식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

Biology
 

Summary

특정 식물 유전자 히스톤 수정을 감지하는 신뢰할 수있는 유용한 접근 방법이 설명되어 있습니다. 접근 방식은 염색질 immunoprecipitation (칩)와 실시간으로 양적 PCR을 결합하여. 그것은 다양한 생리 과정에서 역할과 특정 유전자 히스톤 수정을 감지 수 있습니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of Histone Modifications in Plant Leaves. J. Vis. Exp. (55), e3096, doi:10.3791/3096 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

염색질 구조 eukaryotes에서 유전자 발현의 조절에 중요​​합니다. 이 과정에서, histones H3 및 H4의 아미노 터미널 꼬리에 염색질의 리모델링, DNA의 methylation과 공유 결합 수정 필수적 역할 1-2 재생합니다. H3 및 H4 히스톤 수정 리신과 아르기닌의 methylation, 라이신의 아세틸화, 그리고 세린의 잔류물 1-2의 인산화을 포함합니다. 이러한 수정은 유전자 활성화, 탄압, 또는 적절한 신호 (미생물 - 관련 분자 패턴, 빛, 호르몬 등) 3-7의 인식 후 표현보다 신속하고 강력한 인증을 지원하는 유전자의 상태와 준비하는 중 연결됩니다.

여기, 우리는 선택된 식물 유전자에서 특정 염색질 변경의 신뢰성과 민감한 검출을위한 방법을 제시한다. 기술은 수정 - 특정 항체 9,10와 포름 알데히드 8,9, 추출 및 염색질, 염색질 immunoprecipitation (칩)의 sonication과 (수정) histones과 DNA의 crosslinking 기반으로, 히스톤 - DNA의 단지의 드 - crosslinking, 그리고 유전자 특정 실시간 정량 PCR. 접근 방식은 C 옥수수 5,11의 광합성과 Arabidopsis 3 체계 면역과 관련된 특정 히스톤 변경을 감지하는 데 유용합니다 입증되었습니다.

Protocol

1. 식물 재료의 Crosslinking

  1. 하베스트 1~2g Arabidopsis 50 - ML 플라스틱 튜브에 단풍 (6 10cm의 로제트 직경에) 및 crosslinking 버퍼와 40mL까지 기입니다.
  2. 단풍이 버퍼 표면 위에 맞춤형 필터 스폰지 권리를 때우는하여 예를 들어, 포장되어있어 있는지 확인합니다. 다음 건조기에 튜브를 삽입합니다.
  3. 진공은 10 분에 대한 침투. 각 튜브는 crosslinking를 중지 2M 글리신의 2.5mL를 추가하고, 글리신의 동일한 분산을 보증하기 위해 튜브를 반전.
  4. 진공 다른 5 분에 대한 침투와 체에 잎을 수확하는 동안 액체를 폐기하십시오.
  5. 워시는 다음 유리 비커에 물 1L, 철저하게 종이 타올로 건조 잎 두 잎.
  6. 새로운 플라스틱 튜브에 잎사귀를 수집하고 액체 질소에 냉동. 스토어 -80 시에 출발 ° C까지 염색질 절연.

