Biofysiska analyser för att undersöka mekaniska egenskaper Interphase cellkärnan: grundmaterial Sila Ansökan och Microneedle Manipulation

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterar två oberoende, mikroskop-baserade verktyg för att mäta den inducerade kärnkraft och cytoskelettala deformationer i singel, lever fastsittande celler som svar på globala eller lokala stam ansökan. Dessa tekniker används för att bestämma nukleära stelhet (dvs deformerbarhet) och sond intracellulära kraftöverföring mellan kärnan och cytoskelettet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lombardi, M. L., Zwerger, M., Lammerding, J. Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation. J. Vis. Exp. (55), e3087, doi:10.3791/3087 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I de flesta eukaryota celler, är kärnan största organell och är vanligen 2 till 10 gånger styvare än det omgivande cytoskelettet, varför de fysiska egenskaperna hos kärnan väsentligt bidra till den totala biomekaniska beteende celler under fysiologiska och patologiska förhållanden. Till exempel i flyttande neutrofiler och invaderande cancerceller kan kärnkraft stelhet utgöra ett stort hinder vid extravasering eller passage genom smala utrymmen i vävnader. 1 Å andra sidan kräver den kärna av celler i mekaniskt aktiv vävnad såsom muskler tillräckligt strukturstöd till tåla upprepade mekaniska påfrestningar. Viktigt är kärnan tätt integrerade i den cellulära strukturen, det är fysiskt ansluten till den omgivande cytoskelettet, vilket är ett viktigt krav för den intracellulära förflyttning och positionering av kärnan, exempelvis i polariserade celler, synaptiska kärnor vid neuromuskulära korsningar, eller att migrera celler. 2 Föga förvånande har mutationer i kärnhöljet proteiner såsom lamins och nesprins, som spelar en avgörande roll för hur kärnkraft styvhet och Nucleo-cytoskelettala kopplingen visats nyligen att resultera i ett antal mänskliga sjukdomar, bland annat Emery- Dreifuss muskeldystrofi, lem-gördel muskeldystrofi och dilaterad kardiomyopati. 3 Att undersöka biofysiska funktion av olika kärnhöljet proteiner och effekten av specifika mutationer har vi utvecklat experimentella metoder för att studera de fysiska egenskaperna hos kärnan i enda, levande celler utsätts för global eller lokal mekanisk störning. Mätning inducerad kärnkraft deformationer som svar på exakt tillämpas substrat stam ansökan ger viktig information om deformerbarhet av kärnan och tillåter kvantitativa jämförelser mellan olika mutationer eller cellinjer bristfällig för specifika kärnhöljet proteiner. Lokaliserad cytoskelettala stam ansökan med en microneedle används som komplement till denna analys och kan ge ytterligare information om intracellulära kraftöverföring mellan kärnan och cytoskelettet. Att studera kärnkraft mekaniker i intakta levande celler bevarar den normala intracellulära arkitektur och undviker potentiella artefakter som kan uppstå när man arbetar med enstaka kärnor. Dessutom presenterar substrat stam ansökan en bra modell för fysiologisk stress som upplevs av celler i muskler eller andra vävnader (t.ex. vaskulär glatt muskulatur celler som utsätts för fartyg stam). Slutligen är dessa verktyg har utvecklats främst för att studera kärnkraft mekaniker, kan de också användas för att undersöka funktionen hos cytoskelettala proteiner och signalering mechanotransduction.

Protocol

1. Substrat stam ansökan

Mätningen av normaliserade nukleära stam innefattar beredning av stam rätter med transparent, elastiskt silikon membran som cellodling yta, plätering celler på disken, och hämta bilder av cellerna före, under och efter (enaxlig eller tvåaxiala) stam ansökan.

