser aislados en un cultivo puro, ya que son dependientes de una asociación cooperativa con otras especies bacterianas para ciertos requerimientos de crecimiento. Conocidos como syntrophs, estos organismos sólo pueden ser cultivadas bajo condiciones de co-cultivo, de modo colonias (si formado) siempre se compone de dos o más especies. Otro desafío encontrado en el laboratorio cuando se realiza elrayas placa procedimiento con bacterias procedentes de muestras ambientales es que las células exhiben características de crecimiento que se desvían de las cepas de laboratorio tradicionales, tales como E. coli. Tales cepas bacterianas pueden producir colonias que son filamentosa (en oposición a racimos apretados de células) con ramas que se extienden sobre una gran parte de una placa de agar, calcificada y por lo tanto refractario a la penetración por un instrumento de rayas placa, o rodeado por una cápsula pegajosa de modo que las colonias individuales no pueden ser distinguidos. Estas características hacen que sea difícil de purificar colonias individuales por la técnica de placa de rayas.

Pour-placa técnica. Con la técnica de placa de vertido, las colonias se forman dentro del agar, así como sobre la superficie del medio de agar proporcionando así un medio conveniente para contar el número de células viables en una muestra. Este procedimiento se utiliza en una variedad de aplicaciones industriales. Por ejemplo, es crítico para una tre las aguas residualesatment planta, que se encarga de la limpieza de los residuos líquidos (por ejemplo, aguas residuales, las escorrentías de los desagües pluviales) generado por las características domésticas, comerciales e industriales, así como las prácticas agrícolas, para analizar muestras de agua tras el proceso de purificación extensa. Las aguas residuales tratadas (agua no potable) se vuelve a utilizar en una variedad de formas - para el riego de cultivos no alimentarios en la agricultura, para el lavado sanitario en residencias, y en las torres de refrigeración industriales - por lo que debe estar libre de contaminación química y microbiana. El agua potable (agua potable) debe ser purificado de acuerdo con las normas de la EPA y se ha probado utilizando métodos microbiológicos planchas que permiten la enumeración de determinados patógenos humanos. Se muestra en la Figura 10 se colonias bacterianas derivadas de células de las bacterias presentes en una muestra de agua recogida de una fuente de agua potable pública. Es poco probable que las bacterias patógenas producen estas colonias, dadas las medidas de purificación de agua potable, sin embargo, los microbios son todos losdonde y la contaminación por incluso cepas no patógenas puede ser minimizado, no se elimina completamente. Como otro ejemplo, una compañía farmacéutica necesita para evaluar el grado de contaminación microbiana, o biocarga, de un nuevo medicamento durante la producción, almacenamiento y transporte. Mediante el muestreo de la droga durante diversas fases del proceso y las muestras de galvanoplastia utilizando el procedimiento de vertido placa, la carga microbiana, o el número de bacterias contaminantes, se puede determinar fácilmente. Las medidas precautorias entonces se puede diseñar para minimizar o eliminar la contaminación microbiana. Uno de los errores técnicos más comunes que se produce cuando se realiza la técnica de vertido placa es insuficiente mezcla de la muestra con las colonias de agar fundido causando agrupen haciendo así recuentos de placas incorrecto. Otro error frecuente es la de verter el agar derretido cuando esté muy caliente, matando a muchas de las células bacterianas en la muestra. Este error también afecta la precisión de los recuentos de placas dando números que sub-representan ºe número total de unidades formadoras de colonias en la muestra.

Propagación de la placa técnica. La técnica de propagación de la placa es análogo al procedimiento de vertido placa en su utilidad como un medio para realizar recuentos viables de la placa. Sin embargo, debido a que las colonias que forman utilizando la técnica de propagación de la placa están distribuidos uniformemente en toda la superficie del medio de agar, las células de colonias individuales se pueden aislar y utilizar en posteriores manipulaciones experimentales (por ejemplo, como el inóculo para una raya-placa o un caldo de cultivo). Tres aplicaciones comunes en las que la técnica de propagación de la placa es un componente importante son los experimentos de enriquecimiento, de selección y evaluación. En las tres aplicaciones, el tipo de célula deseado se puede separar de la mezcla y después sometido a cualquier número de pruebas bioquímicas y fisiológicas, o genéticos.

Un experimento de enriquecimiento consiste en siembra de una cultura mixta en un medio de incubación de las placas o en el correocondiciones que favorecen el crecimiento AMBIENTAL de los microorganismos dentro de la muestra que demuestran las propiedades metabólicas deseadas, las características de crecimiento, o comportamientos. Esta estrategia no inhibe el crecimiento de otros organismos, pero los resultados en un aumento en el número de microorganismos deseados relativos a otros en el cultivo. Así, las colonias que se forman en una placa de enriquecimiento probable exhiben propiedades fenotípicas que reflejan el genotipo deseado. Por ejemplo, si su objetivo es cultivar bacterias fijadoras de nitrógeno a partir de una muestra ambiental que contiene una mezcla de más de 1000 especies diferentes de bacterias, a continuación, enchapado la muestra en un medio deficiente en nitrógeno enriquecerá para aquellas bacterias que pueden producir este compuesto a partir del ambiente utilizando las capacidades metabólicas proporcionados por un conjunto de genes necesarios para la fijación de nitrógeno.

