एक पर्यावरण वायरल Hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी का प्रयोग समुदाय से एकल असहाय डीएनए डबल असहाय डीएनए और आरएनए के पृथक्करण

Immunology and Infection

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Summary

हम एक कुशल पर्यावरण वायरल समुदायों से एकल असहाय डीएनए डबल असहाय डीएनए और शाही सेना अणु अलग विधि का वर्णन. न्यूक्लिक एसिड फॉस्फेट युक्त बफ़र्स की बढ़ती सांद्रता के साथ hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी का उपयोग fractionated हैं. इस विधि सभी पर्यावरणीय नमूनों से वायरल न्यूक्लिक एसिड प्रकार के अलगाव परमिट.

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Fadrosh, D. W., Andrews-Pfannkoch, C., Williamson, S. J. Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography. J. Vis. Exp. (55), e3146, doi:10.3791/3146 (2011).

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Abstract

वायरस, विशेष रूप से bacteriophages (phages), पृथ्वी 1,2 पर सबसे अनेक जैविक संस्थाओं हैं. वायरस मेजबान कोशिका बहुतायत और विविधता मिलाना, पोषक तत्वों की साइकिल चालन के लिए योगदान, मेजबान सेल phenotype परिवर्तन, और दोनों मेजबान और 3 जीनों के पार्श्व हस्तांतरण के माध्यम से सेल वायरल समुदायों के विकास को प्रभावित. कई अध्ययनों से वायरस और उनके प्राकृतिक वातावरण की एक किस्म में कार्य क्षमता के चक्कर आनुवंशिक विविधता पर प्रकाश डाला है.

Metagenomic तकनीक वर्गीकरण विविधता और जटिल वायरल assemblages जिसका सदस्यों एकल असहाय डीएनए (ssDNA), डबल असहाय डीएनए (dsDNA) और आरएनए 4-9 जीनोटाइप होते कार्यात्मक क्षमता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. वर्तमान पुस्तकालय निर्माण पर्यावरण के डीएनए युक्त या शाही सेना युक्त वायरस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल एक प्रारंभिक nuclease उपचार की आवश्यकता होती है क्रम में nontargeted टेम्पलेट्स 10 हटायें है. हालांकि, वायरस समुदाय और वायरस विविधता के सामूहिक जीन पूरक की एक व्यापक समझ के जीनोम संरचना की परवाह किए बिना सभी सदस्यों के ज्ञान की आवश्यकता है. न्यूक्लिक एसिड उपप्रकारों शुद्ध Fractionation एक प्रभावी तंत्र है जिसके द्वारा समुदाय के आनुवंशिक हस्ताक्षर के एक सबसेट का त्याग किए बिना वायरल assemblages अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है.

Hydroxyapatite, कैल्शियम फॉस्फेट के एक क्रिस्टलीय फार्म, nucleic एसिड की जुदाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह प्रोटीन और रोगाणुओं में नियोजित किया गया है, 11 1960 के दशक के बाद से, . सकारात्मक आरोप लगाया Ca 2 के बीच आरोप बातचीत का शोषण करके + hydroxyapatite और नकारात्मक आरोप लगाया न्यूक्लिक एसिड subtypes के फॉस्फेट रीढ़ के आयनों, यह संभव है preferentially प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड subtype है दूसरों की स्वतंत्र elute . हमने हाल ही में डीएनए अनुक्रमण 12 की तैयारी में स्वतंत्र fractionate ssDNA, dsDNA और आरएनए युक्त वायरस के जीनोम के लिए इस रणनीति कार्यरत है. यहाँ, हम fractionation और ssDNA dsDNA, और शाही सेना मिश्रित वायरल hydroxyapatite chromotography का उपयोग assemblages से वायरल न्यूक्लिक एसिड की वसूली के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.

Protocol

1. समाधान की तैयारी

Hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन से पहले, फॉस्फेट बफ़र्स और तैयार रहना चाहिए hydroxyapatite ठीक से हाइड्रेटेड किया जाना चाहिए.

  1. 1M फास्फेट समाधान, पीएच 6.8: एक 1L फ्लास्क में बाँझ, DEPC इलाज एच 2 ओ के 1L में सोडियम फॉस्फेट एक भस्मक की 119.98g भंग एक 1L फ्लास्क में 1L को बाँझ, DEPC इलाज एच 2 ओ में सोडियम फॉस्फेट द्विबेसीय के 141.96g भंग द्वारा एक 1M सोडियम फॉस्फेट द्विबेसीय समाधान तैयार मोनो और di समाधान को 1:1 के अनुपात में मिश्रण. हलचल प्लेट और एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग कर मिश्रण पर प्लेस कुप्पी. सोडियम हीड्राकसीड (पीएच वृद्धि) या फॉस्फोरिक एसिड (पीएच कमी) जोड़कर 6.8 करने के लिए पीएच को समायोजित करें.
  2. 0.12M फास्फेट बफर: एक 500ml फ्लास्क में 1M समाधान फास्फेट, 6.8 पीएच, 10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 2.5ml, और 0.5m EDTA के 5ml 30ml गठबंधन. 225ml की एक मात्रा के लिए बाँझ, DEPC इलाज H2O जोड़ें. 6.8 पीएच को समायोजित करें. 250ml के लिए बाँझ, DEPC इलाज H2O जोड़ें. आटोक्लेव.
  3. 0.18M फास्फेट बफर: एक 500ml फ्लास्क में 1M समाधान फास्फेट, 6.8 पीएच, 10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 2.5ml, और 0.5m EDTA के 5ml 45ml गठबंधन. 225ml की एक मात्रा के लिए बाँझ, DEPC इलाज एच 2 हे जोड़ें . 6.8 पीएच को समायोजित करें. 250ml के लिए बाँझ, DEPC इलाज एच 2 हे जोड़ें. आटोक्लेव.
  4. 0.20M फास्फेट बफर: एक 500ml फ्लास्क में, 50ml 1M समाधान फास्फेट, 6.8 पीएच, 10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 2.5ml, और 0.5m EDTA के 5ml के गठबंधन. 225ml की एक मात्रा के लिए बाँझ, DEPC इलाज एच 2 हे जोड़ें . 6.8 पीएच को समायोजित करें. 250ml के लिए बाँझ, DEPC इलाज एच 2 हे जोड़ें. आटोक्लेव.
  5. 0.40 एम फास्फेट बफर: एक 500ml फ्लास्क में 1M समाधान फास्फेट, 6.8 पीएच, 10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 2.5ml, और 0.5m EDTA के 5ml 100ml गठबंधन. 225ml की एक मात्रा के लिए बाँझ, DEPC इलाज एच 2 हे जोड़ें . 6.8 पीएच को समायोजित करें. 250ml के लिए बाँझ, DEPC इलाज एच 2 हे जोड़ें. आटोक्लेव.
  6. "1.00m फास्फेट बफर" (इस समाधान में फॉस्फेट की वास्तविक एकाग्रता .91 एम): एक 500ml फ्लास्क में 1M फास्फेट समाधान, pH6.8 10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 2.5ml 30ml गठबंधन, और 5ml EDTA 0.5m. 225ml की एक मात्रा के लिए बाँझ, DEPC इलाज H2O जोड़ें. 6.8 पीएच को समायोजित करें. 250ml के लिए बाँझ, DEPC इलाज एच 2 हे जोड़ें. आटोक्लेव.
  7. Hydroxyapatite जलयोजन: hydroxyapatite की 1g बाहर वजन और एक 50ml ट्यूब जोड़ें. Hydroxyapatite 0.12M फॉस्फेट बफर के 6ml जोड़ें और मिश्रण करने के लिए पलटना. पहले 60 से तापमान लाने का उपयोग करने के लिए डिग्री सेल्सियस और मिश्रण अच्छी तरह से. समय की विस्तारित अवधि के लिए 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
  8. उपयोग करने के लिए पहले 60 डिग्री सेल्सियस पर सभी फॉस्फेट buffers और हाइड्रेटेड hydroxyapatite संतुलित करना

2. Econo - कॉलम के तैयार

  1. पानी निकलने की टोंटी बंद. विआयनीकृत एच 2 हे के साथ बार बार inverting स्तंभ और decanting द्वारा स्तंभ कई बार कुल्ला .
  2. Econo स्तंभ से पानी निकलने की टोंटी निकालें और बाँझ स्तंभ आटोक्लेव.
  3. बदलें और पानी निकलने की टोंटी बंद. Econo कॉलम बाँझ और सभी ग्लास सतहों कोट Sigmacote के 1ml जोड़ें. पानी निकलने की टोंटी और छानना खोलें.
  4. एक परिसंचारी पानी स्नान के लिए अनुलग्न स्तंभ और तापमान सेट से 60 डिग्री सेल्सियस एल्यूमीनियम पन्नी या फोम पाइप इन्सुलेशन के रूप में एक इन्सुलेट एजेंट कॉलम में लपेटकर स्तंभ भर में गर्मी के नुकसान के कम से कम राशि einsure करने के लिए सिफारिश की है.
  5. Econo कॉलम बाँझ, RNase मुक्त एच 2 ओ के साथ दो बार तो दो बार कुल्ला बाँझ, RNase मुक्त 0.12M फास्फेट बफर के साथ.

3. Hydroxypaptite Chromotography

  1. यकीन है कि बनाना पानी निकलने की टोंटी बंद है, धीरे धीरे Econo - स्तंभ के नीचे करने के लिए पूर्व तैयार resuspended hydroxyapatite 2ml जोड़ने के लिए एक बाँझ 2ml सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर.
  2. Hydroxyapatite गुरुत्वाकर्षण के बल के अंतर्गत 30 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें.
  3. स्तंभ और करीब पानी निकलने की टोंटी से बफर नाली. 60 ° सी एक गर्मी ब्लॉक या पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए. 500 μl और सेते के अंतिम मात्रा में 0.12M फॉस्फेट बफर के साथ न्यूक्लिक एसिड का मिश्रण
  4. जल्दी न्यूक्लिक 0.12M फॉस्फेट बफर में hydroxyapatite 2ml सीरम वैज्ञानिक स्तंभ परेशान नहीं सुनिश्चित करने के विंदुक का उपयोग करने के लिए तैयार एसिड लागू होते हैं.
  5. Nucleic एसिड के 30 मिनट के लिए hydroxyapatite करने के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति दें.
  6. स्तंभ के तहत एक 15ml ट्यूब प्लेस, पानी निकलने की टोंटी खोलने और प्रारंभिक ssDNA युक्त नमूना इकट्ठा. पानी निकलने की टोंटी बंद.
  7. स्तंभ नहीं परेशान, पानी निकलने की टोंटी खोलने के, और पिछले चरण से 15ml ट्यूब में एकल असहाय डीएनए एकत्र करने के लिए सुनिश्चित बनाने hydroxyapatite 0.12M फॉस्फेट बफर के 6ml जोड़ें. पानी निकलने की टोंटी बंद.
  8. क्लोरोफॉर्म: phenol के 1 मात्रा जोड़ें isoamyl (25:25:1 v / v / v) शराब ट्यूब को हल करने के लिए, सख्ती मिश्रण और 15 मिनट के लिए 3500 XG अपकेंद्रित्र. एक नया 15ml ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला युक्त ssDNA.
  9. 3.76 और 3.87 दोहराएँ ई करने के लिए 0.20M फॉस्फेट बफर के 6ml का उपयोगऔर स्तंभ से शुद्ध वीणा शाही सेना के संग्रह के लिए एक नया 15ml ट्यूब उपयोग सुनिश्चित कर रही है.
  10. 3.76 और 3.87 दोहराएँ 0.40M फॉस्फेट बफर के 6ml का उपयोग elute और संग्रह के लिए एक नया 15ml ट्यूब का उपयोग सुनिश्चित करने के स्तंभ से dsDNA शुद्ध.
  11. 3.76 और 3.87 दोहराएँ 1.00m फॉस्फेट बफर के 6ml का उपयोग करने के लिए किसी भी अवशिष्ट dsDNA के संग्रह के लिए एक नया 15ml ट्यूब उपयोग सुनिश्चित बनाने के स्तंभ पट्टी.

4. न्यूक्लिक एसिड नमूने Desalting

  1. स्थानांतरण नमूने के 4 5ml एक Amicon अल्ट्रा-4 केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस एक 30,000 आणविक वजन Ultracel झिल्ली कटौती के साथ outfitted है.
  2. 500μl <६,००० XG, 30 पर कताई द्वारा नमूना ध्यान डिग्री सेल्सियस, एक निश्चित कोण रोटर में 5 मिनट (या जब तक केंद्रित मात्रा हासिल की है). के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
  3. Amicon अल्ट्रा 4 केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस के लिए नमूने (एस) के शेष जोड़ें और मात्रा RNase मुक्त 1X ते बफर के साथ 4 5ml तक लाने.
  4. 500μl <६,००० XG, 30 पर कताई द्वारा नमूना ध्यान डिग्री सेल्सियस, एक निश्चित कोण रोटर में 5 मिनट (या जब तक केंद्रित मात्रा हासिल की है). के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
  5. Amicon अल्ट्रा 4 केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस RNase मुक्त 1X ते बफर के 4 5ml जोड़ें. 500μl <६,००० XG, 30 centrifuging नमूना ध्यान डिग्री सेल्सियस, एक निश्चित कोण रोटर में 5 मिनट (या जब तक केंद्रित मात्रा हासिल की है). के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
  6. 4.5 कदम एक अतिरिक्त 5 बार दोहराएँ पूरी तरह से न्यूक्लिक एसिड नमूना (ओं) को फीका बनाना.
  7. शेष नमूने (ओं) को एक बाँझ 1.7ml Eppendorf ट्यूब स्थानांतरण. 1/10th मात्रा 3M सोडियम एसीटेट, पीएच 7.0, 100% इथेनॉल के दो संस्करणों, और Glycoblue के 1μl जोड़ें. Vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स.
  8. 28,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 60 मिनट पर अपकेंद्रित्र. निथारना गोली को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करने. 70% इथेनॉल 300μl जोड़ें. 28,000 XG, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए स्पिन. निथारना, शुष्क और RNase मुक्त ते बफर के एक उचित मात्रा में प्रत्येक अंश resuspend.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1 fractionate ssDNA, dsDNA और आरएनए न्यूक्लिक एसिड एक मिश्रित वायरल जमावड़ा से hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करने के लिए प्रस्तुत तरीकों का सार. इस विधि के बीच नकारात्मक आरोप लगाया न्यूक्लिक एसिड की फॉस्फेट रीढ़ की हड्डी और सकारात्मक आरोप लगाया 2 Ca प्रभारी बातचीत कारनामे + आयनों hydroxyapatite में मौजूद है और बढ़ती फॉस्फेट बफर सांद्रता के साथ न्यूक्लिक एसिड subtypes के कुशल fractionation (ssDNA, dsDNA और आरएनए) के लिए अनुमति देता है 12.

इन विट्रो ज्ञात (M13mp18) ssDNA, dsDNA (लैम्ब्डा) और आरएनए के "समुदाय" में एक hydroxyapatite fractionation (MS2 और phi6) वायरल जीनोम चित्रा 2 में सचित्र है. न्यूक्लिक एसिड बराबर सांद्रता में संयुक्त थे, hydroxyapatite स्तंभ पर लागू थे और फॉस्फेट बफर के एक बढ़ती हुई एकाग्रता का उपयोग eluted. प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड subtype एक अंश से अगले करने के लिए कम से कम 9% से अधिक ले जाने के साथ दूसरों की स्वतंत्र elutes.

न्यूक्लिक एसिड एक वायरल Chesapeake खाड़ी से एकत्र समुदाय से अलग - थलग करने के लिए इस तकनीक के आवेदन 3 चित्र में दिखाया कुल न्यूक्लिक एसिड शुद्ध वायरस से अलग उपज hydroxyapatite स्तंभ के लिए आवेदन किया था. जीनोमिक ssDNA शाही सेना, और dsDNA मिलकर सामग्री स्वतंत्र 0.12M, 0.20M और फॉस्फेट बफर के 0.40M/1.00M सांद्रता क्रमशः के साथ eluted था. डबल असहाय डीएनए 0.40M और 1.00m के फॉस्फेट सांद्रता में eluted है और इस मामले में, ssDNA और आरएनए जीनोटाइप की तुलना में इस वायरल समुदाय हावी है. यह प्रेक्षण उम्मीद समुद्री वायरल समुदाय संरचना और estuarine वातावरण जहां वसूली न्यूक्लिक एसिड के बहुमत dsDNA 13 के साथ संगत है .

चित्रा 1
चित्रा 1. न्यूक्लिक एसिड के fractionation के लिए hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी विधि के प्रवाह आरेख . SsDNA dsDNA, और शाही सेना का एक मिश्रण 0.12M फॉस्फेट बफर में तैयार 60 डिग्री सेल्सियस पर गरम है और एक hydroxyapatite एक निरंतर पर 60 बनाए रखा स्तंभ के लिए लागू डिग्री सेल्सियस एक परिसंचारी पानी के स्नान का उपयोग कर. न्यूक्लिक एसिड (ssDNA, शाही सेना और dsDNA) फॉस्फेट युक्त एक बफर की बढ़ती सांद्रता के साथ hydroxyapatite से eluted हैं. यह आंकड़ा सूक्ष्म जीव विज्ञान के अमेरिकन सोसायटी से अनुमति के साथ reproduced है और मूल रूप से एंड्रयूज - Pfannkoch एट अल में विशेष रुप से प्रदर्शित किया गया था. २०१० 12.

चित्रा 2
चित्रा 2 में जाना जाता वायरल न्यूक्लिक hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर एसिड के पृथक्करण. M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA और लैम्ब्डा dsDNA (2-5 गलियों, क्रमशः) के समान सांद्रता (6 लेन) संयुक्त थे और एक hydroxyapatite स्तंभ को लागू. Singlई असहाय (M13mp18) डीएनए, शाही सेना (MS2/phi6) और dsDNA (लैम्ब्डा) स्वतंत्र hydroxyapatite स्तंभ (8 लेन) 0.12M, 0.18M (9 लेन) और 0.40M/1.00M (10 लेन) का उपयोग कर से eluted थे . एक 1kb सीढ़ी (1 गलियों, 7) करने के लिए जीनोम आकार की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह आंकड़ा सूक्ष्म जीव विज्ञान के अमेरिकन सोसायटी से अनुमति के साथ reproduced है और मूल रूप से एंड्रयूज - Pfannkoch एट अल में विशेष रुप से प्रदर्शित किया गया था. २०१० 12.

चित्रा 3
चित्रा 3 Chesapeake खाड़ी के भीतर एक समुदाय से अलग वायरल न्यूक्लिक एसिड की पृथक्करण . न्यूक्लिक एसिड और अलग थे एक hydroxyapatite स्तंभ से लागू होता है. ssDNA (0.12M लेन), (0.20M लेन) शाही सेना और dsDNA (गलियों 0.40M/1.0M) स्वतंत्र रूप से फॉस्फेट 0.12M 0.20M, और 0.40M/1.00M के बफर सांद्रता का उपयोग कर रहे थे क्रमशः eluted,. हाय मास डीएनए सीढ़ी (L1 लेन) और 1kb सीढ़ी (लेन L2) नेत्रहीन अनुमानित आणविक वजन और nucleic एसिड के जन की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया. यह आंकड़ा सूक्ष्म जीव विज्ञान के अमेरिकन सोसायटी से अनुमति के साथ reproduced है और मूल रूप से एंड्रयूज - Pfannkoch एट अल में विशेष रुप से प्रदर्शित किया गया था. २०१० 12.

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Discussion

hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी यहाँ प्रस्तुत पद्धति मिश्रित वायरल assemblages, जब लक्ष्य समुदाय के कुल न्यूक्लिक एसिड संरचना का अध्ययन से न्यूक्लिक एसिड के fractionation के लिए एक अत्यधिक कुशल और मजबूत उपकरण है. आम तौर पर, ssDNA शाही सेना, और dsDNA स्तंभ फोटो फॉस्फेट बफर लगभग क्रमशः ~~ 0and 0.40M से अधिक सांद्रता से elute जाएगा. हालांकि, hydroxyapatite के प्रत्येक तैयारी एक अलग संरचना और क्षालन प्रोफ़ाइल है इसलिए यह महत्वपूर्ण है प्रत्येक ज्ञात nucleic एसिड (खेती वायरस तैयारी से जैसे) का उपयोग कर तैयारी का परीक्षण कर सकते हैं. यह फॉस्फेट युक्त वांछित nucleic एसिड elute की जरूरत buffers की विशिष्ट सांद्रता का पता लगाने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देगा.

इस तकनीक का एक सीमित कारक उपलब्ध Ca 2 की मात्रा + hydroxyapatite है कि न्यूक्लिक एसिड की फॉस्फेट रीढ़ बाध्य कर सकते हैं में मौजूद आयनों है . स्तंभ में hydroxyapatite की capacityamount बढ़ाया जा सकता है या नीचे स्तंभ के लिए (पानी तख्ताबंदीवाला स्तंभ और इस्तेमाल किया hydroxyapatite की राशि के आकार से निर्धारित) और क्षालन के लिए इस्तेमाल किया बफ़र्स की मात्रा को बढ़ाया जा सकता है या नीचे बहुत छोटे समायोजित या इनपुट nucleic एसिड की बहुत बड़ी मात्रा में है, लेकिन अंततः पानी तख्ताबंदीवाला स्तंभ के आकार के द्वारा सीमित है.

इसके अतिरिक्त, एक बैच तकनीक जहां nucleic एसिड, hydroxyapatite और फॉस्फेट युक्त बफ़र्स एक ट्यूब, मिश्रित में संयुक्त रहे हैं, और कम गति पर centrifuged लक्षित nucleic एसिड को अलग करने का एक वैकल्पिक तरीका है. इस रणनीति के कुछ उदाहरणों में फायदेमंद हो सकता है, लेकिन के रूप में जो और अधिक सटीक रहे हैं और न्यूक्लिक एसिड के बेहतर fractionation प्रदान chromatographic तरीकों के रूप में विश्वसनीय नहीं है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस शोध विज्ञान के कार्यालय (BER), अमेरिकी ऊर्जा विभाग, सहकारी समझौते नहीं द्वारा समर्थित किया गया था. De-FC02 - 02ER63453, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन माइक्रोबियल जीनोम अनुक्रमण कार्यक्रम (पुरस्कार संख्या 0,626,826 और 0,731,916). हम अपनी तकनीकी विशेषज्ञता और सलाह और के एरिक Wommack के लिए पर्यावरण नमूना संग्रह के साथ उसकी सहायता के लिए जॉन ग्लास धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Econo-Column Bio-Rad 737-0717 0.7cm ID package/2
Hydroxyapatite Bio-Rad 130-0520 DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td>
Sodium Phosphate, Monobasic VWR international VW1497-01 Monohydrate, Crystal 500g
Sodium Phosphate, Dibasic VWR international VW1496-01 Anhydrous, Powder 500g
DEPC-treated Water Invitrogen AM9922 1L
10% SDS Solution Invitrogen 24730-020 UltraPure, 1L
0.5M EDTA Invitrogen AM9262 pH 8.0, 1L
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML
2ml serological pippette VWR international 89130-884 Polystyrene, Sterile
BD Falcon Centrifuge Tubes VWR international 21008-936 15ml, Sterile
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) Invitrogen 15593-031 UltraPure, 100ml
Amicon Ultra-4 Centrifugal Device EMD Millipore UFC803024 Ultracel-30 membrane
20X TE Buffer, Rnase free Invitrogen T11493 100ml
Glycoblue Invitrogen AM9516 15mg/ml

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References

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