Beredning av maträtter silikon membran och efterlevnad av celler

  1. Varje stam maträtt består av en skräddarsydd bottenlösa plast skålen med en diameter på 3 "och en plast O-ring för att hålla ett silikon-membran, som fungerar som cellodling underlaget. Vid beredning av stam rätter, klämma en 4" x 4 "bit av silikon membran mellan O-ringen och skålen. skär försiktigt bort överflödigt membran, skölj med avjoniserat vatten, och autoklavera stammen rätter.
  2. Markera en referenspunkt i botten mitten av membranet (på utsidan) innan beläggning silikon membran med extracellulära matrix molekyler (t.ex. fibronektin). Denna milstolpe kommer att hjälpa till att identifiera samma celler under stammen experiment. (Valfritt: För enaxlig belastning ansökan, är två parallella ränder av tejp appliceras runt referenspunkt för att begränsa deformation av membranet i en dimension.)
  3. Att ge optimal cellbindning, belägga silikon membran med 3 mikrogram / ml fibronektin utspädd i 10 ml PBS eller någon lämplig extracellulära proteiner matris. Täck stam skålen med en inverterad 10 cm polystyren maträtt, och inkubera rätterna över natten vid 4 ° C.
  4. Nästa dag, skölj membran gång med Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna överskott protein. Fyll skålen med 10 ml odlingsmedium (Dulbecco ändrade Eagles medium (hög glukos) kompletterad med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin) och ställ åt sidan.
  5. Mus embryonala fibroblaster är trypsinized med 0,05% trypsin och seedad i tillväxt medium vid cirka 30% sammanflödet på belagd silikon membran skålen och inkubera i 24 - 48 timmar under normala odlingsförhållanden.

Substrat stam experiment

  1. Set-up mikroskop för experiment. Försöken görs på ett inverterat mikroskop med en digital kamera anpassad för fluorescensmikroskopi, faskontrast eller DIC, med hjälp av en 60x saklig och relevant bild förvärv programvara (t ex IPLab eller metamorfa). En upprätt mikroskop är inte lämplig för denna applikation. Stammen Enheten består av en bottenplatta som passar in på mikroskop scenen och har en central cylindrisk valsen som tjänar till att gälla påfrestning till den centrala delen av silikon membran, en rörlig platta som håller stammen skålen och som kan glida upp och ner på fyra vägledning stift, samt en 5-kg viktplatta att tillämpa en belastning.
  2. För att visualisera kärnor, inkubera cellerna i stam skålen med 1 mikrogram / ml Hoechst 33.342 i 15 min vid 37 ° C. Sug av mediet och ersätt med 15 ml fenol-röd utan tillväxt medium (fenol-röd utan Dulbecco ändrade Eagles Medium (högt glukos) med 25 mm Hepes, kompletterad med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin). Skruva fast stam skålen i skålen hållaren plattan. Applicera fett (Braycote 804 Vacuum Grease) till omkretsen på botten av silikon membran för att glida av membranet längs centrala valsen. Se till att hålla den centrala delen av membranet tydlig.
  3. Placera bottenplattan på mikroskop scenen. Montera skål hållare plattan försiktigt på bottenplattan. Se till att i första viloläge, silikon membran av stammen maträtt löst bygger på den centrala glaset.
  4. Först, fokusera på botten av silikon membran och hitta det centrala svarta referens prick. Punkten kommer att fungera som utgångspunkt för alla bild förvärv och hjälpmedel att hitta samma celler under och efter stretch. Vi använder en anpassad skrivna automatiserad bildbehandling program för att lagra positionerna av celler och att flytta dessa celler under försöket, men detta kan också uppnås manuellt.
  5. Från och med pricken, justera fokus att visualisera celler och toppen av silikon membran. Leta väl spritt celler med centralt placerade kärnor och skaffa en fas kontrast och en fluorescens bild av det nukleära Hoechst fläcken. Den faskontrast bilden bör fokusera på cellen disposition och silikon membran, medan fluorescens bilderna bör fokusera på det centrala planet av kärnan.
  6. Efter förvärvet bilder på 5 till 15 celler, flytta tillbaka till den centrala punkten. Sakta gäller vikten till stammen skålen, vilket resulterar i en enhetlig stam ansökan i mitten av skålen. Den maximala tillämpas substratet stammen begränsas av nylon distanser placeras på den lodräta justeringen stift (vägledning stift).
  7. Fokus på botten av silikon membran och lokalisera referens prick igen. Från och medpunkt, flytta samma celler och igen skaffa en fas kontrast och en fluorescens bild av cellerna och kärnorna under full belastning, försöker att noga matcha fokalplan av den ursprungliga bilderna. Denna process bör inte överstiga 10 minuter för att undvika aktiva ombyggnad och anpassning av cellen till ansträngda underlaget.
  8. Efter att alla motsvarande bilder har förvärvats, flytta mikroskop skede tillbaka till startpunkten. Ta försiktigt bort vikten från skålen innehavaren plattan och låt silikon membran att slappna av. Om nödvändigt, tryck försiktigt upp den stam skålen tills den är i utgångsläget. Sedan förvärva faskontrast och fluorescens bilder av post-stam celler som beskrivs ovan för stammen bilder.

Analys

  1. Bilder av celler och fluorescerande kärnorna före, under och efter ansträngning tillämpning analyseras för att beräkna normaliserade nukleära stammen. I vårt laboratorium använder vi en anpassad skrivna MATLAB manus för analys, men flera alternativ finns. Analysen görs i tre steg.
  2. Först för att beräkna debiterad substratet stam, är positionerna 3 till 6 kontrollpunkterna ligger på membranet manuellt matchas mellan motsvarande pre-, full, och efter stam bilder. MATLAB Programmet beräknar sedan tillämpas membranet stammen genom att jämföra de positioner matchande kontrollpunkter mellan pre-stam och full stam bilder och även den kvarvarande spänningar mellan före stam och efter stam bilder. Samtidigt är de kontrollpunkter som används för att registrera bilden paren, vilket kommer att bidra till att upptäcka skadade eller demonteras cellen (se figur 1).
  3. I ett andra steg är kärnor manuellt valda med hjälp av en separat MATLAB-program som beräknar kärnkraft stam för varje enskild kärna genom att matcha antingen kärnkraft storlek eller intranuclear markörer mellan motsvarande pre-, full, och efter stam fluorescerande bilder. Att ta hänsyn till små variationer i tillämpad membran spänningar mellan olika experiment, uttrycker vi resultat som normaliserade Nuclear Sila, definierat som förhållandet mellan inducerade kärnkraft stam till tillämpad membran stam som beräknas för varje kärna. MATLAB-skript finns tillgängliga från Lammerding laboratoriet på begäran.
  4. Slutligen är varje kärna validerad, med undantag av mätningar från celler som lossnar eller blir skadad under stam ansökan (Figur 1).

2. Microneedle manipulation analys

Beredning av maträtter, anhängare celler och mikronålar

  1. Inkubera 35 mm glas botten rätter cellodling med en låg koncentration av fibronektin (0.5ug/ml) i Hanks Buffered Salt saltlösning (HBSS) eller någon lämplig extracellulära proteiner matris för 2 timmar vid 37 ° C. Tvätta rätter med HBSS två gånger och tillsätt 2 ml av tillväxten på medellång och skålen innan du fortsätter till nästa steg.
  2. Mus embryonala fibroblaster är trypsinized med 0,05% trypsin och seedad i 2 ml odlingsmedium seedade på 7,5 x 10 4 celler / ml på fibronektin-belagda rätter glas botten. Placera cellerna tillbaka i kuvös över natten. Placera cellerna tillbaka i kuvös över natten. Man bör optimera antalet celler för att få singel, anhängare, icke-konfluenta celler för andra celltyper.
  3. Dra mikronålar, tillverkad av borosilikatglas kapillärer, att tippa diameter på ca 1 till 3 mikrometer med en kommersiell pipett avdragare (t.ex. Sutter Instrument Company).

Microneedle manipulation experiment

  1. Nästa dag Inkubera cellerna med MitoTracker mitokondrie-bets (600 mikroM, Invitrogen) och Hoechst 33.342 kärnvapen fläcken (1 mikrogram / ml) tillsätts grogrund för 30 minuter i en 37 ° C inkubator.
  2. Tvätta cellerna en gång i HBSS i 5 minuter i rumstemperatur och lägg sedan till fenol-röd utan tillväxt medium till cellerna för avbildning.
  3. Förvärva en bild av en enda cell utan microneedle in i cytoskelettet i fas däremot en fluorescerande bilden av Hoechst 33.342 fläcken och en fluorescerande bild av mitokondriella fläcken, med en 60x objektiv (0,70 NA, Plan-Achromat) på en inverterad mikroskop med en digital chipet kamera.
  4. Med hjälp av en mikromanipulator (t.ex. InjectMan NI 2, Eppendorf), försiktigt in microneedle i cytoplasman i en cell ett fast avstånd (typiskt 5 mikrometer) från den nukleära periferin och ta en bild faskontrast, en fluorescerande bild av Hoechst 33.342 fläcken och en fluorescerande bild av den mitokondriella fläcken. För denna tillämpning, hjälper det att kontrollera mikromanipulator via en dator, t.ex. Windows Hyperterminal, att uppnå konsekvent mikromanipulation förfaranden.
  5. Flytta microneedle, ett visst avstånd (typiskt 10 eller 20 mikrometer) mot cellen periferin på 1 mikrometer / sek och samtidigt samla fluorescens och faskontrast bilder var 10: esekunder. Som microneedle flyttar till ett visst avstånd mot cellens periferi. Med den valda parametrar, eftersom microneedle flyttar till ett visst avstånd mot cellens periferi, kommer detta att motsvara 2-3 ramar under manipulation processen.
  6. Slutligen förvärva ytterligare bilder efter microneedle tas bort från cytoskelettet.

Analys

  1. Deplacement kartor beräknas med hjälp av en specialbyggd skriftligt MATLAB manus baserat på spårning fluorescerande funktioner i kärnan och cytoplasman. (Den MATLAB manus är tillgänglig från Lammerding laboratoriet på begäran). Programmet använder ett normaliserat korskorrelation algoritm mellan små delar av bilden (ca 10 mikrometer x 10 mikrometer i storlek och radavstånd 5 ìm mellanrum) i efterföljande bildrutor. För varje region centrum, x-och y-led förskjutningen i är beräknas som en övergång mellan den ursprungliga platsen och nyligen identifierade position och visas som en förskjutning vektor och även lagras som numeriska värden. Från förskjutning kartor kan genomsnitt förskjutningar inom givna områden beräknas. Observera att cytoskelettala förskjutningar är baserade på fluorescens kanal för cytoskelettala markörer (t.ex. MitoTracker mitokondrie fläck), medan kärn förskjutningar beräknas från fluorescens kanal motsvarar Hoechst 33.342 signalen. För vår ansökan undersöker vi rutinmässigt följande områden: (i) cytoskelettala stam vid stam applikationsstället, dvs microneedle insättningsstället, (ii) kärnkraft stam i en region inuti kärnan mot stammen applikationsstället, (iii) kärnkraft stam i en nukleär region bort från appliceringsstället och (iv) cytoskelettala stam i en cytoplasmiska region över kärnan. Dessutom kan man också direkt mäta kärnkraft töjning från faskontrast eller Hoechst 33.342 fluorescens bildsekvenser. I detta fall gäller kärnkraft stammen beräknas genom att dividera den nukleära töjning (ΔL = L - L 0) av den ursprungliga längd, L 0, där L är den slutliga längden på kärnan i slutet av stammen ansökan och L 0 är initiala längd kärnan. För celler med en intakt Nucleo-cytoskelettala koppling, kommer kärnan förlänga mot stammen appliceringsstället. Däremot i celler där Nucleo-cytoskelettala koppling avbryts, dvs finns krafter överförs mindre effektivt mellan cytoskelettet och kärnan, är kärnan förväntas förlänga betydligt mindre i riktning av stammen applikationsstället. Således minskade kärn deformationer som svar på cytoskelettala stam ansökan innebär en (partiell) frikoppling mellan kärnan och cytoskelettet.

3. Representativa resultat:

Substrat stam ansökan

Vi förvärvade bilder före, under och efter stam ansökan till musen embryonala fibroblaster från heterozygota och homozygota Lamin A / C-brist (Lmna + / - och Lmna - / -) och vildtyp (Lmna + / +) möss och därefter beräknas de normaliserade nukleära stam för varje cell. Efter analys, är de kärnor validerade och celler som skadas eller in under stam ansökan undantas från analysen. Figur 1A visar kärnor av tre celler som är giltiga, medan Figur 1B visar celler som bör undantas från analysen. Normaliserad nukleära stam uppgifter sammanförs från minst tre oberoende försök (som vardera innehåller mätningar från ~ 5-10 kärnor) och jämfört med andra celler eller grupper behandling av statistisk analys. Ökad normaliserade nukleära stam indikerar minskad kärnkraft stelhet, som sett i celler med nedsatt uttryck av kärnhöljet proteiner Lamin A / C (figur 2).

Microneedle manipulation analys

För microneedle manipulation analysen avbildas vi kärnkraft och cytoskelettala förskjutningar under lokaliserad cytoskelettala stam ansökan. Celler som skadas eller lossnar undantas från analysen. För analysen mäter vi storleken på de nukleära och cytoskelettala rörelser mot våld applikationsstället i singel, anhängare celler. Till exempel i figur 3, spårar vi mitokondrie (markör för cytoskelettet) förskjutningar före och efter cytoskelettala stam och sedan plotta förskjutningar som vektorer. Varje vektor representerar förskjutningen beräknas som en övergång mellan den ursprungliga platsen och nyligen identifierade position. Regioner med låg bilden intensitet eller otillräcklig textur (t.ex. regioner utanför cellen) utesluts från analysen. Den cytoskelettala och nukleära förskjutningar är sedan kvantifieras välja områden att öka avstånd från stammen applikationsstället (Figur 4, områden som motsvarar de färgade boXES i infälld). I möss embryonala fibroblaster med intakt Nucleo-cytoskelettala koppling, finns krafter som överförs via hela celler, vilket resulterar i inducerade kärnkraft och cytoskelettala deformationer som sakta försvinna bort från stammen applikationsstället (Figur 4). Däremot fibroblaster med störd Nucleo-cytoskelettala koppling (eller ändras cytoskelettala organisation) visa lokaliserade förskjutningar i närheten av applikationsstället, som visas i Figur 4 och bara lite inducerad deformationer längre bort. Jämförbara cytoskelettala stam ansökan vid microneedle insticksstället (Orange Box) har observerats för både kontroll fibroblaster (mCherry ensam) och fibroblaster med en störd Nucleo-cytoskelettala koppling (DN Kash). Emellertid var framkallade kärnkraft och cytoskelettala förskjutningar (blå, gul och röd lådor) på andra områden betydligt mindre i fibroblaster med störd Nucleo-cytoskelettet koppling (DN Kash) än i kontroll celler (mCherry ensam) (Figur 4). Således minskade cytoskelettala och kärnkraft förskjutningar bort från stammen applikationsstället, tyder på att kraftöverföring mellan cytoskelettet och kärnan var störd.

Allt har vi validerat också att mitokondrierna är lämpliga cytoskelettala markör, genom att bedriva microneedle manipulation på musen embryonala fibroblaster transfererats med GFP-eller mCherry aktin och GFP-vimentin och fluorescerande med Mitotracker grönt eller rött. Cytoskelettala förskjutning kartor beräknades oberoende av fluorescerande signal mitokondrier och aktin eller vimentin cytoskelettet. Den genomsnittliga absoluta deplacement beräknades för fyra olika cytoskelettala regioner till att öka avstånd från stammen appliceringsstället. Lutningen och R-kvadrat värde beräknades från den linjära regressionen mellan de mätresultat som erhållits från mitokondrier och från aktin eller vimentin, respektive. För aktin var lutningen 0,99 och R 2-värdet var 0,986, för vimentin var lutningen 1,04 och R2-värdet 0,971, vilket bekräftar att mitokondriell förskjutningar fungera som tillförlitliga indikatorer för cytoskelettala deformationer.

Figur 1
Figur 1. Substrat påfrestningar program på möss embryonala fibroblaster (MEFs). Mouse embryonala fibroblaster spridda över två olika områden på kisel membranet var avbildade med faskontrast och fluorescensmikroskopi före, under och efter applicering av 20% enaxlig belastning. (A) Exempel på ett lyckat experiment med giltiga kärnor från celler som överlevde stammen programmet utan någon skada eller avskildhet och (B) Exempel på celler som dras in / delvis lossnat under stam ansökan, (B) resultat från cellerna avbildas i exkluderas från analysen. I (B), visar cellen till vänster tecken på cytoskelettala skador och nukleära kollaps (pil), medan cellen på höger sida lossnar delvis och in under stam ansökan. Detta kan vara en indikation på påfrestningarna ansökan. För bättre jämförelse i (A) och (B) till gränsen till något av de töjning cellmembran beskrivs i rött och överlagras på samma cell under och efter ansträngning ansökan. I (A) gränsen till töjning kärnan beskrivs i grönt och överlagras på samma kärna under och efter ansträngning ansökan.

Figur 2
Figur 2. Analys av normaliserade kärnkraft stam i en panel av olika linjer MEF celler MEFs av Lmna -. / - Och Lmna + / - genetisk bakgrund ectopically antingen uttrycker en tom vektor-eller vildtyp Lamin A analyserades. I jämförelse med MEFs från vildtyp kullsyskon (Lmna + / +), förlust av Lamin A / C uttryck resulterar i minskad kärnkraft styvhet som kan helt återställd genom återinförande av vildtyp Lamin A. I synnerhet minskad kärnkraft stelhet reflekteras av förhöjda värden av normaliserade kärnkraft påfrestningar. Felet staplarna representerar standard fel.

Figur 3
Figur 3. Microneedle manipulation analys för att mäta intracellulära kraftöverföring. Faskontrast (A, B) och fluorescens (C, D) bilder av en fibroblast märkta med nukleära färg (blå) och MitoTracker mitokondrie-bets (grön). En microneedle infördes i cytoskelettet i ett definierat avstånd från kärnan (A och C) och därefter gick mot cellen periferin (B, D). Cytoskelettala och nukleära förskjutningar kvantifierades genom att spåra fluorescerande cellkärna och mitokondrier med en anpassad skrivna korskorrelation algoritm. (E) förskjutningskarta den slutliga cytoskelettala (grön) deformationer beräknas från fluorescens bildserie, pil längden förstoras med 2x för bättre visibiatt upprätthålla prisstabilitet. Skala barer, 10 mikrometer.

Figur 4
Figur 4. Analys av intracellulära kraftöverföring under microneedle manipulation. Inducerad cytoskelettala och nukleära förskjutningar under microneedle manipulation, mätt i områden som motsvarar de färgade rutorna (infälld i A). The Orange Box är den stam appliceringsstället. Trots liknande stam tillämpning i cytoskelettet (orange box) inducerad, kärnkraft och cytoskelettala förskjutningar (blå, gul och röd boxar) var signifikant mindre i musen embryonala fibroblaster att med en störd Nucleo-cytoskelettala koppling (DN Kash) jämfört med kontroll ( mCherry ensam) celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Substrat stam analys

Sila ansökan med framgång har använts av oss och andra grupper för att studera inducerade kärnkraft deformationer i celler utsätts för mekanisk stress och att undersöka bidrag från särskilda kärnhöljet proteiner till kärnkraft stelhet. 4-8 Fördelen med denna teknik är att den sonder mekaniska egenskaper att leva kärnor i sin normala cellulära och cytoskelettala miljö och att substratet stammen ansökan liknar fysiologiska belastning ansökan som finns i många vävnader såsom upphandlande muskler eller blod väggar fartyget. 9 Dessutom möjliggör den stam ansökan till många celler parallellt, öka antalet av celler som kan analyseras i ett enda experiment. En begränsning av underlaget stam-analysen är att den inte tillåter direkta mätningar av nukleära styvhet. Istället avgör den här metoden den relativa styvheten i kärnan i förhållande till omgivande cytoskelettet. Detaljerad analys av inducerad kärnkraft och cytoskelettala stam i celler utsätts för enaxlig substrat stam visar att det i vildtyp celler är cytoskelettala stammen jämförbar med den tillämpade substratet stammen, medan den styvare kärnan deformeras betydligt mindre. 4 dock ytterligare analyser, såsom den microneedle manipulation analysen, kan det vara nödvändigt att säkerställa att observerade skillnader i kärnkraft deformation mellan olika cellinjer är inte resultat av förändrade Nucleo-cytoskelettala koppling eller cytoskelettala struktur. Trots dessa begränsningar, mätning kärnkraft mekaniker i intakta celler snarare än i enstaka kärnor minimerar risken för artefakter orsakade av osmotiska effekter, skador under den isolering förfarande, eller andra förändringar i samband med kärn-isolering. Men det är ett strängt krav på substrat stam-analysen att celler ordentligt följa underlaget. För att förbättra cellulär adhesion, kan disken vara belagd med olika extracellulära matrix proteiner som fibronektin, kollagen eller laminin i varierande koncentrationer, rekommenderar vi att bestämma den optimala beläggningen för varje ny cell typ som används i försöken.

Dessutom, för optimalt resultat, måste tillämpas substratet stammen vara tillräckligt stort för att upptäcka kärnkraft deformationer samtidigt minimera skador på cellerna. För mus och mänskliga fibroblaster, tillämpar vi vanligtvis 5% tvåaxiala stam eller 20% enaxlig belastning utan uppenbara cellskador. I allmänhet finner vi att celler tolererar enaxlig belastning ansökan bättre än tvåaxiala stam ansökan, eftersom mindre förändringar av membran område krävs. När det gäller extracellulärmatrix beläggning bör optimala stam ansökan bestämmas för varje ny cellinje som ska testas.

Dessutom fann vi att experimenten är känsliga för cellen densitet. Experiment bör helst utföras på sub-konfluenta celler för att minimera cell-cell interaktioner, men cellen densiteter som är för låga resulterar ofta i dålig överlevnad av celler som svar på stam och i en låg avkastning på celler per experiment. Å andra sidan gör en cell densitet som är för hög det svårt att identifiera samma celler före, under och efter stam ansökan. Vi rekommenderar att testa optimala celltätheten för de enskilda celltyperna.

Ett annat viktigt råd för experimenten är att stammen ansökan bör begränsas till högst 10 minuter för att undvika cellulär anpassning, till exempel ombyggnad av cytoskelettala element. För detta ändamål möjliggör användning av automatiserade bildprogram, t.ex. IPlab, i kombination med en motordriven steg automatisk re-lokalisering av celler på stam skålen och snabbare bildtagning. Vidare använder vi anpassade skriven mjukvara bildanalys (t.ex. MATLAB) för dataanalys. Programvaran kräver vissa hållpunkter på membranet för att beräkna debiterad substratet stam, såsom tillämpad pricken, små självlysande pärlor eller tydliga oegentligheter på kisel membran. Slutligen är validering av varje kärna som krävs för att utesluta de skadade eller dra tillbaka celler, som kärnkraft deformationer mäts i dessa celler inte är representativa. En eventuell anpassning av underlaget stammen teknik är att använda substrat påfrestningar på celler odlade i tredimensionella kollagen geler, som tillåter analys av kärntekniska mekaniska egenskaper under mer fysiologiska förhållanden, samt att tillämpa metoden för att svagare anhängare celler. En annan variant är att använda micropatterned substrat, t ex, runda eller rektangulära fläckar av fibronektin på kisel membran, för att uppnå konsekvent cell spridning och anpassning under stammen ansökan. Slutligen, att bättre förstå nukleära mekaniker på en mer fysiologisk nivå kan cellulära belastning appliceras på hela vävnader i stället för isolerade celler. Vi håller på att lyckas med denna teknik för att mäta kärnkraft stelhet i modell organisationermekanismer som Drosophila melanogaster eller Caenorhabditis elegans.

Microneedle manipulation analys

Den microneedle manipulation analysen är en enda cell-baserad metod för att undersöka intracellulära kraftöverföring genom att kvantifiera inducerad kärnkraft och cytoskelettala förskjutningar efter lokaliserad cytoskelettala stam ansökan, och därigenom främja en tidigare metod uppfunnen av Maniotis och kollegor. 10 Denna teknik har flera fördelar jämfört med andra lokala kraft Ansökan metoder såsom magnetiska pincett eller optiska fällor. Till exempel kan stammen appliceras direkt på cytoskelettet och kan ändras varierande avstånd microneedle. Den microneedle kan också vara placerad i cellen med hög noggrannhet, vilket gör experimentet mycket reproducerbar, och kraften dosering, som är direkt relaterad till microneedle hastighet, kan justeras genom att den programmerade mikromanipulator. Däremot är de magnetiska kulor som används i magnetiska pincett och optiska fällor ofta slumpmässigt lokaliserad på den apikala cellulära ytan, och både optiska och magnetiska pincett generera tillräckliga krafter för att resultera i stor skala cytoskelettala deformationer i många celltyper. Även om det microneedle manipulation analysen är en invasiv teknik och det finns begränsad kontroll över vilka cytoskelettala strukturerar microneedle följer, kan vi bekräfta de resultat med mindre ingrepp (t.ex. substrat stam). Således microneedle manipulation och substrat stam är två kompletterande analyser som ger information om kärnenergi mekanik i intakta levande celler med bibehållen normal kärnkraft och cytoskelettala arkitektur och bevara den korrekta kemiska sammansättning nucleoplasm och cytoplasman.

I det följande föreslår vi att eventuella ändringar eller förbättringar. Om celler är alltför väl spridda, kan microneedle spetsen bryter mot glaset nedre skålen när man försöker placera den i tunna (~ 1-2 mikrometer) cytoskelettet. För att undvika dessa problem rekommenderar vi att testa en serie koncentrationer av extracellulärt matrix (ECM) molekyler, såsom fibronektin, kollagen, eller laminin, för att fastställa villkor som uppnår tillräcklig celladhesion utan att cellerna att sprida sig för tunt. En annan ändring kunde vara att plattan cellerna på ECM-belagda micropatterned ytor för att säkerställa en enhetlig cell spridning och inriktning. En extra eller kompletterande strategi skulle kunna vara till tallrik celler på ECM-belagda polyakrylamidgeler och för in microneedle igenom cytoskelettet i gelen att ställa upp enhetliga påfrestningar tillämpning i cytoskelettet. Användningen av en intakt och spetsig microneedle är absolut nödvändigt för att lyckas med experimenten. Vi drar rutinmässigt vår egen mikronålar, och man kan experimentera med olika former och storlekar. Alternativt kan en också köpa styckvis mikronålar med konsekvent geometri (t.ex. Eppendorf Femtotips). I varje fall är det viktigt att säkerställa att microneedle förblir oskadad under experiment, som en bruten microneedle spets, till exempel efter att ta kontakt med glassubstrat, skadar celler. Under microneedle manipulation själva förfarandet, är det viktigt att använda sig av samma hastighet och räckvidd microneedle rörelsen, som kärnan och cytoskelettet är viskoelastiska material med tidsberoende beteende. Vi rekommenderar att du använder en datorstyrd mikromanipulator, som också kommer att bidra till samordningen av microneedle rörelse och bild förvärv. Från vår erfarenhet kan Mitotracker av cytotoxiska därmed begränsa försöken till 30 minuter eller använda andra fluorescerande markörer, såsom GFP-aktin eller GFP-vimentin. En ändring av det tillvägagångssätt som beskrivs här, speciellt när man studerar Nucleo-cytoskelettala koppling, är att sätta microneedle in i kärnan istället för cytoskelettet och flytta den mot cellens periferi.

För alla studier på grund av den typiskt stor cell till cell variabiliteten ska experiment utföras minst tre oberoende gånger för att få mätningar från ett minimum av 15-25 totalt giltiga celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01 HL082792 och R01 NS059348) och Brigham and Women sjukhus Hjärt Leadership Group Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin EMD Millipore FC010
MitoTracker Red FM and Green FM Invitrogen M22425 and M-7514
H–chst 33342 Invitrogen H3570
Hank’s Buffered Salt Saline Invitrogen 14185
Phenol free, DMEM Invitrogen 21063
Fetal bovine serum Aleken Biologicals FBSS500
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100ML
Borosilicate Glass with filament Sutter Instrument Co. BF100-78-10
Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005" Specialty Manufacturing Inc.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200
35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Braycote 804 Vacuum Grease SPI Supplies 05133A-AB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
  2. Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
  3. Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy. J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).
  4. Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate. Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).
  5. Lammerding, J. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).
  6. Lammerding, J. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells. J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).
  7. Lammerding, J. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  8. Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors. Aging Cell. 7, 383-393 (2008).
  9. Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488, 459-469 (1995).
  10. Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics