检测组蛋白修饰在植物叶片

Biology
 

Summary

一个可靠的和有用的方法来检测特定的植物基因组蛋白修饰的描述。该方法结合了染色质免疫沉淀(ChIP)和实时定量PCR。它允许在不同的生理过程作用,对特定的基因组蛋白修饰的检测。

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Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of Histone Modifications in Plant Leaves. J. Vis. Exp. (55), e3096, doi:10.3791/3096 (2011).

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Abstract

在真核生物中基因表达的调控,染色质结构是很重要的。在这个过程中,染色质重塑,DNA甲基化和共价修饰组蛋白H3和H4的氨基末端尾巴,发挥重要作用 1-2 。 H3和H4组蛋白修饰包括赖氨酸和精氨酸甲基化,乙酰赖氨酸和丝氨酸残 1-2的磷酸化。这些修改相关的基因的激活,镇压,或支持适当的信号(微生物相关分子模式,光,激素等)3-7知觉后,更迅速和更强大的表达激活的基因,致敏状态。

在这里,我们提出了一个具体选定的植物基因的染色质修饰可靠,灵敏的检测方法。该技术是基于(修改),组蛋白与甲醛8,9,提取和修改特定抗体9,10超声染色,染色质免疫沉淀(ChIP)DNA的交联,组蛋白- DNA复合物的交联,特定基因实时定量PCR。该方法已被证明可用于检测与C 4光合作用玉米5,113在拟南芥中的全身免疫相关的特定组蛋白修饰。

Protocol

1。植物材料的交联

  1. 收获1 - 2G的拟南芥叶(6到10cm莲座直径)在50毫升的塑料管,填补了交联的缓冲区,以40ML。
  2. 确保叶留沉浸例如,通过量身定制的过滤海绵权馅上述缓冲表面。然后放置在干燥器管。
  3. 真空渗透为10分钟。每管加入2.5毫升2M甘氨酸停止交联,并反转管,以保证平等的甘氨酸分散。
  4. 真空渗透另一个5分钟,并丢弃液体,同时收获叶筛子。
  5. 洗叶两次1L水在玻璃烧杯中,然后用纸巾彻底干叶。
  6. 收集在一个新的塑料管的叶子和液氮冻结。商店叶在-80 ° C直到染色质隔离。

2。染色质隔离

  1. 叶地面砂浆和雌蕊,在液氮中保存,直到使用。
  2. 转让粉,50毫升的塑料管,并暂停在30ml提取缓冲液#1。
  3. 在4 ° C孵育15分钟上的开销摇床。
  4. 滤液暂停通过四层的miracloth到一个新的50毫升的塑料管。
  5. 在2800 XG 20分钟旋转4 ° C。
  6. 去除上清液,并中止与油漆刷在1​​ML提取缓冲液#2沉淀。首先添加一个缓冲区#2,体积小,然后用画笔暂停颗粒,然后添加其余的缓冲区。
  7. 转移悬浮在12000 XG到1.5ml离心管和旋转为10分钟,4 ° C。
  8. 同时,准备液2ml离心管1.5ml的提取缓冲液#3。
  9. 从纺管(步骤2.7)去除上清液,并暂停在提取缓冲液#3300μL沉淀。首先添加一个缓冲区#3,体积小,暂停与画笔颗粒,然后添加剩余的缓冲区。
  10. 仔细吸管的悬浮颗粒(步骤2.9)1.5 mL提取缓冲液中,在步骤2.8准备#3顶部。确保两个阶段不会混合。上半年的16,000 XG旋转4 ° C。
  11. 去除上清液,并中止与染色质颗粒在超声缓冲液300μL的油漆刷。
  12. 超声sonotrode,或在超声波浴染色,一个约400bp的DNA大小。当超声,确保染色不会被加热以上约30 ° C保护热敏感的交联。需要通过实验确定,因为它变化显著不同超声设备的超声时间。为指导,提供两个不同的设备设置:

对于超声一个Bandelin品牌sonotrode暴露在0.6mL离心管中染色质的5倍至20连发设置25%的电力,周期= 50。虽然这样做,在冰浴后,每20 阵阵清凉样品。

超声与Diagenode Bioruptor超声波浴,填补水和冰的浴缸和超声设置“高”的30秒在1.5ml的离心管的10倍。每隔30秒后,再过30秒冷却样品。

  1. 旋转超声16,000克的样品为5min,4 ° C至沉淀不溶物质。上清可直接用于免疫。另外,样品可在液氮中冷冻,并保存于-80℃直至进一步的冲击。

3。免疫沉淀

  1. 准备2 ml离心管40μL蛋白 - 琼脂糖和抗体结合缓冲液1.8mL。染色准备加入200μL(步长2.13)。
  2. 开销摇床孵育1h后管。
  3. 放弃蛋白A琼脂糖珠和使用免疫上清。
  4. 删除一个40μL等分,以确定染色质浓度(“输入”)。
  5. 加入30μL蛋白一琼脂糖和修改特异性抗体,是在特定的试剂和仪器400μL超声染色质悬浮如下表所示金额。
  6. 2.5H或架空摇床过夜孵育4 ° C。
  7. 自旋为2分钟,在440 × G.珠
  8. 洗珠颗粒,每个洗涤缓冲液900μL(见以下列表)。对于每一个缓冲区,然后在10分钟的缓冲开销摇床4℃,孵化珠为2分钟旋转440 XG,弃上清液,并添加下一个缓冲区。
    1. 低盐缓冲液洗
    2. 高盐缓冲液洗
    3. 氯化锂洗涤缓冲液
    4. TE缓冲液洗
  9. 最后一次洗涤后,彻底清除任何剩余的缓冲区。

4。组蛋白和DNA的交联和沉淀DNA纯化

  1. 将去交联缓冲区100μL琼脂糖颗粒和步骤3.4样品40μl的“输入”,在旋涡混合器混合5min后,旋转样品,并培育贝特在65 ° C过夜。
  2. 商业的DNA或PCR纯化试剂盒纯化的DNA。
  3. 通常情况下1:5稀释的最后一列洗脱液5μL足以执行特定常规轨迹实时定量RT - PCR(RT - qPCR的)。

5。缓冲区表

交联的缓冲区
丁酸钠 10MM
蔗糖 400MM
的Tris - HCl,pH值8.0 10MM
β-巯基乙醇 5MM
甲醛 3%(V / V)
提取缓冲液#1
丁酸钠 10MM
蔗糖 400MM
的Tris - HCl,pH值8.0 10MM
β-巯基乙醇 5MM
完整的蛋白酶抑制剂 1X
提取缓冲液#2
丁酸钠 10MM
蔗糖 250MM
的Tris - HCl,pH值8.0 10MM
β-巯基乙醇 5MM
MgCl 2的 10MM
TRITON X - 100 1%(W / V)
完整的蛋白酶抑制剂 1X
提取缓冲液#3
丁酸钠 10MM
蔗糖 1.7M
的Tris - HCl,pH值8.0 10MM
β-巯基乙醇 5MM
MgCl 2的 2MM
TRITON X - 100 0.15%(W / V)
完整的蛋白酶抑制剂 1X
超声缓冲
的Tris - HCl,pH值8.0 25MM
EDTA - NaOH溶液,pH值8.0 5MM
SDS 0.5%(W / V)
完整的蛋白酶抑制剂 1X
抗体结合缓冲液
的Tris - HCl,pH值8.0 50MM
EDTA - NaOH溶液,pH值8.0 1MM
氯化钠 150MM
TRITON X - 100 0.1%(W / V)
低盐缓冲液洗
氯化钠 150MM
SDS 0.1%(W / V)
TRITON X - 100 1%(W / V)
EDTA - NaOH溶液,pH值8.0 2MM
的Tris - HCl,pH值8.0 20MM
高盐缓冲液洗
氯化钠 500MM
SDS 0.1%(W / V)
TRITON X - 100 1%(W / V)
EDTA - NaOH溶液,pH值8.0 2MM
的Tris - HCl,pH值8.0 20MM
氯化锂洗涤缓冲
氯化锂 250MM
Nonidet - P40 1%(V / V)
钠去氧胆 1%(W / V)
EDTA - NaOH溶液,pH值8.0 1MM
的Tris - HCl,pH值8.0 20MM
TE缓冲液洗
EDTA - NaOH溶液,pH值8.0 10MM
的Tris - HCl,pH值8.0 1MM
Decrosslinking缓冲区
的Tris - HCl,pH值6.8 62.5mM
氯化钠 200MM
SDS 2%(W ​​/ V)
数码地面电视 10MM

6。代表性的成果:

拟南芥PR2防御基因的表达,编码β -1,3 -葡聚糖酶,抗菌活性 12,苯并噻二唑(BTH)诱导,人工合成的植物激素水杨酸3模拟图1表明,激活 PR2的表达与组蛋白乙酰化赖氨酸残基上增加相关。 H3和H4 PR2的发起人。由于核小体密度降低在基因的激活13,组蛋白乙酰化值正常化不变区域的组蛋白3抗体获得的信号。

图1
图1 BTH诱导PR2的发起人在拟南芥组蛋白乙酰化 。植物均采用100μm的BTH或可湿性粉剂控制。 72h后,叶收集和染色质隔离。乙酰特异性抗体(如图所示)沉淀后得到的信号是标准化,以获得一种抗体降水不变域的组蛋白H3的信号。沉淀染色质,定量RT - qPCR的。数据是在BTH处理的情况下组蛋白修饰水平的标准化。

Discussion

在协议中最重要的步骤是DNA和组蛋白,叶片材料的类型和数量的交联,研磨材料,染色质的超声。对于这些问题的更详细的讨论,请参阅参考文献。 9日和10日。

超声和​​交联:

重要的是要破坏约400bp的片段,在超声染色。力竭超声破坏,破坏DNA和组蛋白的染色质,而超声不足会留下长期的染色质片段。这些影响的方法的特异性,因为从远端测试位点的组蛋白修饰,不能从本地修改歧视。超声效率是最好的测试,通过收集样品20μL前后超声,交联DNA和组蛋白,染色质隔离的DNA,并确定剪切DNA的琼脂糖凝胶电泳长度。应增加核糖核酸酶电泳前样品,染色质的准备,因为仍含有大量的RNA,在这个阶段净化零散的DNA的可视化,可能会干扰。样品是有用的染色质免疫沉淀,如果从非剪切染色质DNA大于10kbp,而从剪切染色质DNA形式的DNA大约400bp的最大信号强度一抹黑。

我们经常使用完整的叶片的染色质交联3%(V / V)的甲醛,但在大多数情况下有足够的1%(V / V)的甲醛可能。在我们的手中,低甲醛浓度允许超声时间较短和随之而来的PCR反应的背景信号。然而,甲醛不足,往往会造成PCR检测信号之间的独立实验重复性低。这可能是由于不足的渗透与甲醛在低浓度的叶。确保经常交换甲醛股票的复合趋于聚合,随着时间的推移。甲醛溶液是稳定的,只有约一个月,而这个时期是难以长期甲醇稳定。这是建议设立实验条件时,以测试不同的甲醛浓度。

植物材料和磨削的金额:

重要的是要在大量的缓冲渗透叶片材料的低量,以避免彼此的树叶粘。叶坚持结果往往不足的甲醛渗透。此外,过多的植物材料将阻塞毛孔的miracloth组织。研磨效率大大取决于使用迫击炮和杵完美契合。我们经常磨,用液氮冷却的杵和砂浆在没有额外的液态氮50秒,直到材料磨成细粉。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是由德国科学基金会(DFG)和德国联邦政府和各州政府的卓越倡议。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein-A-Agarose Roche Group 11 134 515 001 depends on the antibody class
Protein-G-Agarose Roche Group 11 243 233 001 depends on the antibody class
Anti-hyperacetyl-H4 EMD Millipore 06-946 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K5 EMD Millipore 07-327 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K8 EMD Millipore 07-328 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K12 EMD Millipore 07-595 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K16 EMD Millipore 07-329 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K18 EMD Millipore 07-354 we used 1μL
Anti-acetyl-H3K9 EMD Millipore 07-352 we used 5μL
Anti-acetyl-H3K14 EMD Millipore 07-353 we used 1μL
Anti-trimethyl-H3K4 Diagenode pAB-003-50 we used 5μL
Anti-dimethyl-H3K4 EMD Millipore 07-030 we used 5μL
Anti-monomethyl-H3K4 Abcam ab8895 2,5 -10μL
Anti-H3 Abcam ab1791 we used 1μL to check histone density
Bioruptor Diagenode UCD-200 TO
Sonotrode MS72 Bandelin
Miracloth Calbiochem 475855
Complete Protease Inhibitor Roche Group 11836145001

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References

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