Un experimento de selección implica la siembra de una cultura mixta, en un medio que permite que sólo las células que Conmantener un determinado gen o conjunto de genes para crecer. Este tipo de experimento es común en los laboratorios de biología molecular cuando la transformación de cepas bacterianas con plásmidos que contienen genes de resistencia a los antibióticos. Si su objetivo es cultivar sólo las células recombinantes, o aquellos que con éxito tomó el plásmido, luego enchapado la muestra en un medio que ha sido complementado con una concentración apropiada del antibiótico se selecciona para aquellas células que exhiben resistencia a este fármaco en particular.

Un experimento de detección implica enchapado un cultivo mixto en un medio que permite que todas las células viables para crecer, sin embargo, las células con el genotipo deseado se puede distinguir de otras células en base a su fenotipo. De nuevo, este tipo de experimento es común en los laboratorios de biología molecular cuando se realizan ensayos de mutagénesis o genes de clonación en plásmidos. Un ejemplo clásico, tal como se muestra en la Figura 11, hace uso de la ENCO gen lacZDing β-galactosidasa; esta enzima permite a las células a metabolizar X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido), un análogo de sustrato de su sustrato natural, la lactosa. La escisión de X-Gal por los resultados de β-galactosidasa en un producto de color azul insoluble. Así, si un medio contiene X-gal, y una muestra que contiene células, ya sea con un tipo salvaje (funcional) o mutantes (no funcional-) gen lacZ se sembraron en este medio, a continuación, después de incubación de tipo salvaje células que albergan un funcional lacZ gen aparecerá como colonias pigmentadas azul mientras que las células mutantes con un gen no funcional lacZ aparecerá como no pigmentadas ("blanco") colonias.

Un problema técnico detectado con más frecuencia la primera vez que aprender a realizar la técnica de propagación de la placa es desigual propagación de las células a través de la superficie del agar. Cuando se utiliza una plataforma giratoria y varilla de vidrio, la muestra puede ser absorbido demasiado rápidamente de tal manera que las colonias constituyen sólo cerca del centro de la placa. Wgallina haciendo el "Método de Copacabana", las perlas de vidrio se arremolinaba en lugar de agitarse a través de la superficie del agar. Por consiguiente, muchas colonias crecen a lo largo del borde exterior de la placa. En cualquier caso, la distribución resultante de las colonias no se aprovecha de la superficie disponible completa para que las células pueden agruparse y crecer en colonias que hacen el conteo de placas superpuestas inexacta o distinción de tipos de células no factibles.

Agar blando técnica de superposición. Un procedimiento similar a la técnica de propagación de la placa utilizada para contar las colonias bacterianas se pueden utilizar para contar el número de fagos. Considerando que entre 30 y 300 células bacterianas se extienden sobre la superficie de agar para el recuento de placa (ufc / ml), entre 100 y 400 partículas de fagos infecciosos se mezcló con 10 de 8 a 10 9 células huésped para el recuento de placa (ufp / ml) dentro de una capa de agar blando extendido a través de la superficie de agar nutriente duro. A menos que se demuestre lo contrario, se asume generalmente tsombrero de una única célula bacteriana se divide y se acumula un gran número de células genéticamente idénticas en un solo grupo llamado colonia. Como se mencionó anteriormente, esta suposición no es válida cuando las células crecen en racimos (es decir, pares, tétradas, cadenas o clusters) o mostrar las características de crecimiento, tales como cápsulas que impiden la formación de una sola colonia. Un supuesto similar se hace para la formación de placa, en que cada placa representa la actividad de un fago clave. Esta afirmación es cierta sólo si un fago infecta una bacteria. ¿Qué pasa si múltiples partículas de fago infecta una bacteria? Este problema se refiere a un parámetro importante estadística que debe ser considerado cuando se realizan experimentos con fago - multiplicidad de infección (MOI) - describir la relación de partículas de fagos infecciosos para el número de células huésped en una muestra. Debido a que algunas células de absorber más de un fago, mientras que otras células absorben sólo un fago o no, una población de células de acogida debe ser infectadas a una MOI baja (≤ 1) to reducir al mínimo la probabilidad de que una célula se infecta por más de una partícula del fago. Empleando la unidad formadora de placa (ufp) como una definición funcional evita estas complicaciones al realizar los recuentos de placas para calcular el título de un stock del fago.

Como se muestra en la Figura 12, morfología de la placa varía para fago diferente. Algunos fago generar pequeñas placas (panel A) mientras que otros dan lugar a grandes placas (panel B). Un número de variables que afectan el tamaño de la placa. Existen razones técnicas que contribuyen a esta variabilidad. Por ejemplo, medios completos y espesor de desarrollo duro apoyo de agar de las placas más grandes porque las células huésped puede sostener el crecimiento del fago durante un período de tiempo más largo. Una alta densidad de placas de las células huésped (> 10 9 ufc por placa) provocará una reducción de tamaño de la placa. Usando concentraciones más bajas de agar blando se incrementará la velocidad de difusión del fago de partícula en el agar blando y con ello aumentar el tamaño de las placas. Recordemos ºa este ritmo creciente difusión puede ocurrir involuntariamente si las placas de agar duro no se seque completamente de tal manera que la humedad de condensación o en exceso en el plato diluye el agar blando en la superposición. Esta supervisión técnica va a producir resultados inconsistentes con respecto al tamaño de la placa de un fago particular.

Tamaño de la placa también se relaciona con un número de eventos de la célula huésped incluyendo la eficiencia de la adsorción, la duración del período de latencia (el lapso de tiempo de adsorción de fagos a la lisis de la célula huésped), y el tamaño de ráfaga (el número de progenie liberado por una sola infección). Una mezcla heterogénea de tamaños de la placa se puede observar si las partículas de fagos infectan a las células huésped en las diferentes fases de crecimiento bacteriano. Por ejemplo, los que se adsorben en la fase exponencial temprana hacer grandes placas con el fago progenie más que las que se adsorben en fase exponencial tardío. Como regla general, fago lítico producir placas claras, mientras que las placas de fagos lisogénicas turbias forma. HoWever, un fago lítico producir patrones interesantes como "ojo de buey", la placa se muestra en la figura 12B. Estas placas claras están rodeados por un halo turbio porque estas células en el borde de la placa no están completamente lisadas o pueden ser resistentes a la infección por fagos. Un "ojo de buey" con el patrón observado fago temperado es una placa con un centro de turbias rodeado por un anillo claro. Esta morfología refleja el momento de inercia y la fisiología de la célula huésped con respecto a la decisión de lisis-lisogenia. Cuando las células son infectadas por primera vez con el fago, el MOI es baja y las células crecen rápidamente debido a los nutrientes son abundantes, así que esto facilita el crecimiento lítico. Como más y más células se lisan, el Ministerio del Interior aumenta y se forma una placa claras. Lisógenos en el centro de la placa, sin embargo, continúan creciendo porque son inmunes a la lisis dando lugar a una placa transparente, con un centro turbia.

La técnica de superposición puede ser modificado para ensayos de placa con virus eucarióticos. Enlas mismas vías forman placas bacteriófagos sobre un césped de células bacterianas en agar blando, virus eucarióticos formar placas en una monocapa de células cubiertas por un gel. Una monocapa es una lámina confluente de células que crecen al lado del otro en la superficie de una placa de cultivo, tocar entre sí pero no crece en uno encima del otro. Para llevar a cabo este tipo de placa de ensayo, alícuotas de virus se añaden a las monocapas susceptibles de células eucariotas. Luego la monocapa se cubre con un medio nutriente de agarosa basado - este gel restringe la propagación del virus de la progenie liberadas de las células infectadas a las células adyacentes en la monocapa. Por consiguiente, una zona esférica, o placa, se produce que contiene las células dañadas por la liberación de los viriones. Para ayudar a la visualización de las placas, los tintes que las células vivas manchas pueden ser aplicados al cultivo celular proporcionar contraste entre las células infectadas y no infectadas.

La técnica de superposición de agar blando se utiliza para otros experimentos de ensayos de placa. En primer lugar, es significant recordar que el agar nutriente duro es una matriz de soporte que permite el crecimiento de bacterias. En segundo lugar, la suave-agar utilizado para la superposición puede tener una composición diferente de nutrientes que el agar duro. De esta manera, el agar blando puede servir como un medio para las cepas bacterianas de ensayo para las características de crecimiento diferentes o propiedades metabólicas. Por ejemplo, la técnica de superposición se utiliza para las bacterias de la pantalla para la capacidad de degradar celulosa (Teather y Wood, 1982). Las colonias individuales se cultivan en un medio de agar no selectivo duro luego suave-agar que contiene 0,1% (w / v) de carboximetil celulosa (CMC) se extiende sobre la superficie del agar duro. Después de la incubación, las placas se inundó con mancha que permite la visualización de zonas de compensación alrededor de las colonias en el agar blando. La compensación es causada por las enzimas hidrolíticas secretadas por las bacterias para descomponer la celulosa en el medio. Más recientemente, la técnica de superposición se ha utilizado para detectar bacterias que inhiben el crecimiento de methanogeArchaea NIC se encuentra en el rumen de los animales (Gilbert et al. 2010). Las bacterias aisladas en muestras ambientales se cultivan en un medio de agar nutriente duro, las colonias se cubrieron con una capa suave de agar que contiene un cultivo de metanógenos. Después de la incubación, las placas se inspeccionaron para las zonas de inhibición del crecimiento alrededor de las colonias. Este método identifica las cepas bacterianas que producen los inhibidores de los metanógenos en el agar blando.

Los errores técnicos más comunes que se producen con la técnica de superposición de soft-agar se vierte el agar fundido suave, bien cuando éste es demasiado caliente o demasiado frío. Si hace demasiado calor, las células bacterianas mezclado en el medio va a ser asesinado antes de la siembra. Si es demasiado fría, a continuación, el agar blando se forman grumos cuando se vierte sobre el agar duro. En cualquier caso, los resultados serán ambigua o ilegible en el mejor.

Réplica de la placa de Procedimiento. Transferencia de cultivos de un tipo de medio nutrientea otro para probar los requisitos de crecimiento se convierte en una tarea muy laboriosa si no son más que unas pocas cepas. Chapado Réplica es un método que permite detección simultánea de un gran número de microorganismos. Por ejemplo, después de mutagénesis de una cultura de células de tipo salvaje, uno se puede propagar de placa diluciones del cultivo para obtener las placas con las colonias individuales. Las placas de primaria contienen un medio que apoya el crecimiento de todas las células de tipo salvaje como prototrofos, que sintetizan todos los compuestos necesarios para el crecimiento y auxótrofos mutantes, que llevan una mutación genética en una vía biosintética haciéndolos incapaces de sintetizar compuestos particulares esenciales para el crecimiento. Por enchapado la mezcla de células en un medio completo, los nutrientes que faltan se pueden tomar desde el medio ambiente. Para distinguir entre prototrofos y auxótrofos, las colonias se puede replicar en un medio mínimo. Sólo prototrofos será capaz de crecer. Debido a que el patrón espacial de la placa principal se conserva, comparisen la placa de secundaria con la placa principal permite la identificación de las colonias mutantes. Para determinar qué compuesto los mutantes ya no son capaces de sintetizar, las colonias se puede replicar en medio mínimo suplementado con compuestos específicos (por ejemplo, aminoácidos, fuentes de carbono, vitaminas, etc.) De esta manera, cientos de colonias pueden ser examinados al mismo tiempo usando el procedimiento de réplica de la placa. Un error técnico que podría ocurrir es usar placas de agar que son demasiado húmeda, causando que las colonias para desprestigiar a la contaminación, junto a todas las culturas en el plato. Esto produce resultados que son totalmente fiables. Otro error técnico está aplicando demasiada presión cuando la transferencia de células de la pana a las placas secundarias. De nuevo, después de incubar las placas secundarias, las colonias resultantes pueden superponerse producir fenotipos de crecimiento atribuidos a la contaminación en lugar de auxotrofía.

No todos los de tipo salvaje especies microbianas son prototrofos, por lo que la réplica-pel procedimiento puede ser utilizado a finales de cribado simultáneo de diferentes cepas de tipo salvaje para las necesidades de crecimiento característicos. Como se muestra en la Figura 13, "toques" de las células a partir de cuatro diferentes cepas de Pseudomonas bacterianas se sembraron por duplicado en una placa de rejilla-marcada que contiene medios completos llamado YTA (panel A). Las cepas luego se replicaron en tres placas secundarias (paneles B, C y D) compuesta de un medio mínimo (MSA), complementado con una fuente de carbono diferente (acetamida, lactosa, y glicina, respectivamente). Los resultados demuestran que dos de los cuatro cepas de Pseudomonas (P. aeruginosa y stutzeri p) son incapaces de crecer en estas tres fuentes de carbono. Como control, las cepas fueron replicadas sobre una placa de cuarto con medio YTA para confirmar las células fueron transferidas durante todo el procedimiento. Desde las cuatro cepas crecen en la placa de control YTA, las deficiencias en el crecimiento exhibido en los últimos tres placas de la serie son fiables. Los resultados de la siembra réplica-se tabulan en la Tabla 1. Un error comúnmente se interpreta una impronta de crecimiento en un plato secundario, como un resultado positivo. Por ejemplo, comparar el fenotipo de P. aeruginosa a la de P. stutzeri en MSA + acetamida (panel B). Esta última muestra una huella de crecimiento, que es un resultado negativo, y puede ocurrir si los nutrientes de la placa anterior se transfieren con las células parentales. No hay crecimiento de nuevas células se produce porque los nutrientes que faltan no están disponibles para células de la progenie. Es fácil confundir una huella con un crecimiento real. En caso de duda, el experimento debe ser repetido utilizando un método alternativo, como células en placas de rayas de la placa principal en los medios de comunicación secundarias.

Figura 1
Figura 1. Ejemplo de colonias individuales sobre una placa. Las esferas de color rosa, cerca del centro de la placa son colonias de Serratia marcescens, una bacteria Gram negativa, en forma de vara proteobacterium en la familia Enterobacteriaceae. Debido a su preferencia por ambientes húmedos, este microorganismo se encuentra comúnmente crece en las esquinas de las bañeras, en las cuencas de sumideros, en lechada del azulejo, y en las cortinas de ducha. S. marcescens es fácil de reconocer ya que produce un pigmento rojizo llamado prodigiosina. Las colonias en esta placa se generaron utilizando la técnica de raya-placa, con las colonias individuales que aparecen en el cuarto cuadrante tras incubación a 30 ° C durante 24 horas. Los otros tres cuadrantes muestran un crecimiento confluente en el cual las células depositadas sobre la superficie del agar desarrollado en colonias superpuestos.

Figura 2
Instrumentos Figura 2. Utiliza para la técnica de racha de la placa. De arriba a abajo, se muestran los palillos de dientes (no aplanado y vuelta), un asa de alambre, un lazo de plástico desechable, y palos de madera. Palillos de dientes suelen ser transferidoa un vaso pequeño de vidrio con el extremo ancho hacia abajo después se cubre con papel de aluminio cuando en autoclave para esterilizar antes de su uso. Palos de madera son transferidos a tubos de 18 mm de ensayo luego en autoclave para esterilizar antes de su uso.

Figura 3
Figura 3. (A) antirayas placa técnica que utiliza el método de cuadrante. Un bucle de pre-esterilizado, palo o palillo de dientes se utiliza para difundir la muestra a través de una cuarta parte de la superficie del agar con una rápida, suave, hacia atrás y cuarto movimiento de la llanta hasta el centro de la placa. Esta acción se repite para cada uno de los cuatro cuadrantes de la placa. Después de la incubación, el crecimiento celular aparece a lo largo de la trayectoria del instrumento utilizado para depositar las células de la placa. La separación mecánica de las células en una muestra mixta usando esta técnica debe resultar en colonias individuales en el cuarto cuadrante (véase la Figura 1 para un ejemplo). Las colonias individuales se conocen como unidades formadoras de colonias (ufc). (B) Cuando un bucle de metal se utiliza para raya de galvanoplastia, éste debe ser esterilizado utilizando la llama de un mechero Bunsen antes del contacto con el inóculo o el medio de agar. Recordemos que la parte más caliente de la llama es la punta del cono azul. Manteniendo el mango del instrumento, colocar el alambre en la llama sobre 3-4 pulgadas desde el bucle. Dejar tiempo suficiente para que el cable para convertirse en rojo vivo. Mueva el alambre de modo que la llama se aproxima al bucle. Asegúrese de que el aro de metal se enfría antes de tocar el inóculo.

Figura 4
Figura 4. Vierta la placa técnica. (A) Un pequeño volumen de muestra (entre 0,1 a 1,0 ml) se distribuye asépticamente en una placa de Petri estéril vacía pero con el uso de una pipeta serológica 5,0 ml. (B) de agar fundido equilibró a una temperatura de aproximadamente 48 ° C se vierte entonces en la placa de Petri con la muestra. Después de cerrar la tapa, la placa está agitado vigorosamente para mezclar la muestra yagar derretido. El agar se deja solidificar durante unos 30 minutos y luego las placas se invierten para la incubación.

Figura 5
Figura 5. Propagación de la placa técnica con un tocadiscos y esparcidor de vidrio. Después de la placa de agar se coloca sobre una plataforma giratoria, un pequeño volumen de muestra (0,1 a 0,2 ml) se distribuye asépticamente en el centro de la placa usando una micropipeta. El separador se esteriliza por inmersión en un vaso de precipitados de etanol entonces se pasa a través de la llama del quemador Bunsen para encender el exceso de etanol. Antes de hacer contacto con la muestra, la cruceta debe ser enfriado por tocarlo para el agar cerca del borde de la placa. El separador se mueve suavemente hacia atrás y adelante a través de la muestra a través de la placa, mientras que el plato está girando lentamente. Esta acción permite gradual pero incluso propagación de la muestra a través de la superficie del agar. Después de cerrar la tapa, la placa se debe establecer en la U de bancondisturbed durante al menos 5 minutos para permitir que la muestra para absorber completamente en el agar antes de invertir la placa para la incubación.

Figura 6
Figura 6. Propagación de la placa técnica con perlas de vidrio (método de Copacabana). Las cuentas de vidrio que han sido pre-esterilizados en autoclave se vertió sobre la superficie de una placa de agar que se sienta en la parte superior del banco. Un volumen pequeño de la muestra (100 a 150 l) se distribuye asépticamente en el centro del agar usando una micropipeta. Con la tapa de la placa cerrada, un movimiento horizontal agitación se utiliza para mover suavemente las perlas de ida y vuelta a través de la placa de 6 a 7 veces, la difusión de la muestra. Esta acción se repite después de girar la placa 60 °. El movimiento de agitación se repitió una tercera vez tras otra rotación de 60 °. Una vez que la muestra esté completamente absorbido en el medio de agar, las perlas se vertió en un vaso que contiene 10% de lejía. Laentonces las placas se invierten para la incubación.

Figura 7
Figura 7. Soft-agar técnica de superposición utiliza para aislar y enumerar fago basa en la formación de placas (también llamado un ensayo de placa). (A) La presencia de fagos pueden ser detectados como zonas de compensación, o placas, en una suspensión confluente de colonias de bacterias que crecen en el agar blando. Fago T4 es una virulenta, de doble cadena del ADN del fago que infecta a su huésped, Escherichia coli, provocando que las células huésped para lisar y liberar fago progenie. Después de varias rondas de infección y lisis, la vecina E. células de E. coli en el área inmediata que rodea la célula original se desvanece huésped infectado dejando una placa que contiene miles de millones de partículas de fago T4. Fago T4 produce placas que son de aproximadamente 1 mm de diámetro. En este experimento, 200 l de una dilución 10 -5 de un 2 x 10 8 ufp / ml de caldo de fago T4se mezcló con aproximadamente 300 l de E. células de E. indicador preparado como un crecimiento exponencial, la cultura aireado a 37 ° C. Tanto el fago y bacterias se añadieron a un tubo de agar blando EHA, mixto, después se vierte sobre la superficie de una placa de agar EHA duro. Nótese que no era necesario para permitir fagos y bacterias para adsorber antes de placas en este caso. Después de permitir que el agar blando que se solidifique en reposo durante 20 minutos, las placas se invierten y se incuban a 37 ° C durante 24 horas. (B) En la ausencia de infectar partículas de fago, los resultados de crecimiento bacteriano en una suspensión turbia de células en el agar blando en el que las colonias discretas no son visibles. En su lugar, un césped uniforme de las células bacterianas, en este caso E. coli, las formas en toda la capa de agar blando entero.

Figura 8
Figura 8. Preparación de la placa principal (maestra) con muestras bacterianas. Para mantener las muestras organizadas, la parte inferior de la placa pueden ser marcados en una rejilla y numerada cuadrados resultantes. Cada muestra se puede asignar una plaza en la parrilla. Se muestran ejemplos de los patrones correctos de inoculación contra incorrecta. Idealmente, un pequeño número de células se transfieren al centro del cuadrado utilizando una herramienta de inoculación estéril, tal como un palillo para "DAB" la muestra (celda # 4). Errores comunes de inoculación, como los representados en la celda # 5 ("parche") y la celda # 6 ("relleno"), dan como resultado una proliferación de muestras de bacterias después de la incubación, en consecuencia contaminantes cuadrados adyacentes.

Figura 9
Figura 9. Réplica de la placa técnica que se utiliza para transferir las células de primaria a secundaria para las pantallas de las placas de fenotipo. La marca en la placa principal está alineada con la marca en el bloque de terciopelo cubre a continuación Lowe rojo para permitir que la superficie del agar en contacto con la tela. Las células se transfieren desde la placa a la pana por la ligera pero uniformemente presionando hacia abajo sobre la placa principal con puntas de los dedos. Esta acción deja una huella de las muestras de células sobre la pana en el mismo patrón espacial como la placa principal. El mismo procedimiento se utiliza para transferir las células de la pana a una placa secundaria. Nada menos que 7-8 placas secundarias pueden ser inoculados con la misma impresión que la placa principal de la pana. La última placa inoculada de la pana debe servir como un control positivo. Debe ser un medio que favorece el crecimiento de todas las cepas probadas, lo que garantiza la transferencia de células suficientes ocurrido a lo largo de toda la serie de placas. Después de la incubación, las placas secundarias pueden ser inspeccionados y anotó para el crecimiento versus ningún crecimiento. Por lo tanto, múltiples cepas bacterianas se pueden seleccionar de forma simultánea en medios de crecimiento de varios en un solo experimento.

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Figura 10. Ejemplo de resultado con vertido de placa técnica. Una muestra de 1,0 ml de agua recogida de una fuente de agua potable pública se distribuyó en una placa de Petri estéril vacía. Entonces fundió pero enfriada YTA se vertió en la cápsula con la muestra. El agar también contenía 100 ug / ml de cicloheximida para prevenir el crecimiento de levaduras y mohos que pueden haber estado presentes en la muestra de agua. Después de agita suavemente a la mezcla, la placa fue puesta sobre una superficie plana y el agar se deja solidificar completamente. La placa se incubó a 37 ° C durante 48 horas. Se muestra el resultado de este experimento. Nótese la diferencia en la apariencia de las colonias de la superficie, que son grandes y de forma circular, frente a las colonias bajo la superficie, que son muy pequeños y la forma irregular debido a que el medio solidificado inhibe la propagación de la colonia en el África sub-superficie.

Figura 11
Figura 11. </ Strong> Ejemplo de resultado con la propagación de la placa técnica. El "método de Copacabana" se utiliza para la placa de una mezcla de células de E. coli para un experimento de cribado. En este caso, el medio de crecimiento (LB) contiene X-Gal, por lo que esas células que expresan un funcionales galactosidasa β-forman colonias azules, mientras que la enzima aquellas células que tienen una mutación en el gen lacZ y por tanto incapaces de expresar un funcional β-galactosidasa forma enzima colonias blancas. A menudo se refiere como un "azul / blanco de la pantalla", los dos tipos de colonias se pueden distinguir fácilmente entre sí en la misma placa.

Figura 12
Figura 12. Resultado Ejemplo de ensayo en placa de agar blando utilizando la técnica de superposición. Se muestran las placas formadas en la cepa huésped Mycobacterium smegmatis mc 2 155 (ATCC 700084) por dos diferentes pHlas edades: (A) Destructores mycobacteriophage y (B) MSSS mycobacteriophage. Estos fagos fueron aislados por los estudiantes en el curso de laboratorio de la UCLA 103L MIMG en la primavera de 2010. M. smegmatis es una Actinobacterium no patógeno y pertenece a una familia de micobacterias, que incluye algunos patógenos que causan enfermedades graves como la tuberculosis (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) y la lepra (M. leprae). Aproximadamente 50 l de una dilución de 10 -2 destructores y una dilución de 10 -3 MCIA cada uno se incubaron con 500 l de M. smegmatis durante 20 minutos a 37 ° C, luego se mezcla con MBTA (agar blando) y se vertió sobre MHA (agar duro) placas. Después de permitir que el agar blando que se solidifique en reposo durante 20 minutos, las placas se invierten y se incuban a 37 ° C durante 48 horas. Tenga en cuenta la morfología de la placa distintos producidos por cada uno de los fagos. Destructores (A) forma pequeño (diámetro medio de aproximadamente 1 mm), las placas claras característica de un fago líticomientras que MSSS (B) se desarrolla gran "ojo de buey" placas con centros claros rodeados por un halo turbio (diámetro medio de aproximadamente 3,2 mm). El anillo nebuloso puede estar compuesta de bacterias que son resistentes a la infección por fagos. Este patrón es distinta de la formada por fago lisogénico, que producen placas turbias.

Figura 13
Figura 13. Ejemplo de resultado con réplica de la placa de procedimiento. Cuatro cepas de Pseudomonas aeruginosa (P., P. putida, P. fluorescens y P. stutzeri) fueron analizados por duplicado para el crecimiento en tres diferentes fuentes de carbono: acetamida, la lactosa y la glicina. (A) La placa principal es un medio completo (YTA) inoculados con las cuatro cepas indicadas. Tras la incubación a 30 ° C durante 24 horas, las cuatro cepas crecen en YTA. La placa principal se utilizó para la placa de réplica en un mínimo de mímediano (MSA), complementado con una sola fuente de carbono: acetamida (B), lactosa (C), y glicina (D). La última placa de la serie fue un control positivo YTA placa (E). Como se muestra, las cepas muestran patrones variables de crecimiento después de la incubación en las placas secundarias. Nótese que es a veces difícil distinguir entre el crecimiento y una huella de las células. Por ejemplo, comparar la huella generada por P. stutzeri en las tres placas de MSA a ningún crecimiento en mismas tres placas por P. aeruginosa. Ambos son resultados negativos en comparación con los patrones de crecimiento exhibidos por P. putida y P. fluorescens. Sin embargo, todas las cepas crecen en las células de la placa de control positivo confirmando fueron transferidos a todas las placas secundarias en la serie. Los resultados de este experimento están tabulados en la Tabla 1.

YTA
(Primario)
MSA +
acetamida
MSA +
lactosa
MSA +
glicina
YTA
(Control)
P. aeruginosa + - - - +
P. putida + + + + +
P. fluorescens + + + + +
P. stutzeri + - - - +

Tabla 1. Resumen de resultados de la siembra de réplica. Crecimiento indicado como signo más (+) y ningún crecimiento representa como signo menos (-). YTA es un medio completo (agar triptona levadura) y MSA es un medio mínimo (agar mínimo de sales). Las placas de MSA se complementaron con una sola fuente de carbono como se indica.

Discussion

El cultivo de microorganismos implica una serie de métodos para galvanizado, todas las cuales requieren que la técnica aséptica se mantiene durante toda la manipulación de las células y los medios. Cinco diferentes procedimientos se describen en este protocolo. Aunque estas técnicas de recubrimiento se utilizan habitualmente para manipular las bacterias y los fagos, también puede ser aplicado a cultivos de células de mamíferos y microorganismos eucarióticos comúnmente utilizado en la genética molecular tales como la levadura (es decir, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), algas y protozoos ( es decir, Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium), y los nematodos (es decir, el Caenorhabditis elegans). También son numerosos (y aún más sofisticados) las variaciones de cada técnica de siembra en función del objetivo experimental u organismo objeto de estudio. Por lo tanto, es importante no sólo seleccionar la técnica más adecuada para un microorganismo dado experimento u objetivo, sino también para adaptar la metodología t talessombrero de los resultados experimentales se ocupe adecuadamente de la pregunta de investigación o problema.

Algunas de las aplicaciones más actuales de las técnicas de recubrimiento descritos en este protocolo la que producen los avances tecnológicos de alto rendimiento para los resultados de los experimentos de detección de drogas y de descubrimiento. Por ejemplo, centros de secuenciación del genoma de utilizar el "Método de Copacabana" de bibliotecas de clones de enchapado propagación, que son E. células de E. transformadas con plásmidos que contienen fragmentos de ADN derivadas del genoma de un microorganismo. Debido a decenas de grandes placas (llamado bandejas bioensayo) se preparan a la vez, un agitador de placas automático se utiliza para agitar las perlas de vidrio para todo el lote de bandejas. Por otra parte, la selección de colonias de estas placas después de la incubación, un selector de la colonia robótica se utiliza para recoger las células de las colonias adecuadas como el inóculo de caldo de LB en microplacas de 384 pocillos. Para este ensayo de cribado de alto rendimiento, los principios procesales de la difusión-ptécnica de fines de aplicar, pero la tecnología permite a los distintos pasos a ser automatizado y ampliado para permitir un gran número de muestras a analizar de forma simultánea y en un corto período de tiempo.

Las empresas de biotecnología y farmacéuticas invierten recursos considerables en el desarrollo de tecnología de alto rendimiento para las técnicas más básicas de microbiología y genética molecular. Por ejemplo, hay varios canales Micropipetas para realizar transferencias de volumen de hasta 8 ó 12 muestras a la vez. Incluso hay estaciones de trabajo robóticos que maniobra una cabeza de 96 canales de pipeta! Estos esfuerzos implican equipos multidisciplinares de científicos, biólogos vinculación que poseen los conocimientos metodológicos con los ingenieros y programadores de computadoras que pueden desarrollar los instrumentos necesarios para realizar las operaciones mecánicas asociadas a los experimentos. Independientemente de la aplicación de la investigación, el objetivo compartido por empresas que desarrollan estas tecnologías es la misma - para automatizar los laboratoriosry procesos, herramientas, sistemas e instrumentos, haciéndolos menos mano de obra intensiva y más eficiente.

Disclosures

No tengo nada que revelar.

Acknowledgments

Un agradecimiento especial a Cori Sanders en los diseños de Iroc para la preparación de las ilustraciones y Kris Reddi y Bhairav ​​Shah en la UCLA para el establecimiento de cultivo de las muestras y ayudando con las cifras. Los fondos para este proyecto fue proporcionado por el HHMI (HHMI Grant N º 52.006.944).

Materials

1. Yeast Tryptone Agar (YTA)

Yeast extract 2.0 g
Tryptone 10.0 g
Agar 15.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml
pH 7.0

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

If preparing tubes for the pour-plate procedure, allow the agar to cool to ~55°C then add 2.0 ml of 50 mg/ml cycloheximide. Aseptically dispense 18.0 ml of the melted agar per 18 mm tube then store at 4°C. The agar will solidify and will need to be melted in a steamer or microwave prior to use.

2. Minimal Salts Agar (MSA) + 0.1% (w/v) carbon source

NH4Cl 1.0 g
NH2HPO4•2H2O 2.14 g
KH2PO4 1.09 g
MgSO4•7H2O 0.2 g
Carbon source* 1.0 g
Trace salts solution** 10.0 ml
Agar 15.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml
pH 7.0

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

* Carbon sources used for experiments presented in Figure 13 include acetamide, lactose, and glycine.

** Trace salts solution is prepared in 0.1 N HCl as follows. It is added to the base before sterilization (autoclave at 121°C for 20 minutes).

FeSO4•7H2O 300.0 mg
MnCl2•4H2O 180.0 mg
Co(NO3)2•6H2O 130.0 mg
ZnSO4.7H2O 40.0 mg
H2MoO4 20.0 mg
CuSO4•5H2O 1.0 mg
CaCl2 1000.0 mg
HCl (0.1 N) up to 1000.0 ml

3. EHA soft agar (0.65 % w/v)

Agar 6.5 g
Tryptone 13.0 g
NaCl 8.0 g
Na Citrate•2H2O 2.0 g
Glucose 3.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

4. EHA hard agar (1.2% w/v)

Agar 12.0 g
Tryptone 13.0 g
NaCl 8.0 g
Na Citrate•2H2O 2.0 g
Glucose 3.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

5. 1X Middlebrook Top Agar (MBTA soft agar, 0.5% w/v)

100 mM CaCl2 stock* 1 ml
7H9 liquid medium: Neat ** 50 ml
2XTA *** 50 ml

Melt 50 ml of 2XTA and allow it to cool to ~55°C. Using aseptic technique, add the CaCl2 and 7H9 broth to the melted agar. Aseptically dispense 4.5 ml of the mixture per 13 mm tube and store in a 55°C incubator ≤7 days. Cooling MBTA to room temperature or 4°C will cause the CaCl2 to precipitate out of solution.

* 100 mM CaCl2. stock must be stored at room temperature to prevent CaCl2 from precipitating out of solution.

** 7H9 liquid medium: Neat

7H9 broth base 4.7 g
40% glycerol stock 5 ml
Distilled water up to 900.0 ml

Mix the base with water then add the glycerol while stirring. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1.0% w/v)

7H9 broth base 4.7 g
Agar 1.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Dispense 50 ml aliquots into 100 ml bottles and store at 4°C.

6. Middlebrook 7H10 Agar Plates (MHA hard agar, 1.9% w/v)

7H10 agar base 19.0 g
40% glycerol stock 12.5 ml
Distilled water 887.5 ml

Mix the agar base with water then add the glycerol while stirring. Heat the solution to boiling then stir for one minute to completely dissolve the base powder. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add the following reagents:

AD supplement (pre-warmed to 37°C)* 100 ml
50 mg/ml Carbenicillin ** 1.0 ml
10 mg/ml Cycloheximide ** 1.0 ml

* AD supplement

NaCl > 17 g >
Albumin (Fraction V)> 100 g>
Dextrose (D-Glucose)> 40 g>
Distilled water> up to 2000.0 ml>

Filter-sterilize this solution; do not autoclave. Store at 4°C.

** Filter-sterilize and store these solutions at 4°C for ≤60 days.

7. LB agar (1.5% w/v) + X-Gal (60 μg/ml)

Tryptone 10.0 g
Yeast extract 5.0 g
NaCl 10.0 g
Agar 15.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml
pH 7.5 at 25°C

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add 3.0 ml of 20 mg/ml X-Gal solution. Freshly prepare X-gal stock by dissolving 400 mg X-Gal in 20 ml dimethylformamide (DMF).

Table of specific reagents:

Name of the reagent Company Catalogue number
Yeast extract Becton Dickenson 212750
Tryptone Becton Dickenson 211705
Agar Becton Dickenson 214030
NH4Cl Acros Organics 123340010
NH2HPO4•2H2O Sigma-Aldrich 30435
KH2PO4 Fisher Scientific BP 303-500
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 230391
Acetamide Sigma-Aldrich A-0500
Lactose Fisher Scientific L6-500
Glycine Sigma-Aldrich G-7126
FeSO4•7H2O Sigma-Aldrich F8048
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M-3634
Co(NO3)2•6H2O Sigma-Aldrich 230375
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z4750
H2MoO4 Acros Organics 213621000
CuSO4•5H2O Sigma-Aldrich 209198
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
HCl Fisher Scientific A144-212
Cycloheximide Sigma 038K1561
Carbenicillin Cellgro 46-100-RG
NaCl Fisher S271-1
Na Citrate•2H2O Fisher S279-500
Glucose (Dextrose) BD 215530
7H9 broth base BD 271310
7H10 agar base BD 262710
Glycerol Shelton IB15760
Albumin (Fraction V) Fisher S71907
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Teknova X1205
Dimethylformamide (DMF) Sigma D4551
Ethanol Fisher CDA19
Chlorine Bleach Chlorox 02490/06644884
CiDecon (disinfectant) Decon Laboratories, Inc. 8504

Table of specific equipment:

Name of equipment Company Catalogue number Experiment
Metal loops American Educational Products S17352 Streak plating
Disposable plastic loops Fisher 22-363-602 Streak plating
Wooden sticks Fisher 23-400-104 Streak plating
Flat Toothpicks American Educational Products S67859 Streak plating
Turn tables Fisher 08-758Q Spread plating
Glass rods Bellco Glass NC9004380 Spread plating
4 mm glass beads Fisher 11-312B Spread plating
Velveteen cloth Bel-Art Products 09-718-2 Replica plating
Cylindrical block Bel-Art Products 09-718-1 Replica plating

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References

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  28. Introductory Course in Microbiology. Available from: http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html (2012).

Comments

2 Comments

  1. I am not sure why you keep lots of care flaming your clean loop starting at the base and then up to the loop, but in contrast, flame directly the loop when it is full of bacteria.
    My suggestion is to flame always starting from the bottom of the wire and then up to the loop, which in theory may reduce the amount of aerosols produced.

    Reply
    Posted by: Ed K.
    June 8, 2012 - 11:02 PM
  2. Shouldn't the scientist be using gloves?

    Reply
    Posted by: Josh F.
    June 30, 2012 - 3:15 PM

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