Biophysical Assays अंतराप्रावस्था सेल नाभिक के यांत्रिक गुण जांच: सब्सट्रेट तनाव अनुप्रयोग और Microneedle हेरफेर

Biology

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Summary

हम दो स्वतंत्र, खुर्दबीन आधारित उपकरण का वर्तमान वैश्विक या स्थानीय तनाव आवेदन के जवाब में एकल, रहने वाले अनुयायी कोशिकाओं में प्रेरित परमाणु और cytoskeletal विरूपण को मापने के लिए. इन तकनीकों के परमाणु कठोरता (यानी, विरूपता) का निर्धारण और नाभिक और cytoskeleton के बीच intracellular बल संचरण की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है.

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Lombardi, M. L., Zwerger, M., Lammerding, J. Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation. J. Vis. Exp. (55), e3087, doi:10.3791/3087 (2011).

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Abstract

Protocol

1. सब्सट्रेट तनाव आवेदन

सामान्यीकृत परमाणु तनाव की माप पारदर्शी, सेल संस्कृति की सतह के रूप में लोचदार सिलिकॉन झिल्ली के साथ तनाव व्यंजन की तैयारी भी शामिल है, व्यंजन पर चढ़ाना कोशिकाओं, और पहले कोशिकाओं की छवियों (अक्षीय या द्विअक्षीय) तनाव के आवेदन के दौरान और बाद में प्राप्त.

सिलिकॉन झिल्ली व्यंजन और कोशिकाओं का पालन की तैयारी

  1. प्रत्येक तनाव पकवान 3 के एक व्यास के साथ एक कस्टम निर्मित अथाह प्लास्टिक पकवान होते x "और एक O-अंगूठी, प्लास्टिक के लिए एक सिलिकॉन झिल्ली, जो सेल संस्कृति सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है पकड़ तनाव व्यंजन की तैयारी के लिए, एक 4 दबाना है." 4 O-अंगूठी और पकवान के बीच सिलिकॉन झिल्ली के "टुकड़ा. सावधानी से दूर अतिरिक्त झिल्ली कट, विआयनीकृत जल से कुल्ला, और तनाव व्यंजन आटोक्लेव.
  2. झिल्ली के नीचे (बाहर पर) कोटिंग से पहले केंद्र में एक संदर्भ बिंदु चिह्नित बाह्य मैट्रिक्स अणु (जैसे, fibronectin) के साथ सिलिकॉन झिल्ली. इस ऐतिहासिक तनाव प्रयोगों के दौरान एक ही कोशिकाओं की पहचान में मदद करेगा. (वैकल्पिक: एक अक्षीय तनाव आवेदन के लिए, स्कॉच टेप के दो समानांतर धारियों संदर्भ बिंदु के आसपास लागू कर रहे हैं एक आयाम में झिल्ली के विरूपण प्रतिबंधित है.)
  3. 3 / μg मिलीलीटर, 10 मिलीलीटर पीबीएस या किसी उपयुक्त बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन में पतला fibronectin के साथ इष्टतम सेल अनुलग्नक, कोट सिलिकॉन झिल्ली प्रदान करते हैं. कवर के साथ एक औंधा 10cm polystyrene पकवान तनाव पकवान, और रात से अधिक व्यंजन 4 डिग्री सेल्सियस सेते
  4. अगले दिन, एक बार झिल्ली कुल्ला के साथ फास्फेट खारा (पीबीएस) buffered अधिक प्रोटीन को दूर. मध्यम विकास के 10ml (Dulbecco संशोधित ईगल्स मध्यम (उच्च ग्लूकोज) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) के साथ पकवान भरें और अलग निर्धारित करें.
  5. 48 घंटे सामान्य संस्कृति की शर्तों के तहत - माउस भ्रूण fibroblasts 0.05% trypsin और मध्यम विकास में वरीयता प्राप्त के साथ लेपित सिलिकॉन झिल्ली पकवान और 24 के लिए सेते हैं पर लगभग 30% संगम पर trypsinized हैं.

सब्सट्रेट तनाव प्रयोगों

  1. प्रयोगों के लिए माइक्रोस्कोप सेट अप. प्रयोगों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, चरण इसके विपरीत या डीआईसी के लिए अनुकूल एक डिजिटल कैमरा के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन कर रहे हैं, एक 60x उद्देश्य और उपयुक्त छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (उदाहरण के लिए, IPLab या Metamorph) का उपयोग कर. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप इस आवेदन के लिए उपयुक्त नहीं है. तनाव डिवाइस कि खुर्दबीन मंच पर फिट बैठता है एक बेस प्लेट के होते हैं और एक केंद्रीय बेलनाकार पट्ट है कि सिलिकॉन झिल्ली, एक जंगम थाली है कि तनाव पकवान धारण के मध्य भाग में तनाव लागू करता है और कहा कि ऊपर और नीचे स्लाइड कर सकते हैं रखती है चार मार्गदर्शन, पिन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक 5 पौंड वजन एक लोड को लागू करने के लिए थाली.
  2. आदेश में नाभिक कल्पना करने के लिए, 37 में तनाव डिश में कोशिकाओं 1 / 15 मिनट के लिए μg एमएल Hoechst 33342 के साथ सेते डिग्री सेल्सियस बंद मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और 15 मिलीलीटर phenol लाल मुक्त मध्यम विकास (phenol लाल स्वतंत्र Dulbecco संशोधित ईगल्स (उच्च ग्लूकोज) मध्यम 25 मिमी Hepes के साथ, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन / के साथ पूरक) के साथ की जगह. पकवान धारक थाली में तनाव पकवान भाड़ में. ध्यान से सिलिकॉन झिल्ली के नीचे की परिधि के लिए तेल (Braycote 804 वैक्यूम तेल) को लागू करने के लिए केंद्रीय पट्ट साथ झिल्ली के ग्लाइडिंग सुनिश्चित. झिल्ली के मध्य भाग को साफ रखने के लिए सुनिश्चित करें.
  3. खुर्दबीन मंच पर बेस प्लेट रखें. माउंट पकवान धारक प्लेट बेस प्लेट पर ध्यान से. विश्वास दिलाता हूं कि प्रारंभिक आराम की स्थिति में तनाव पकवान की सिलिकॉन झिल्ली शिथिल केंद्रीय पट्ट पर टिकी हुई है.
  4. सबसे पहले, सिलिकॉन झिल्ली के तल पर ध्यान केंद्रित करने और केंद्रीय काले संदर्भ डॉट लगता है. डॉट सभी छवि अधिग्रहण और खिंचाव के दौरान और बाद में एक ही कोशिकाओं का पता लगाने में एड्स के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा करेंगे. हम एक कस्टम लिखा स्वचालित इमेजिंग प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं की स्थिति की दुकान और प्रयोग के दौरान इन कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए, लेकिन यह मैन्युअल रूप से भी प्राप्त किया जा सकता है.
  5. डॉट से शुरू, ध्यान समायोजित करने के लिए कोशिकाओं और सिलिकॉन झिल्ली के ऊपर कल्पना. केन्द्र स्थित नाभिक के साथ अच्छी तरह से फैल कोशिकाओं का पता लगाएँ और एक चरण विपरीत और परमाणु Hoechst के एक प्रतिदीप्ति छवि दाग अधिग्रहण. चरण विपरीत छवि सेल रूपरेखा और सिलिकॉन झिल्ली पर ध्यान केंद्रित है, जबकि प्रतिदीप्ति छवियों नाभिक के मध्य विमान पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए चाहिए.
  6. 5 से 15 कोशिकाओं की छवियों को प्राप्त करने के बाद, केंद्रीय डॉट वापस ले जाएँ. धीरे - धीरे तनाव पकवान करने के लिए वजन को लागू करने के लिए, डिश के केंद्र में वर्दी तनाव आवेदन में जिसके परिणामस्वरूप. अधिक से अधिक लागू सब्सट्रेट तनाव नायलॉन अनुलंब संरेखण पिंस (मार्गदर्शन पिन) पर रखा spacers द्वारा सीमित है.
  7. सिलिकॉन झिल्ली के तल पर फोकस और संदर्भ डॉट फिर पता लगाने. से शुरूडॉट, एक ही कोशिकाओं को स्थानांतरित करना और फिर से एक चरण विपरीत और पूर्ण तनाव के तहत और कोशिकाओं के नाभिक के एक प्रतिदीप्ति छवि अधिग्रहण, प्रारंभिक छवियों का केन्द्र विमानों को बारीकी से मैच करने की कोशिश कर रहा है. यह प्रक्रिया 10 मिनट से अधिक नहीं करने के लिए सक्रिय remodeling और तनावपूर्ण सब्सट्रेट करने के लिए सेल के अनुकूलन से बचना चाहिए.
  8. आखिर इसी छवियों का अधिग्रहण किया गया है, माइक्रोस्कोप चरण कदम वापस प्रारंभ बिंदु के लिए. ध्यान पकवान धारक थाली से वजन को हटाने और सिलिकॉन झिल्ली के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं. यदि आवश्यक हो, धीरे तनाव पकवान धक्का जब तक यह प्रारंभिक स्थिति में है. तब चरण विपरीत और अधिग्रहण के बाद तनाव के रूप में तनाव छवियों के लिए ऊपर वर्णित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवियों.

विश्लेषण

  1. कक्षों की छवियाँ और से पहले, दौरान और बाद तनाव आवेदन fluorescently लेबल नाभिक सामान्यीकृत परमाणु तनाव की गणना करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. हमारी प्रयोगशाला में, हम विश्लेषण के लिए एक कस्टम लिखा MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग करें, लेकिन कई वैकल्पिक विकल्प उपलब्ध हैं. विश्लेषण तीन चरणों में किया जाता है.
  2. पहले लागू सब्सट्रेट तनाव की गणना करने के लिए, 3 से 6 नियंत्रण अंक झिल्ली पर स्थित के पदों मैन्युअल रूप से इसी पूर्व, पूर्ण, और तनाव के बाद छवियों के बीच मिलान कर रहे हैं. MATLAB कार्यक्रम तो पूर्व तनाव और पूर्ण तनाव छवियों और पूर्व तनाव और तनाव के बाद छवियों के बीच भी अवशिष्ट तनाव के बीच नियंत्रण अंक से मेल खाते की स्थिति की तुलना द्वारा लागू झिल्ली तनाव computes. उसी समय, नियंत्रण अंक छवि जोड़े, जो क्षतिग्रस्त या detaching सेल (चित्रा 1 देखें) का पता लगाने में मदद मिलेगी रजिस्टर करने के लिए उपयोग किया जाता है.
  3. एक दूसरे चरण में, नाभिक मैन्युअल एक अलग MATLAB प्रोग्राम है कि या तो परमाणु आकार या इसी पूर्व, पूर्ण, और तनाव के बाद फ्लोरोसेंट छवियों के बीच intranuclear मार्करों मेल द्वारा प्रत्येक व्यक्ति के नाभिक के लिए परमाणु तनाव की गणना का उपयोग करने के लिए चयन कर रहे हैं. लागू विभिन्न प्रयोगों के बीच तनाव झिल्ली में छोटे बदलाव के लिए खाते, हम सामान्यीकृत परमाणु तनाव, लागू झिल्ली तनाव है कि प्रत्येक नाभिक के लिए computed है के लिए प्रेरित परमाणु तनाव के अनुपात के रूप में परिभाषित के रूप में परिणाम व्यक्त करते हैं. MATLAB स्क्रिप्ट अनुरोध पर Lammerding प्रयोगशाला से उपलब्ध हैं.
  4. अंत में, प्रत्येक नाभिक, कोशिकाओं है कि अलग या तनाव आवेदन (चित्रा 1) के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया माप को छोड़कर के लिए मान्य है.

2. Microneedle हेरफेर परख

व्यंजन, पक्षपाती कोशिकाओं, और microneedles की तैयारी

  1. 35 मिमी गिलास नीचे सेल संस्कृति व्यंजन सेते fibronectin की एक कम एकाग्रता (0.5ug/ml) हांक buffered नमक खारा में (HBSS) या 2 घंटे के लिए कोई उपयुक्त बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस धो HBSS दो बार के साथ व्यंजन और पकवान अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर जोड़ने.
  2. माउस भ्रूण fibroblasts 0.05% trypsin और वरीयता प्राप्त के साथ 2 मिलीलीटर वृद्धि 7.5 x 10 fibronectin लेपित गिलास नीचे व्यंजन पर 4 / कोशिकाओं मिलीलीटर पर वरीयता प्राप्त मध्यम में trypsinized हैं. इनक्यूबेटर में वापस प्लेस रातोंरात कोशिकाओं. इनक्यूबेटर में वापस प्लेस रातोंरात कोशिकाओं. एक कक्षों की संख्या का अनुकूलन करने के लिए एकल, पक्षपाती, अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए गैर सहधारा कोशिकाओं को प्राप्त करना चाहिए.
  3. एक वाणिज्यिक विंदुक डांड़ी (जैसे, Sutter साधन कंपनी) के साथ सुक्ष्ममापी के लगभग 1 से 3 व्यास टिप microneedles borosilicate capillaries के बनाया, खींचो.

Microneedle हेरफेर प्रयोग

  1. अगले दिन, MitoTracker के साथ कोशिकाओं सेते mitochondrial दाग (600 सुक्ष्ममापी, Invitrogen) और Hoechst 33342 परमाणु दाग ​​(1 μg / एमएल) एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए मध्यम विकास के लिए जोड़ा.
  2. कोशिकाओं कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए HBSS में एक बार धो और फिर इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को phenol लाल मुक्त मध्यम विकास जोड़ें.
  3. चरण विपरीत में cytoskeleton में सम्मिलित microneedle एकल कक्ष के बिना एक छवि मोल, Hoechst 33342 दाग और एक mitochondrial फ्लोरोसेंट छवि के एक फ्लोरोसेंट छवि एक 60x उद्देश्य (0.70 एनए, योजना Achromat) के साथ एक औंधा पर दाग एक डिजिटल आरोप डिवाइस युग्मित कैमरे के साथ खुर्दबीन.
  4. Micromanipulator (उदाहरण के लिए, InjectMan 2 एनआई, Eppendorf) का उपयोग करना, ध्यान से एक निश्चित (आमतौर पर 5 सुक्ष्ममापी) परमाणु परिधि से दूर एक सेल के cytoplasm में microneedle डालने और एक चरण विपरीत छवि, 33342 Hoechst के एक फ्लोरोसेंट छवि ले दाग और mitochondrial दाग फ्लोरोसेंट छवि. इस आवेदन के लिए, यह एक कंप्यूटर के माध्यम से micromanipulator नियंत्रण, उदाहरण के लिए, Windows Hyperterminal, को लगातार micromanipulation प्रक्रियाओं को प्राप्त करने में मदद करता है.
  5. जबकि एक साथ प्रतिदीप्ति और चरण विपरीत हर 10 छवियों का संग्रह microneedle, सेल परिधि में एक सुक्ष्ममापी / सेकंड (आमतौर पर 10 या 20 सुक्ष्ममापी) की दिशा में एक विशिष्ट दूरी ले जाएँसेकंड. के रूप में microneedle सेल परिधि की ओर एक विशिष्ट दूरी के लिए बढ़ रहा है. चुना मापदंडों के साथ, के रूप में microneedle सेल परिधि की ओर एक विशिष्ट दूरी के लिए बढ़ रहा है, यह हेरफेर प्रक्रिया के दौरान 2-3 फ्रेम करने के लिए अनुरूप होगा.
  6. अंत में अतिरिक्त छवियों अधिग्रहण के बाद microneedle cytoskeleton से हटा दिया है.

विश्लेषण

  1. विस्थापन के नक्शे एक कस्टम लिखा MATLAB के नाभिक और cytoplasm की ट्रैकिंग fluorescently लेबल सुविधाओं के आधार पर स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए गणना कर रहे हैं. (MATLAB स्क्रिप्ट अनुरोध पर Lammerding प्रयोगशाला से उपलब्ध है). कार्यक्रम के बाद छवि फ्रेम में छोटे छवि क्षेत्रों (लगभग 10 सुक्ष्ममापी x आकार और स्थान अलावा 5 सुक्ष्ममापी में 10 सुक्ष्ममापी) के बीच एक normalized पार सहसंबंध एल्गोरिथ्म का उपयोग करता है. प्रत्येक क्षेत्र के लिए केंद्र में विस्थापन-x और y-दिशाओं मूल स्थान और नव पहचान की स्थिति के बीच बदलाव के रूप में गणना कर रहे हैं और एक विस्थापन वेक्टर के रूप में प्रदर्शित और भी संख्यात्मक मान के रूप में संग्रहीत. विस्थापन के नक्शे से, पूर्वनिर्धारित क्षेत्रों के भीतर औसत displacements अभिकलन किया जा सकता है. ध्यान दें कि cytoskeletal displacements cytoskeletal मार्करों (जैसे, MitoTracker दाग mitochondrial) के लिए प्रतिदीप्ति चैनल पर आधारित हैं, जबकि परमाणु displacements प्रतिदीप्ति Hoechst 33342 संकेत करने के लिए इसी चैनल से गणना कर रहे हैं. हमारे आवेदन के लिए, हम नियमित रूप से निम्नलिखित क्षेत्रों की जांच:, (ii) तनाव आवेदन साइट की दिशा में नाभिक के अंदर एक क्षेत्र में परमाणु तनाव (i) तनाव आवेदन साइट, अर्थात्, microneedle सम्मिलन साइट पर cytoskeletal तनाव ( iii) परमाणु परमाणु क्षेत्र में आवेदन साइट से दूर तनाव, और (iv) नाभिक भर में एक cytoplasmic क्षेत्र में cytoskeletal तनाव. इसके अलावा, एक भी सीधे चरण विपरीत या Hoechst 33342 प्रतिदीप्ति छवि दृश्यों से परमाणु बढ़ाव उपाय कर सकते हैं. इस मामले में लागू है, परमाणु तनाव परमाणु बढ़ाव (ΔL = एल - एल 0) विभाजित करके गणना की है प्रारंभिक लंबाई, एल 0, जहां एल तनाव आवेदन और एल 0 के अंत में नाभिक के अंतिम लंबाई है नाभिक के प्रारंभिक लंबाई. एक अक्षुण्ण nucleo-cytoskeletal युग्मन के साथ कोशिकाओं के लिए, नाभिक तनाव आवेदन साइट की ओर बढ़ाना होगा. इसके विपरीत, कोशिकाओं में जो nucleo-cytoskeletal युग्मन बाधित है, यानी, बलों कम कुशलता cytoskeleton और नाभिक के बीच संचरित कर रहे हैं, नाभिक के तनाव आवेदन साइट की दिशा में काफी कम बढ़ाना की उम्मीद है. इस प्रकार, cytoskeletal तनाव आवेदन के जवाब में परमाणु विरूपण कम नाभिक और cytoskeleton के बीच एक uncoupling (आंशिक) मतलब है.

3. प्रतिनिधि परिणाम:

सब्सट्रेट तनाव आवेदन

हम पहले छवियों हासिल है, के दौरान, और विषमयुग्मजी और homozygous lamin से तनाव माउस भ्रूणीय fibroblasts के लिए आवेदन के बाद एक / सी की कमी (Lmna + / - और Lmna - / -), और जंगली प्रकार (Lmna + / +) चूहों और बाद में प्रत्येक कक्ष के लिए सामान्यीकृत परमाणु तनाव अभिकलन. विश्लेषण के बाद, नाभिक पुष्टि कर रहे हैं कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त हो कि आवेदन के दौरान तनाव या वापस लेना विश्लेषण से बाहर रखा गया है. चित्रा 1A तीन कोशिकाओं है कि वैध हैं के नाभिक को दर्शाया गया है, जबकि चित्रा 1 बी कोशिकाओं है कि विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए दर्शाया गया है. सामान्यीकृत परमाणु तनाव डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (~ 5-10 नाभिक से प्रत्येक माप युक्त) से जमा कर रहे हैं और या सांख्यिकीय विश्लेषण से अन्य सेल उपचार समूहों के साथ तुलना. वृद्धि सामान्यीकृत परमाणु तनाव कम परमाणु जकड़न, परमाणु लिफाफा प्रोटीन lamin ए / सी (चित्रा 2) के कम अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं में देखा के रूप में इंगित करता है.

Microneedle हेरफेर परख

Microneedle हेरफेर परख के लिए, हम स्थानीयकृत cytoskeletal तनाव आवेदन के दौरान परमाणु और cytoskeletal displacements imaged. कि क्षतिग्रस्त या अलग हो जाते हैं कक्ष विश्लेषण से बाहर रखा गया है. विश्लेषण के लिए, हम एकल, पक्षपाती कोशिकाओं में बल आवेदन साइट की दिशा में परमाणु और cytoskeletal आंदोलनों की भयावहता को मापने. उदाहरण के लिए, चित्रा 3 में, हम पहले और बाद cytoskeletal तनाव mitochondrial displacements (cytoskeleton के लिए मार्कर) को ट्रैक और फिर वैक्टर के रूप में displacements साजिश. प्रत्येक सदिश मूल स्थान और नव पहचान की स्थिति के बीच बदलाव के रूप में गणना विस्थापन का प्रतिनिधित्व करता है. कम छवि तीव्रता या अपर्याप्त बनावट (जैसे, कक्ष के बाहर क्षेत्रों) के साथ क्षेत्र के विश्लेषण से बाहर रखा गया है. cytoskeletal और परमाणु displacements तो तनाव आवेदन साइट से बढ़ती दूरी (चित्रा 4, रंग बो इसी क्षेत्रों में चुनिंदा क्षेत्रों में मात्रा निर्धारित कर रहे हैंXES के इनसेट में). बरकरार युग्मन nucleo-cytoskeletal के साथ माउस भ्रूणीय fibroblasts में, सेना ने पूरे कोशिकाओं के माध्यम से प्रेषित कर रहे हैं, परमाणु और cytoskeletal विरूपण प्रेरित है कि धीरे धीरे तनाव आवेदन साइट (चित्रा 4) से दूर फैलने में जिसके परिणामस्वरूप. इसके विपरीत, परेशान युग्मन nucleo cytoskeletal (या बदल cytoskeletal संगठन) के साथ fibroblasts आवेदन स्थल के निकट स्थानीयकृत displacements, के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है और केवल थोड़ा प्रेरित आगे दूर विरूपण प्रदर्शन. Microneedle सम्मिलन साइट (नारंगी बॉक्स) पर तुलनात्मक cytoskeletal तनाव आवेदन दोनों नियंत्रण (mCherry अकेले) fibroblasts और एक बाधित nucleo-cytoskeletal युग्मन (डी.एन. कश्मीरियों) के साथ fibroblasts के लिए मनाया जाता है. हालांकि, अन्य क्षेत्रों को प्रेरित परमाणु और cytoskeletal displacements (नीले, पीले और लाल बक्से) बाधित नियंत्रण कोशिकाओं (mCherry अकेले) (चित्रा 4) में से युग्मन nucleo cytoskeleton (डी.एन. कश्मीरियों) के साथ fibroblasts में काफी छोटे थे. इस प्रकार, तनाव आवेदन साइट से दूर cytoskeletal और परमाणु displacements में कमी का संकेत है, cytoskeleton और नाभिक के बीच बल संचरण परेशान थी.

महत्वपूर्ण बात है, हम भी पुष्टि की है कि mitochondria उपयुक्त cytoskeletal मार्कर माउस भ्रूणीय GFP या mCherry actin और GFP-vimentin के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और fluorescently Mitotracker ग्रीन या लाल के साथ लेबल fibroblasts पर microneedle हेरफेर द्वारा आयोजित,. Cytoskeletal विस्थापन के नक्शे स्वतंत्र mitochondria और actin या vimentin cytoskeleton के फ्लोरोसेंट संकेत से गणना की गई. औसत निरपेक्ष विस्थापन के चार अलग cytoskeletal क्षेत्रों के लिए गणना तनाव आवेदन साइट से बढ़ती दूरी पर था. ढलान और आर चुकता मान mitochondria से और actin या vimentin, क्रमशः से प्राप्त की माप के बीच रेखीय प्रतिगमन से गणना की गई. Actin के लिए, ढलान 0.99 था और मान 2 आर 0.986 था, vimentin के लिए, ढलान 1.04 था और R2 के मूल्य 0.971 था, जो इस बात की पुष्टि है कि mitochondrial displacements cytoskeletal विकृतियों के लिए विश्वसनीय संकेतक के रूप में सेवा करते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. Substrate माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) पर तनाव आवेदन माउस भ्रूण fibroblasts सिलिकॉन झिल्ली पर दो अलग - अलग क्षेत्रों में फैला हुआ है. चरण विपरीत और इससे पहले कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ imaged किया गया 20% की एक अक्षीय तनाव के आवेदन के दौरान और बाद में. (ए) वैध नाभिक के साथ कोशिकाओं है कि किसी भी क्षति या टुकड़ी और (बी) कोशिकाओं है कि / वापस लेना तनाव आवेदन के दौरान आंशिक रूप से अलग उदाहरण के बिना तनाव आवेदन बच से एक सफल प्रयोग के उदाहरण में दर्शाया कोशिकाओं से परिणाम (बी) अपवर्जित कर रहे हैं विश्लेषण से. में (बी), बाईं ओर कक्ष cytoskeletal नुकसान और परमाणु पतन (तीर) के लक्षण दिखाता है, जबकि सही पक्ष पर सेल तनाव आवेदन के दौरान आंशिक रूप से और retracts detaches. यह अत्यधिक तनाव आवेदन का एक संकेत हो सकता है. बेहतर तुलना के लिए, (ए) और (बी) एक unstretched कोशिका झिल्ली की सीमा लाल रंग में उल्लिखित है और तनाव आवेदन के दौरान और बाद में एक ही सेल पर आरोपित है. (ए) unstretched नाभिक की सीमा हरे रंग में उल्लिखित है और तनाव आवेदन के दौरान और बाद में उसी नाभिक पर आरोपित.

चित्रा 2
चित्रा 2. अलग MEF सेल लाइनों के एक पैनल में सामान्यीकृत परमाणु तनाव का विश्लेषण Lmna MEFs - / - Lmna और + / - आनुवंशिक पृष्ठभूमि व्यक्त ectopically या तो एक खाली वेक्टर या जंगली प्रकार lamin एक विश्लेषण किया गया . जंगली प्रकार (Lmna + + /) littermates lamin के नुकसान से MEFs की तुलना में कमी आई परमाणु कठोरता में ए / सी अभिव्यक्ति परिणाम है कि पूरी तरह से जंगली प्रकार lamin ए के reintroduction द्वारा बहाल किया जा सकता है विशेष रूप से, परमाणु कठोरता कम से परिलक्षित होता है सामान्यीकृत परमाणु तनाव के मूल्यों में वृद्धि हुई. त्रुटि सलाखों मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. Microneedle हेरफेर करने के लिए intracellular बल संचरण उपाय परख. चरण (ए, बी) विपरीत और प्रतिदीप्ति एक परमाणु दाग (नीला) के साथ लेबल fibroblast की (सी, डी) छवियों और MitoTracker mitochondrial दाग (हरा). एक microneedle cytoskeleton में नाभिक (ए और सी) से एक निर्धारित दूरी पर डाला गया था और बाद में सेल परिधि (बी, डी) की ओर चले गए. Cytoskeletal और परमाणु displacements ट्रैकिंग fluorescently लेबल नाभिक और mitochondria एक कस्टम लिखा पार सहसंबंध एल्गोरिथ्म का उपयोग कर के द्वारा मात्रा थे. (ई) अंतिम cytoskeletal के विस्थापन नक्शे (हरा) प्रतिदीप्ति छवि श्रृंखला से गणना विकृतियों, तीर लंबाई 2x द्वारा बेहतर visibi के लिए बढ़ाया हैमें lity. स्केल सलाखों, 10 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 4
चित्रा 4. Intracellular बल संचरण के microneedle हेरफेर के दौरान विश्लेषण. Microneedle हेरफेर के दौरान cytoskeletal और परमाणु displacements प्रेरित, रंग का बक्से के लिए इसी क्षेत्रों (एक में इनसेट) में मापा. नारंगी बॉक्स तनाव आवेदन साइट है. Cytoskeleton (नारंगी बॉक्स), प्रेरित में इसी तरह के तनाव के आवेदन के बावजूद परमाणु और cytoskeletal displacements (नीले, पीले और लाल बक्से) माउस है कि (के साथ एक बाधित nucleo-cytoskeletal युग्मन (डी.एन. कश्मीरियों) नियंत्रण की तुलना में भ्रूण fibroblasts में काफी छोटे थे mCherry अकेले कोशिकाओं).

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Discussion

सब्सट्रेट तनाव परख

तनाव आवेदन सफलतापूर्वक किया गया है हमें और अन्य समूहों द्वारा उपयोग के लिए कोशिकाओं में प्रेरित परमाणु विरूपण यांत्रिक तनाव के अधीन अध्ययन और परमाणु कठोरता विशिष्ट परमाणु लिफाफा प्रोटीन के योगदान की जांच 4-8 इस तकनीक का लाभ यह है कि यह यांत्रिक गुणों जांच उनके सामान्य सेलुलर और cytoskeletal वातावरण में और है कि नाभिक रहने के सब्सट्रेट तनाव आवेदन शारीरिक भार के रूप में करार मांसपेशियों या रक्त वाहिनियों की दीवारों के रूप में कई ऊतकों में पाया आवेदन जैसा दिखता है 9 इसके अलावा, यह समानांतर में कई कोशिकाओं को तनाव आवेदन सक्षम बनाता संख्या बढ़ रही है. कोशिकाओं है कि एक ही प्रयोग में विश्लेषण किया जा सकता. सब्सट्रेट तनाव परख की एक सीमा है कि यह परमाणु कठोरता के प्रत्यक्ष माप की अनुमति नहीं है. इसके बजाय, इस पद्धति आसपास cytoskeleton की तुलना में नाभिक के रिश्तेदार कठोरता निर्धारित करता है. प्रेरित अक्षीय सब्सट्रेट तनाव चलता है कि जंगली प्रकार की कोशिकाओं में, cytoskeletal तनाव लागू सब्सट्रेट तनाव के लिए तुलनीय है के अधीन कोशिकाओं में परमाणु और cytoskeletal तनाव के विस्तृत विश्लेषण, जबकि stiffer नाभिक काफी कम विकृत 4 बहरहाल, अतिरिक्त assays, इस तरह के रूप में microneedle हेरफेर परख, विश्वास दिलाता हूं कि विभिन्न सेल लाइनों के बीच परमाणु विरूपण में मनाया मतभेद को बदल nucleo-cytoskeletal युग्मन या cytoskeletal संरचना के परिणाम नहीं कर रहे हैं करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इन सीमाओं के बावजूद बरकरार कोशिकाओं में के बजाय पृथक नाभिक में परमाणु यांत्रिकी मापने आसमाटिक प्रभाव, अलगाव प्रक्रिया के दौरान क्षति, या अन्य परमाणु अलगाव के साथ जुड़े परिवर्तन के द्वारा प्रेरित कलाकृतियों के जोखिम minimizes. हालांकि, एक सब्सट्रेट तनाव परख के लिए कड़े आवश्यकता है कि कोशिकाओं को मजबूती से सब्सट्रेट करने के लिए पालन. सेलुलर आसंजन में सुधार करने के लिए, बर्तन अलग fibronectin कोलेजन, या चर सांद्रता में laminin जैसे बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ लेपित किया जा सकता है, हम प्रत्येक नया सेल प्रयोगों में इस्तेमाल किया प्रकार के लिए इष्टतम कोटिंग की स्थिति का निर्धारण करने की सलाह देते हैं.

इसके अलावा, इष्टतम परिणामों के लिए लागू सब्सट्रेट तनाव पर्याप्त परमाणु विकृतियों का पता लगाने जबकि कोशिकाओं को नुकसान को कम करने के लिए बड़े होना चाहिए. माउस और मानव fibroblasts के लिए, हम आम तौर पर 5% द्विअक्षीय या प्रकट कोशिका क्षति के बिना 20% एक अक्षीय तनाव तनाव लागू होते हैं. सामान्य में, हम पाते हैं कि कोशिकाओं अक्षीय तनाव आवेदन द्विअक्षीय तनाव आवेदन की तुलना में बेहतर सहन, के रूप में झिल्ली के क्षेत्र में छोटे परिवर्तन आवश्यक हैं. बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग के लिए के रूप में, तनाव आवेदन के इष्टतम स्थितियों प्रत्येक नया सेल लाइन के लिए परीक्षण किया जा निर्धारित किया जाना चाहिए.

इसके अलावा, हमने पाया कि प्रयोगों सेल घनत्व के प्रति संवेदनशील हैं. प्रयोगों आदर्श उप सहधारा कोशिकाओं पर आयोजित किया जाना चाहिए करने के लिए सेल सेल बातचीत को कम, लेकिन, सेल घनत्व है कि बहुत कम हैं अक्सर तनाव प्रतिक्रिया में और प्रयोगों के प्रति कोशिकाओं की एक कम उपज में कक्षों की गरीब अस्तित्व में परिणाम. दूसरी ओर, एक सेल घनत्व है कि बहुत अधिक है यह मुश्किल पहले ही कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, के दौरान, और तनाव के आवेदन के बाद बनाता है. हम अलग - अलग प्रकार की कोशिकाओं के लिए इष्टतम सेल घनत्व परीक्षण की सलाह देते हैं.

प्रयोगों के लिए एक और महत्वपूर्ण सलाह है कि तनाव आवेदन 10 मिनट या उससे कम करने के लिए सीमित होना चाहिए cytoskeletal तत्वों की remodeling के रूप में सेलुलर अनुकूलन, से बचने के. यह अंत करने के लिए, स्वचालित इमेजिंग सॉफ्टवेयर, जैसे IPlab, एक motorized मंच के साथ संयोजन में उपयोग तनाव पकवान और तेजी से छवि अधिग्रहण पर कोशिकाओं के स्वत फिर स्थानीयकरण सक्षम बनाता है. इसके अलावा, हम डेटा विश्लेषण के लिए कस्टम लिखा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे MATLAB) का उपयोग करें. सॉफ्टवेयर झिल्ली पर कुछ मार्कर के अंक के लिए लागू लागू डॉट, छोटे फ्लोरोसेंट मोती या सिलिकॉन झिल्ली पर अलग अनियमितताओं जैसे सब्सट्रेट तनाव, की गणना की आवश्यकता है. अंत में, प्रत्येक नाभिक के सत्यापन करने के लिए क्षतिग्रस्त या retracting कोशिकाओं के उन बाहर की आवश्यकता है, के रूप में इन कोशिकाओं में मापा परमाणु विरूपण प्रतिनिधि नहीं हैं. सब्सट्रेट तनाव तकनीक के एक संभव अनुकूलन के लिए तीन आयामी कोलेजन जैल, जो अधिक शारीरिक शर्तों के तहत परमाणु यांत्रिक गुणों का विश्लेषण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अधिक दुबला पक्षपाती कोशिकाओं को पद्धति लागू की अनुमति देता में संवर्धित कोशिकाओं के सब्सट्रेट तनाव लागू है. एक और बदलाव micropatterned substrates, fibronectin की झिल्ली पर सिलिकॉन, जैसे, गोल, या आयताकार पैच, का उपयोग करने के लिए तनाव के आवेदन के दौरान संगत सेल प्रसार और संरेखण को प्राप्त करने के लिए है. अंत में, बेहतर समझने के लिए एक और अधिक शारीरिक स्तर पर परमाणु यांत्रिकी, सेलुलर तनाव अलग कक्षों के बजाय पूरे ऊतकों पर लागू किया जा सकता है. वर्तमान में हम सफलतापूर्वक इस तकनीक का उपयोग कर रहे हैं मॉडल संगठनों में परमाणु कठोरता उपायजैसे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर या Caenorhabditis एलिगेंस nisms.

Microneedle हेरफेर परख

microneedle हेरफेर परख एक एकल कोशिका आधारित विधि स्थानीयकृत cytoskeletal तनाव आवेदन के बाद प्रेरित परमाणु और cytoskeletal displacements बढ़ाता है, जिससे Maniotis और उनके सहयोगियों ने बीड़ा उठाया है एक पहले दृष्टिकोण को आगे बढ़ाने के द्वारा intracellular बल संचरण जांच 10 इस तकनीक है. अन्य स्थानीयकृत बल पर कई लाभ प्रदान करता है है जैसे चुंबकीय चिमटी या ऑप्टिकल जाल आवेदन तरीकों. उदाहरण के लिए, तनाव cytoskeleton सीधे लागू किया जा सकता है और microneedle की दूरी अलग संशोधित किया जा सकता है. microneedle भी उच्च सटीकता के साथ सेल में तैनात किया जा सकता है, प्रयोग बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने, और बल आवेदन दर है, जो सीधे microneedle गति से संबंधित है ठीक से क्रमादेशित micromanipulator द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है है. इसके विपरीत, चुंबकीय चुंबकीय चिमटी से नोचना और ऑप्टिकल जाल में इस्तेमाल किया मोती अक्सर बेतरतीब ढंग से शिखर सेलुलर सतह पर स्थानीय, और दोनों ऑप्टिकल और चुंबकीय चिमटी अपर्याप्त बलों को उत्पन्न करने के लिए कई प्रकार की कोशिकाओं में बड़े पैमाने पर cytoskeletal विरूपणों में परिणाम. हालांकि, microneedle हेरफेर परख एक आक्रामक तकनीक है और वहाँ सीमित नियंत्रण cytoskeletal संरचनाओं को microneedle पालन करता है, जिस पर हम कम आक्रामक दृष्टिकोण (सब्सट्रेट तनाव जैसे) के साथ परिणाम की पुष्टि कर सकते हैं है. इस प्रकार, microneedle हेरफेर और सब्सट्रेट तनाव दो पूरक assays कि बरकरार जीवित कोशिकाओं में परमाणु यांत्रिकी के बारे में जानकारी उपज जबकि सामान्य परमाणु और cytoskeletal वास्तुकला को बनाए रखने और nucleoplasm और cytoplasm सही रासायनिक संरचना के संरक्षण कर रहे हैं.

बाद में, हम संभव संशोधन या सुधार का सुझाव देते हैं. यदि कोशिकाओं को बहुत अच्छी तरह से फैल रहे हैं, microneedle टिप गिलास नीचे पकवान के खिलाफ तोड़ जब यह पतली cytoskeleton (~ 1-2 सुक्ष्ममापी) के भीतर स्थिति की कोशिश कर सकते हैं. इन समस्याओं से बचने के लिए, हम fibronectin, कोलेजन, या laminin जैसे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) अणु, की सांद्रता का एक सीमा के परीक्षण की सिफारिश करने के लिए कोशिकाओं को भी पतली फैल करने की अनुमति के बिना निर्धारित स्थिति है कि पर्याप्त कोशिका आसंजन प्राप्त करने के. एक अन्य संशोधन थाली ECM-लेपित micropatterned सतहों पर कोशिकाओं को वर्दी सेल प्रसार और ओरिएंटेशन को आश्वस्त किया जा सकता है. एक अतिरिक्त या पूरक दृष्टिकोण ECM-लेपित polyacrylamide जैल पर थाली कोशिकाओं के लिए और cytoskeleton के माध्यम से जेल में microneedle cytoskeleton भर में वर्दी तनाव आवेदन प्रदान सम्मिलित सकता है. बरकरार है और ठीक इत्तला दे दी microneedle का उपयोग प्रयोगों की सफलता के लिए बिल्कुल जरूरी है. हम नियमित रूप से हमारे स्वयं microneedles पुल, और एक अलग आकृति और आकार के साथ प्रयोग कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक भी लगातार ज्यामिति के साथ व्यक्तिगत पैक microneedles खरीद सकते हैं (जैसे, Eppendorf Femtotips). किसी भी मामले में, यह महत्वपूर्ण है विश्वास दिलाता हूं कि microneedle प्रयोगों के दौरान एक टूटी हुई microneedle टिप के रूप में, उदाहरण के लिए ग्लास सब्सट्रेट के साथ संपर्क बनाने के बाद, कोशिकाओं को नुकसान होगा, undamaged रहता है. Microneedle हेरफेर प्रक्रिया ही के दौरान, यह महत्वपूर्ण है लगातार गति और microneedle आंदोलन की सीमा लागू करने के लिए, के रूप में नाभिक cytoskeleton है और समय निर्भर व्यवहार viscoelastic सामग्री के साथ हैं. हम एक कंप्यूटर नियंत्रित micromanipulator, जो भी microneedle आंदोलन और छवि के अधिग्रहण के समन्वय में सहायता करेंगे का उपयोग करने की अनुशंसा. हमारे अनुभव से, Mitotracker साइटोटोक्सिक द्वारा, इस प्रकार कर सकते हैं 30 मिनट के लिए प्रयोगों सीमा या GFP-actin या GFP-vimentin जैसे अन्य फ्लोरोसेंट मार्करों, का उपयोग करें. दृष्टिकोण के एक संशोधन को यहाँ वर्णित है, खासकर जब nucleo-cytoskeletal युग्मन का अध्ययन, cytoskeleton के बजाय नाभिक में microneedle डालने और यह सेल परिधि की ओर कदम है.

सभी अध्ययन, आमतौर पर बड़ी परिवर्तनशीलता सेल के लिए सेल करने के लिए कारण के लिए, प्रयोगों कम से कम तीन स्वतंत्र बार प्रदर्शन किया जाना चाहिए 15-25 कुल वैध कोशिकाओं की एक न्यूनतम माप से प्राप्त है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम (HL082792 R01 और NS059348 R01) स्वास्थ्य और ब्रिघम और महिला अस्पताल कार्डियोवास्कुलर नेतृत्व समूह पुरस्कार के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin EMD Millipore FC010
MitoTracker Red FM and Green FM Invitrogen M22425 and M-7514
H–chst 33342 Invitrogen H3570
Hank’s Buffered Salt Saline Invitrogen 14185
Phenol free, DMEM Invitrogen 21063
Fetal bovine serum Aleken Biologicals FBSS500
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100ML
Borosilicate Glass with filament Sutter Instrument Co. BF100-78-10
Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005" Specialty Manufacturing Inc.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200
35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Braycote 804 Vacuum Grease SPI Supplies 05133A-AB

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References

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