2. 염색질의 분리

  1. 단풍은 사용까지 액체 질소에 보관되었습니다 박격포와 암술과 지상되었습니다.
  2. 50 - ML 플라스틱 튜브에 분말을 전송하고 30mL 추출 버퍼 # 1 일시 중지합니다.
  3. 오버헤드 흔드는에 4 ° C에서 15 분에 대해 품어.
  4. 새로운 50 ML 플라스틱 튜브에 miracloth 네 가지 레이어를 통해 여과물 서스펜션.
  5. 4 2,800 XG에서 20 분에 대한 회전 ° C.
  6. 뜨는 제거하고 1mL 추출 버퍼 # 2에서 페인트 브러시와 펠렛을 일시 중지합니다. 처음엔 페인트 브러시와 펠렛을 중지하고 버퍼의 나머지 부분을 추가, 버퍼 # 2의 작은 볼륨을 추가합니다.
  7. 4 12,000 XG에서 10 분에 1.5mL microfuge 관과 스핀으로 정지를 전송 ° C.
  8. 한편, 1.5mL 추출 버퍼 # 3를 포함하는 2mL - microfuge 튜브를 준비합니다.
  9. 스펀 튜브 (2.7 단계)에서 뜨는 제거하고 추출 버퍼 # 3 300μL의 펠렛을 일시 중지합니다. 첫째, 버퍼 # 3의 작은 볼륨을 추가 페인트 브러시와 펠렛을 중지하고 나머지 버퍼를 추가합니다.
  10. 조심스럽게 pipet 단계 2.8 준비 1.5 ML 추출 버퍼 # 3 위에 펠렛을 (단계 2.9) 중지. 두 단계가 혼합되지 않습니다 있는지 확인합니다. 4 16,000 XG에서 1 시간을 위해 스핀 ° C.
  11. 뜨는 제거하고 sonication 버퍼의 300μL의 페인트 브러시와 염색질 펠렛을 일시 중지합니다.
  12. 약 400bp의 DNA를 크기에, sonotrode와 함께, 또는 초음파 욕조에서 염색질을 Sonicate. sonicating 때, 반드시 염색질이 약 30 이상 가열되지 않습니다 ° C는 열에 민감한 crosslinks를 보호하기 위해합니다. sonication의 기간은 다른 sonication 장치 사이에 상당히 차이가 있기 때문에, 실험적으로 결정되어야합니다. 지도 들어, 두 개의 다른 장치에 대한 설정이 제공됩니다 :

0.6mL microfuge 튜브에 Bandelin 브랜드 sonotrode 노출 염색질 25 % 파워 사이클 = 50 설정으로 다섯 번 20 파열과 sonication하십시오. 얼음 욕조에 매 20 번째 파열 후에 이렇게하는 동안, 쿨 샘플.

Diagenode Bioruptor 초음파 욕조와 sonication을 위해, 물, 얼음 욕조를 입력하고 '높음'설정을 1.5mL microfuge 튜브에서 30 초 동안 열번 sonicate. 매 30 초 후에 다른 30 ​​초 동안 냉각 샘플.

  1. 스핀은 4 1만6천g에서 5 분에 대한 샘플을 sonicated ° C 소화 되 다만 자료를 촉진합니다. 뜨는 직접 immunoprecipitation 사용할 수 있습니다. 또한, 샘플은 액체 질소에 냉동과 ° C까지 추가로 사용하여 -80에 저장된 충격하실 수 있습니다.

3. Immunoprecipitation

  1. 40μL 단백질 - 항체 결합 버퍼의 아가로 오스와 1.8mL.을 포함하는 2 - ML의 microfuge 튜브 준비 염색질의 준비 200μL (2.13 단계)를 추가합니다.
  2. 오버헤드 흔드는에 1 시간을위한 튜브를 품어.
  3. 단백질 - 아가로 오스 비즈를 버리고 immunoprecipitation을위한 뜨는 사용합니다.
  4. 염색질 농도를 ( '입력')를 확인하는 40μL - 나누어지는을 제거합니다.
  5. 추가 30μL 단백질 - 아가로 오스와 400μL sonicated 염색질 서스펜션에 특정 시약 및 장비의 아래 테이블에 표시됩니다 수정 - 특정 항체의 금액입니다.
  6. 4 오버헤드 흔드는에 2.5h 또는 야간에 대해 품어 ° C.
  7. 440 X G.에서 2min을 위해 구슬을 스핀
  8. 각 세척 버퍼 900μL (아래 목록 참조) 비드 펠렛 씻으십시오. 각 버퍼 들어, 4 오버헤드 흔드는 ° C에 10 분에 대한 버퍼에 품어 구슬 다음, 440 XG에서 2min에 대한 스핀 뜨는 삭제하고 다음 버퍼를 추가합니다.
    1. 낮은 소금 세척 버퍼
    2. 고 염분 세척 버퍼
    3. LiCl 세척 버퍼
    4. TE 세척 버퍼
  9. 최종 세척 후 완전히 남아있는 버퍼를 제거합니다.

4. histones과 DNA의 드 - crosslinking, 그리고 시켰던 DNA의 정화

  1. 아가로 오스 펠렛 및 단계 3.4에서 40μl '입력'샘플, 소용돌이 믹서에서 5 분을위한 혼합, 회전 샘플 및 incu에 드 crosslinking 버퍼 100μL 추가° C 야간 65 덜다.
  2. 상업 DNA 또는 PCR 정화 키트와 함께 DNA 정화.
  3. 일반적으로 최종 열 eluate의 1시 5분 희석의 5μl가 수행하는 충분 기존의 현장 특정 실시간 정량 RT - PCR (RT - qPCR).

5. 버퍼 표

Crosslinking 버퍼
나트륨 butyrate 10mM
자당 400mM
트리스 - HCL, pH를 8.0 10mM
β - 메르 캅 토 에탄올 5mM
포름 알데히드 3퍼센트 (V / V)
추출 버퍼 # 1
나트륨 butyrate 10mM
자당 400mM
트리스 - HCL, pH를 8.0 10mM
β - 메르 캅 토 에탄올 5mM
완료 테아제 억제제 1X
추출 버퍼 # 2
나트륨 butyrate 10mM
자당 250mM
트리스 - HCL, pH를 8.0 10mM
β - 메르 캅 토 에탄올 5mM
MgCl 2 10mM
트리톤 X - 100 1퍼센트 (W / V)
완료 테아제 억제제 1X
추출 버퍼 # 3
나트륨 butyrate 10mM
자당 1.7M
트리스 - HCL, pH를 8.0 10mM
β - 메르 캅 토 에탄올 5mM
MgCl 2 2mM
트리톤 X - 100 0.15 % (W / V)
완료 테아제 억제제 1X
Sonication 버퍼
트리스 - HCL, pH를 8.0 25mM
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 5mM
SDS 0.5 % (W / V)
완료 테아제 억제제 1X
항체 결합 버퍼
트리스 - HCL, pH를 8.0 50mM
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 1mM
NaCl 150mM
트리톤 X - 100 0.1 % (W / V)
낮은 소금 세척 버퍼
NaCl 150mM
SDS 0.1 % (W / V)
트리톤 X - 100 1퍼센트 (W / V)
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 2mM
트리스 - HCL, pH를 8.0 20mM
고 염분 세척 버퍼
NaCl 500mM
SDS 0.1 % (W / V)
트리톤 X - 100 1퍼센트 (W / V)
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 2mM
트리스 - HCL, pH를 8.0 20mM
LiCl 세척 버퍼
염화 리튬 250mM
Nonidet - P40 1퍼센트 (V / V)
나트륨 desoxycholate 1퍼센트 (W / V)
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 1mM
트리스 - HCL, pH를 8.0 20mM
TE 세척 버퍼
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - NaOH, pH를 8.0 10mM
트리스 - HCL, pH를 8.0 1mM
Decrosslinking 버퍼
트리스 - HCL, pH를 6.8 62.5mM
NaCl 200mM
SDS 2퍼센트 (W / V)
DTT 10mM

6. 대표 결과 :

Arabidopsis thaliana PR2 방어 유전자 표현 β를 인코딩항균 활성 12과 1,3 - 글루 카 네이스는 benzothiadiazole (BTH), 식물 호르몬 살리실산 3 합성 아날로그에 의해 유발되었다. 그림 1 PR2 표현의 활성화를 보여줍니다 히스톤에 리신 잔류물의 아세틸화 증가와 관련된 PR2 모터에 H3 및 H4. nucleosome 밀도는 유전자 활성화 13시 감소 때문에, 히스톤 아세틸화 값 히스톤 3 불변량 지역 항체로 얻은 신호 표준되었습니다.

그림 1
그림 1 BTH는 Arabidopsis에 PR2 모터에 히스톤 아세틸화을 유도. 식물은 100μM BTH 또는 wettable 분말 컨트롤과 함께 치료를했다. 72h 후, 단풍이 수집되었고 염색질은 고립되었다. 아세틸화 특정 항체 (같은 그림에 표시된)와 강수량 후 얻은 신호는 히스톤 H3의 불변량 도메인에 항체와 석출하여 얻은 신호 표준되었습니다. 시켰던 염색질은 RT - qPCR에 의해 계량했다. 데이터 BTH 치료의 부재에서 히스톤 수정 수준 표준화하고 있습니다.

Discussion

프로토콜의 가장 중요한 단계는 재료의 분쇄와 염색질의 sonication, DNA와 histones, 유형 및 잎 소재의 금액의 crosslinking 수 있습니다. 이러한 문제의 자세한 내용을 보려면 심판을 참조하십시오. 9 10.

Sonication 및 crosslinking :

400bp 약 조각 sonication 동안 염색질을 방해하는 것이 중요합니다. 부족한 sonication 오래 염색질의 조각을 떠날 것입니다 반면 철저한 sonication은 DNA와 histones을 방해하여 염색질을 파괴합니다. 테스트 현장에서 말초 히스톤 수정을 로컬 변경에서 차별 수 없기 때문에 이들은 방법의 특이성에 영향을줍니다. Sonication 효율이 가장 DNA를 분리하고 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 가지각색으로 DNA의 길이를 결정, 전에 sonication, DE - crosslinking의 DNA와 histones 후 샘플에서 20μL 염색질을 수집하여 테스트됩니다. 염색질 준비가 아직 조각난 DNA의 시각화를 방해할 수도 정화의이 단계에서 RNA의 대량 포함되어 있기 때문에 RNAse는 전기하기 전에 샘플에 추가되어 있어야합니다. 비 가지각색 염색질의 DNA가 10kbp 이상인 경우 가지각색 염색질의 DNA가 DNA의 400bp 주변의 최대 신호 강도와 얼룩을 형성 반면 샘플은 염색질 immunoprecipitation하는 데 유용합니다.

우리는 일상적으로 그대로 단풍의 염색질 crosslinking 3 % (V / V) 포름 알데히드를 사용하지만 1% (V / V) 포름 알데히드는 대부분의 경우 충분 수도 있습니다. 우리 손에, 낮은 포름 알데히드 농도는 결과의 PCR 반응에서 짧은 sonication 시간 및 배경 신호 수 있습니다. 그러나 포름 알데히드의 부족 금액은 자주 독립 실험 사이 PCR 신호의 낮은 재현성의 결과. 이것은 낮은 농도에서 포름 알데히드와 나뭇잎의 부족 침투에 의한 것입니다. 화합물이 시간과 중합하는 경향으로 자주 포름 알데히드 주식을 교환해야합니다. 포름 알데히드 솔루션은 약 한 달 동안 안정하고 있으며,이 기간은 거의 메탄올 안정화에 의해 연장되지 않습니다. 이것은 실험 조건을 설정할 때 다른 포름 알데히드 농도를 테스트하는 것이 좋습니다.

식물 재료의 금액 및 연삭 :

서로를 지키는 나뭇잎을 피하기 위해 버퍼의 큰 볼륨의 잎 소재의 낮은 금액을 침투하는 것이 중요합니다. 나뭇잎이 포름 알데히드의 부족 침투에 자주 결과를 집어넣는. 또한, 너무 많이 식물 재료 miracloth 조직의 모공을 차단합니다. 분쇄 효율이 상당히 완벽하게 맞지과 박격포와 유봉을 사용하여에 따라 달라집니다. 우리는 일상적으로 추가 액체 질소의 부재에 액체 질소 냉각 유봉과 박격포와 함께 갈아 50초 세 번 자료가 벌금 파우더로 그라운드 때까지.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 독일 과학 재단 (DFG)와 독일의 연방 및 주 정부의 우수 이니셔티브에 의해 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein-A-Agarose Roche Group 11 134 515 001 depends on the antibody class
Protein-G-Agarose Roche Group 11 243 233 001 depends on the antibody class
Anti-hyperacetyl-H4 EMD Millipore 06-946 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K5 EMD Millipore 07-327 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K8 EMD Millipore 07-328 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K12 EMD Millipore 07-595 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K16 EMD Millipore 07-329 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K18 EMD Millipore 07-354 we used 1μL
Anti-acetyl-H3K9 EMD Millipore 07-352 we used 5μL
Anti-acetyl-H3K14 EMD Millipore 07-353 we used 1μL
Anti-trimethyl-H3K4 Diagenode pAB-003-50 we used 5μL
Anti-dimethyl-H3K4 EMD Millipore 07-030 we used 5μL
Anti-monomethyl-H3K4 Abcam ab8895 2,5 -10μL
Anti-H3 Abcam ab1791 we used 1μL to check histone density
Bioruptor Diagenode UCD-200 TO
Sonotrode MS72 Bandelin
Miracloth Calbiochem 475855
Complete Protease Inhibitor Roche Group 11836145001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
  2. Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
  3. Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
  4. Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
  5. Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
  6. Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
  7. Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
  8. Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
  9. Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
  10. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
  11. Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
  12. Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
  13. Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics