Quantitation וניתוח של היווצרות של HO-Endonuclease מגורה טרנסלוקציות כרומוזומלית ידי Strand-סינגל חישול ב Saccharomyces cerevisiae

Biology
 

Summary

Assay HO-מגורה טרנסלוקציה מפקחת גדיל יחיד חישול בעקבות הקמתה של גדיל הדנ"א הכפול הפסקות בבית לוקוסים מספר דיפלואידי

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liddell, L., Manthey, G., Pannunzio, N., Bailis, A. Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (55), e3150, doi:10.3791/3150 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

וריאציה גנטית מתווכת לעתים קרובות על ידי rearrangements גנומית שעולות דרך האינטראקציה בין מפוזרים אלמנטים חוזרים כיום בגנום כל האיקריוטים. תהליך זה הוא מנגנון חשוב ליצירת גיוון בין ובתוך אורגניזמים 1-3. גנום האדם מורכב מרצף של כ 40% חוזרות ממוצא retrotransposon, כולל מגוון של קווים SINEs 4. אירועים Exchange בין האלמנטים האלה חוזרים יכול להוביל rearrangements הגנום, כולל טרנסלוקציות, שיכולים לשבש את המינון גנים ביטוי שיכול לגרום מחלות אוטואימוניות 5 לב וכלי דם, כמו גם סרטן בבני אדם 6-9.

חליפין בין אלמנטים חוזרים מתרחשת במגוון דרכים. חליפין בין רצפים המשתפים הומולוגיה מושלם (או כמעט מושלמת) מתרחשת על ידי תהליך הקרוי רקומבינציה הומולוגיים (HR). לעומת זאת, שאינם הומולוגיים סוף להצטרף (NHEJ) משתמשת מעט, או לא הומולוגיה ברצף לחילופי 10,11. המטרה העיקרית של משאבי אנוש, בתאים mitotic, היא לתקן הגדיל פעמיים הפסקות (DSBs) endogenously שנוצר על ידי שכפול ה-DNA סוטה ונגעים חמצוני, או על ידי חשיפה לקרינה מייננת (IR), ושאר סוכני ה-DNA אקסוגני נזק.

ב assay המתואר כאן, DSBs נוצרות בו זמנית הגובלים מצעים רקומבינציה בשני לוקוסים כרומוזומליות שונות בתאים דיפלואידי ועין מתנהלת על ידי-גלקטוז HO-endonuclease (איור 1). התיקון של כרומוזומים שבורים מייצר טרנסלוקציות כרומוזומליות ידי גדיל בודד חישול (SSA), תהליך שבו רצפים הומולוגיים סמוך קצות הכרומוזומים מחוברים קוולנטית לאחר חישול. אחת של מצעים, his3-Δ3 ", מכיל 3" מקוצץ HIS3 אלל והוא ממוקם על עותק אחד של כרומוזום XV על מוקד HIS3 הילידים. המצע השני, his3-Δ5 ", נמצא מוקד LEU2 על עותק אחד של כרומוזום השלישי, והוא מכיל 5" מקוצץ HIS3 אלל. מצעים שניהם מוקף אתר הכרה endonuclease HO כי יכול להיות ממוקד על ידי חתך HO-endonuclease. ההכרה HO endonuclease אתרים יליד מוקד MAT, על שני עותקים של כרומוזום III, נמחקו על כל הזנים. זה מונע אינטראקציה בין מצעים רקומבינציה אחרים מסתיים כרומוזום שבור מלהתערב assay. Kan-MX-המסומנים גלקטוז-ועין מתנהלת ביטוי HO קלטת endonuclease מוכנס אל מוקד TRP1 על כרומוזום IV. 311 המניות מצעים bp או 60 נ"ב של רצף HIS3 קידוד כי ניתן להשתמש על ידי המנגנון HR לתיקון על ידי SSA. תאים אלה להשתמש מצעים לתקן כרומוזומים שבורים על ידי משאבי אנוש טופס אלל שלם HIS3 ו tXV: טרנסלוקציה III כרומוזומליות שניתן שנבחרו על ידי היכולת לגדול על היסטידין בינוני חסר (איור 2 א). שכיחות טרנסלוקציה ידי HR מחושב על ידי חלוקת מספר מושבות prototrophic היסטידין שעולות על מדיום סלקטיבי במספר הכולל של תאים קיימא המתעוררות לאחר ציפוי דילולים המתאים על מדיום שאינו סלקטיבי (תרשים 2B). מגוון של מוטציות תיקון דנ"א שימשו במחקר בקרה גנטית של היווצרות טרנסלוקציה ידי SSA באמצעות מערכת זו 12-14.

Protocol

1. HO-מגורה טרנסלוקציה תדרים

  1. לחסן עצמאית 10-20 1 מ"ל של תרבויות YPGly / לאק בינוני (1% תמצית שמרים, peptone 2%, גליצרול 3% ו חומצת החלב 3%) עם מושבות אחת של הגנוטיפ הרצוי. דגירה התרבויות בין לילה, או במשך זמן מספיק כדי להגיע צפיפות התאים של כ 5x10 7-1x10 8 תאים / מ"ל, ב 30 מעלות צלזיוס על הכתף, או עם תסיסה עדינה.
  2. הוסף גלקטוז לתרבויות לריכוז סופי של 2% כדי לגרום HO endonuclease מכוונת DSBs ב-his3 Δ3 "(כרומוזום III) ו-his3 Δ5" (כרומוזום XV) מצעים טרנסלוקציה.
  3. דגירה של 4 שעות ב 30 ° C על הכתף, או עם תסיסה עדינה.
  4. לאחר 4 שעות, דילולים צלחת המתאימה של תרבויות על YPD (1% תמצית שמרים, peptone 2%, דקסטרוז 2%) להניב כ 100-200 מושבות בכל צלחת, ומספר מספיק של תאים על היסטידין בינוני חסר להניב הנצפה מספר מושבות + שלו רקומביננטי. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.

הערה: שלב 1.4 מתאר את הנחישות של תדרים טרנסלוקציה בתנאים סלקטיבית על ידי ציפוי התרבויות על היסטידין חסר בינוני. Assay זה גם יכול להתנהל תחת תנאים בלתי סלקטיבי על ידי ציפוי תרבויות על YPD, ולאחר מכן העתק-ציפוי המושבות העולות על שלו צלחות 2-3 ימים לאחר מכן. שיטות אלה מייצרים תדרים דומים של טרנסלוקציה (איור 2C).

  1. קבע את תדירות טרנסלוקציה על ידי חלוקת מספר מושבות prototrophic היסטידין במספר הכולל של תאים קיימא מצופה (נקבע על ידי דילולים ציפוי על YPD). קבע את תדירות טרנסלוקציה חציון 95% CI 15.

2. ציפוי יעילות

  1. הסרת aliquot של תאים מתרבות כל לילה, ולקבוע מספר תאים על ידי hemacytometer לספור (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1).
  2. פלייט כ 100-200 תאים באמצעות דילול המתאים על YPD. דגירה של 2-3 ימים ב 30 מעלות צלזיוס (למשל עבור תרבות עם צפיפות התאים של 1x10 8 תאים / מ"ל, יש צלחת 100-200 μl של דילול 10-5 לכל צלחת).
  3. הוסף גלקטוז 20% התרבויות לריכוז סופי של 2%.
  4. לאחר 4 שעות, להסיר aliquot של תאים מתרבות כל, לקבוע את מספר הסלולרי על ידי ספירת hemacytometer, וכ 100-200 צלחת התאים באמצעות דילול המתאים על YPD. דגירה של 2-3 ימים ב 30 ° C.
  5. קביעת יעילות ציפוי על ידי חלוקת מספר מושבות המופיעים YPD במספר התאים מצופה, ומכפיל את זה המנה ב -100. קבע את האחוז החציוני עם מרווח ביטחון של 95%.

3. הגנום כתם דרום ניתוח

  1. בחר יחיד + שלו מושבה רקומביננטי ממשפט אחד עצמאית להכין הדנ"א הגנומי 16.
  2. תקציר כ 4 מיקרוגרם של ה-DNA עם endonuclease הגבלה BamHI.
  3. BamHI נפרדת מתעכל שברי על 0.7% agarose ג'ל, ולהעביר קרום ניילון חיובי טעונים (Hybond + N, GE Healthcare קוד מוצר:. RPN303B) 17.
  4. להכליא עם בדיקה P-32 שכותרתו מתקבל על ידי תחול אקראית (Amersham Biosciences קוד מוצר:. RPN1604) עם כפיל 1.8 BamHI / BamHI kb גנומי המכיל את הגן HIS3.
  5. דמיינו שברי DNA על ידי autoradiography או phosphorimaging.

4. כתם כרומוזום ניתוח באמצעות הכרומוזומים נפרדו ב קונטור-הידק שדה חשמלי הומוגני (שף):

  1. הכן את הכרומוזומים של הנבחרת שלו recombinants + ב תקעים agarose 18:
    • לגדול תרבות נוזלי של שלו + מועמד tXV: III כרומוזום המכיל רקומביננטי ב 5 מ"ל של YPD כ 1-2 x 10 8 תאים / מ"ל.
    • ספין למטה לשטוף את התאים 2 פעמים עם 50 mM EDTA.
    • תאים Resuspend ב μl כ 200 של 50 mM EDTA, וחמים עד 50 ° C.
    • הוסף נפח שווה של 2% מותכת (w / v) נמוכה להמיס agarose הביא 50 ° C, ומערבבים היטב.
    • לוותר על כ -80 aliquots μl לתוך תבניות תקע, ולאפשר להם להתקרר למשך 30 דקות ב 4 ° C.
    • Extrude תקעים מן התבנית לתוך צלחת של 12 באר. עד חמישה תקעים יכול להיות ממוקם היטב לתוך כל אחד.
    • הוסף 3 מ"ל של תמיסת spheroplasting מוכן טרי (14 mM 2-β-mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 0.5 מ"ג / מ"ל ​​Zymolyase 20T, 10 mM טריס-HCl, pH 7.5, 1 M סורביטול) זה טוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם תסיסה עדינה.
    • הסר פתרון spheroplasting ולהחליף מ"ל 3 פתרון של LDS (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) ליתיום סולפט Dodecyl, adjust-pH 8.0 ל). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם תסיסה עדינה.
    • הסר פתרון LDS ולהחליף aliquot עוד 3 מ"ל של LDS. לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה עם תסיסה עדינה.
    • הסר LDS ולהחליף עם 3 מ"ל של 0.2 X NDS (0.6 גרם טריס הבסיס, 93 גרם Dihydrate Disodium EDTA, 5 גרם N-Lauroyl Sarcosine, כדי להתאים את pH 8.0, הביא 500 מ"ל עם DH 2 O). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עם תסיסה עדינה. הסר NDS, וחזור 2 פעמים.
    • הסר NDS ולהחליף עם 3 מ"ל TE. לשטוף עם תסיסה עדינה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חזור 4 פעמים.
    • חנות תקעים ב 4 מעלות צלזיוס 2 מ"ל של TE. Plugs יכול לשמור עד שנה.
  2. הכרומוזומים נפרדים על 1% agarose ג'ל באמצעות Bio-Rad שף DRII מנגנון בשעה 14 ° C (קטלוג #: 170-3612).

פרמטרים: 1 חסימת רחוב: 70s זמן לעבור, 15 שעות בבית 6V/cm.
בלוק 2 nd: זמן לעבור 120s, 11 שעות בבית 6V/cm

  1. דמיינו כרומוזומים על ידי צביעה עם ברומיד ethidium 1μg/ml למשך 30 דקות, irradiating עם 60 mJ של UV ב Stratalinker UV (Stratagene), ו-de מכתים למשך 30 דקות ב DH 2 O. Irradiating מוכתם ethidium ברומיד ניקס כרומוזומי ה-DNA, כדי לאפשר העברה יעילה הממברנה.
  2. העברת כרומוזומים קרום מטען חשמלי חיובי (+ N Hybond, GE Healthcare קוד מוצר:. RPN303B) על ידי פעולה נימי בתנאים denaturing (0.4N NaOH, 1.5M NaCl).
  3. להכליא עם בדיקה P-32 שכותרתו מתקבל על ידי תחול אקראית (Amersham Biosciences קוד מוצר:. RPN1604) עם כפיל 1.8 BamHI / BamHI גנומית kb המכיל את הגן HIS3 17.
  4. דמיינו כרומוזומים על ידי autoradiography או phosphorimaging.

5. נציג תוצאות:

ייצוג גרפי של assay טרנסלוקציה מתואר ברמה כרומוזומליות (איור 1). סכמטי של הליך הניסוי מוצג גם (איור 2 א). טרום שני שלאחר אינדוקציה יעילות ציפוי נקבעים על ידי חלוקת סך של תאים קיימא המושבה להרכיב במספר הכולל של גופי התא בתרבות נקבע על ידי hemacytometer לספור (איור 4 ב). טרום ופוסט אינדוקציה יעילות ציפוי לא היו שונים משמעותית עבור wild-type תאים (p-value = 0.1400) (טבלה 1).

טבלה 1
טבלה 1. טרום ופוסט אינדוקציה יעילות ציפוי של wild-type תאים.

מספר גופים תא למיליליטר נקבעים על ידי ספירת hemacytometer.
ב מספר תאים קיימא למיליליטר נקבעים על ידי ציפוי דילולים המתאים על מדיום שאינו סלקטיבי לייצר ~ 100-200 מושבות.
ג טרום ופוסט אינדוקציה יעילות ציפוי נקבעים על ידי חלוקת סך של קיימא, המושבה להרכיב, תאים על ידי המספר הכולל של גופי התא בתרבות, נקבע על ידי ספירת hemacytometer.

הדבר מצביע על נוכחות או העדר של כרומוזום או טרנסלוקציה אינה משפיעה על היכולת לשרוד היווצרות DSB. תדירות טרנסלוקציות כרומוזומליות ניתן מחושב על ידי חלוקת מספר מושבות prototrophic היסטידין במספר הכולל של תאים קיימא נקבע על ידי ציפוי על YPD (תרשים 2B). Assay זה יכול להתבצע באמצעות זנים שונים של גנוטיפ לזהות כיצד אובדן תפקוד החלבון משפיע SSA (כלומר rad51Δ - / -). תדרים רקומבינציה נקבע זנים שונים אז יכול להיות בגרף להשוות הבדלים ביכולת של זנים אלה כדי לתקן את HO-endonuclease DSBs המושרה על ידי SSA (איור 2C). תדרים טרנסלוקציה שהושג עם זן פראי סוג דיפלואידי תחת סלקטיבית (2.2x10 -2) ולא סלקטיבי (2.17x10 -2) התנאים לא היו שונים זה מזה מבחינה סטטיסטית (p-value = 0.9131), בעוד תדרים טרנסלוקציה שהושגו באופן סלקטיבי (6.0x10 -2) ולא סלקטיבי (11.9x10 -2) עם rad51Δ - / - הומוזיגוטי היו דומים אך שונים מבחינה סטטיסטית (p-value = 0.0089). תדרים שהושגו הן סלקטיבי (p-value = 0.0001) ולא סלקטיבי (p-value = 0.0002) עם ° rad51 - / - הומוזיגוטי היו שונות מבחינה סטטיסטית מאלו שהושגו באמצעות התנאים המתאימים עם זן פראי סוג.

המשוערת טרנסלוקציה נושאות שיבוטים ניתן לבדוק עוד יותר על ידי כתם דרום גנומית ומנתח כתם כרומוזומליות (איור 3). לניתוח הדרום, הדנ"א הגנומי מתעכל עם endonuclease BamHI לפני ג'ל אלקטרופורזה agarose, סופג הכלאה ל 32P-שכותרתו 1.8kb HIS3 בדיקה לדמיין את האבחון 0.8 kb his3Δ200, 1.7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tIII: XV, 5 kb tXV: III, 8 kb his3-Δ5' שברים (איור 3B.1) . כרומוזומים שלם יכול להיות מוכן, מופרדים על ידי שף (איור 3B.2), מחק את ניילון הכלאה עם 32 P-1.8 שכותרתו kb HIS3 בדיקה לדמיין את 1.1 Mb XV כרומוזום שלם, 0.8 Mb tXV: כרומוזום טרנסלוקציה השלישי, 0.6 Mb tIII: כרומוזום טרנסלוקציה XV, ו 0.3 Mb כרומוזום שלם III (איור 3B.3). Map A graphical depicting expected BamHI endonuclease-DNA genomic digested fragments, and parent and chromosomes recombinant, is depicted (Figure 3A).

איור 1
באיור 1. כינונה של כרומוזומים טרנסלוקציה של גדיל יחיד חישול (SSA). 1) DSBs נוצרות ב-his3 Δ3 'ו his3-Δ5 "מצעים (הכרומוזומים XV ו-III, בהתאמה) על ידי endonuclease HO בעקבות תוספת של גלקטוז לתרבויות. 2) DSBs מעובדים ליצור '3 חד גדילי בקצות הכרומוזומים שבור. 3) מכונות anneals SSA 311 משלימים או 60 נוקלאוטיד יחיד תקועים HIS3 רצפים נוצרו בכל אחד מצעים רקומבינציה. Non-הומולוגיים זנבות נוצר על חישול יוסרו על ידי עיכול endonuclease. משלימה four המסוכך נ"ב על שברי כרומוזומליות הנותרים נוצר על ידי עיכול HO-endonuclease גם לחשל. 4) קשירת מסכם יצירת שלם HIS3 גנים tXV: כרומוזום טרנסלוקציה III ידי SSA. תאים נושאת כרומוזום זה יכול להיות נבחר על ידי היכולת שלהם לגדול על היסטידין חסר בינוני. קשירת עשוי גם ליצור את tIII הגומלין: כרומוזום טרנסלוקציה XV על ידי מנגנון NHEJ דמוי.

איור 2
איור 2. Assay לקביעת התדירות של טרנסלוקציה ידי SSA.) אחת מ"ל YPGly / לאק תרבויות הם מחוסן עם מושבות של תאים בודדים של גנוטיפ לבחור גדלה צפיפות מתאימה של כ 5x10 7-1x10 8 תאים / מ"ל. גלקטוז הוא הוסיף ריכוז סופי של 2% כדי ליצור DSBs על מצעים רקומבינציה על כרומוזומים III ו-XV. כדי לנהל את assay בתנאים סלקטיבית, דילולים המתאימים עשויים כך כ 100-200 תאים מצופה על YPD ואת מספר מספיק של תאים מצופה על היסטידין חסר בינוני להניב מספר הנצפה של מושבות + שלו רקומביננטי. כדי לנהל את assay ללא בחירה, כ 100-200 תאים מצופה על YPD, גדל במשך שבועיים עד שלושה ימים מושבות אחת ואז העתק מצופה על היסטידין בינוני חסר. ב) תדירות טרנסלוקציה ניתן לקבוע על ידי חלוקת מספר מושבות הגדלים על צלחות שלו על ידי השבר הגדלים על YPD. ג) תדרים טרנסלוקציה של זנים של גנוטיפ שונה (כלומר wild-type ו rad51Δ - / -) בגרף ניתן להשוות ההבדלים ביכולת של זנים אלה כדי לתקן את DSBs ידי SSA.

איור 3
איור 3. קביעת יעילות ציפוי. (א) aliquot של תאים נלקח מתרבות לילה לפני ואינדוקציה הודעה DSB, דילולים המתאימים עשויים, ואחריו ספירת hemacytometer כדי לקבוע את המספר הכולל של גופי התא לכל מ"ל של התרבות. דילולים המתאימים מצופה על גבי מדיום לא סלקטיבית כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים קיימא לכל מ"ל, על ידי ספירת המושבות המופיעות על YPD. (ב) היעילות ציפוי נקבע אז על ידי חלוקת המספר הכולל של תאים קיימא על ידי המספר הכולל של גופי התא, ועל הכפלת זו המנה ב -100.

איור 4
איור 4. איתור אירועים טרנסלוקציה כרומוזומלית על ידי כתם דרום גנומי כתם מנתח כרומוזום.
א) ייצוג גרפי של כרומוזומים הרלוונטיים לפני (משמאל) לאחר היווצרות (מימין) טרנסלוקציה.
מידות של הורה הכרומוזומים רקומביננטי מפורטים megabase זוגות (MB). גדלים של שברי הגבלה המכיל רצפים רלוונטי שנוצר על ידי עיכול BamHI של הדנ"א הגנומי מן ההורה זנים רקומביננטי, וגילה כתמים על ידי הכלאה עם כפיל 1.8 kb HIS3 BamHI גנומי, מפורטים kilobase זוגות (KB). כרומוזומים לא נמשכים סולם.
ב) ניתוח פיזית של טרנסלוקציה נושאות שיבוטים המשוערת.
(1) ניתוח הגנום כתם הדרום - הדנ"א הגנומי נאסף מעוכל עם endonuclease הגבלה BamHI, מופרדים על ידי ג'ל אלקטרופורזה, blotted על ניילון, הכלאה ל 32 P-1.8 תווית בדיקה HIS3 kb לדמיין את שברי הבאים: 0.8 kb his3Δ200, 1.7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tIII: XV, 5 kb tXV: III, 8 kb his3-Δ5 ". Lanes: א) דיפלואידי הורה, b) + לא הדדי טרנסלוקציה רקומביננטי, ג) שלו שלו + טרנסלוקציה הדדית רקומביננטי.
(2) השף ג'לים - כרומוזומים שלמים שהוכנו תקעים agarose, מופרדים על ידי שף, מוכתם ברומיד ethidium ו דמיינו תחת אור UV. Lanes: כנ"ל.
(3) כתמים כרומוזום - הכרומוזומים מופרדים היו מחק כדי ניילון הכלאה עם 32 P-1.8 תווית בדיקה HIS3 kb לדמיין את הכרומוזומים הבאים: 1.1 Mb XV כרומוזום שלם, 0.8 Mb tXV: כרומוזום טרנסלוקציה השלישי, 0.6 Mb tIII: טרנסלוקציה XV כרומוזום, ו 0.3 Mb III כרומוזום שלם. Lanes: כנ"ל.

Discussion

מינון גבוה של קרינה מייננת להציג הסיכון הגלום של חוסר יציבות הגנום באמצעות הדור של מספר רב של DSBs 19. הגנום האיקריוטים הם גדושה רצפים חוזרים כי הם מצעים מעולה להפקת טרנסלוקציות ו rearrangements גנומית אחרים 20,21. טרנסלוקציות כרומוזומליות ידי HR הם נצפו לעתים קרובות כאשר DSBs מוצגים בין רצפים חוזרים 12,21,22. ראיות מכריעות עולה כי הרבה של חוסר יציבות גנומית הקשורים לוקמיה לימפומה וכן ניתן לייחס טרנסלוקציות כרומוזומליות, המדגיש את החשיבות של הבנה כיצד מנגנון זה מתרחש אאוקריוטים 22,23. פיתחנו מערכת בשמרים ניצני לבחינת מבנה הכרומוזומים טרנסלוקציה ידי DSB-Induced HR בין אזורים קצר הומולוגיה על כרומוזומים שונים כי הם דומים בגודלם אלמנטים חוזרים הפזורים השמרים ואת הגנום האנושי.

ב assay, המצע טרנסלוקציה של his3-Δ3 ממוקם על עותק אחד של כרומוזום XV. אלל אחרים his3 (his3-Δ200) יש המחיקה ~ 1kb של האמרגן HIS3 ואת רצף קידוד שמונע רצף זה מלשמש כתבנית לתיקון 24. המצע "his3-Δ5 נמצא מוקד LEU2 על עותק אחד של כרומוזום השלישי, עם העתק השני של כרומוזום III המכיל אלל ללא שינוי LEU2 (איור 1). גלקטוז-ועין מתנהלת ביטוי HO endonuclease קלטת המסומנים Kan-MX היה מוכנס לתוך מוקד TRP1 של כרומוזום IV (trp1: GAL-HO-Kan-MX). המצע כל טרנסלוקציה מוקף רצף HO-endonuclease הכרה שניתן ממוקד מחשוף ידי גרימת הביטוי של הגן HO באמצעות תוספת של גלקטוז למדיום. לאחר מחשוף המושרה HO-endonuclease ב-his3 Δ3 'ו his3-Δ5' מצעים, תאים ביעילות להשתמש בדרכי קצר משותף של הומולוגיה HIS3 רצף (311 נ"ב או 60 נ"ב) כדי לתקן את הכרומוזומים נשבר על ידי משאבי אנוש, יצירת כרומוזום טרנסלוקציה עם האלל HIS3 שלם 12-14,25.

בגלל חוסר תאים הורה עותק שלם של הגן HIS3, הם אינם מסוגלים לגדול על שלו בינוני. רק תאים שעברו את האירוע טרנסלוקציה ניתן לבחור עבור על היסטידין חסר בינוני. לכן, בתדירות של טרנסלוקציות כרומוזומליות יכול להיות מחושב על ידי חלוקת מספר מושבות prototrophic היסטידין במספר הכולל של תאים קיימא מצופה, נקבע על ידי ציפוי על YPD. הדנ"א הגנומי ו כרומוזומים שלם אז יכול להיות מבודד + מושבות נציג שלו, ואת הנוכחות של כרומוזום טרנסלוקציה מאומת על ידי דרום גנומי כתם מנתח כרומוזום.

ניתוח זהיר אפשרה לנו לאסוף מידע חשוב נוסף על assay 12. כתם הגנום ניתוח דרום סיפקה הוכחה שיש גזירה מוחלטת כמעט של הכרומוזומים XV ו-III לאחר 30 דקות של אינדוקציה HO-endonuclease, ולכן אין רקע משמעותי של מצעים כרומוזומליות נימול באוכלוסייה (ג'Manthey & A. Bailis, התוצאות לא פורסם). הגנום מנתח כתם הדרום של כרומוזום שלו - ניצולי מציין כי התאים מאבדים לעתים קרובות אחד, השני, או שניהם הכרומוזומים לגזור להישאר קיימא (L. לידל & A. Bailis, התוצאות לא פורסם). חשוב לציין, את יעילות ציפוי שווה ערך כמעט על המדיום הלא סלקטיבי לפני ואחרי הגיוס הביטוי של HO-endonuclease מציין כי לא כישלון לתיקון כרומוזומים שבורים, ולא כישלון כדי לשמור על הכרומוזומים טרנסלוקציה משפיע על היכולת לשרוד היווצרות DSB. בקנה אחד עם זו, tXV: כרומוזום טרנסלוקציה III הוכח להיות יציבה בתאים mitotic בהעדר הבחירה. זה הודגם על ידי גידול tXV: III המכיל recombinants + שלו הלילה הלא סלקטיבי, ציפוי מושבות אחת על הלא סלקטיבי צלחות ציפוי העתק על גבי מדיום סלקטיבית חסר היסטידין. עשר עד 70% של מושבות על הצלחות אלה הנובעים איבד את tXV: כרומוזום טרנסלוקציה III (נ Pannunzio & A. Bailis, התוצאות לא פורסם).

הכרומוזומים טרנסלוקציה שנוצר על ידי חשיפה IR בבני אדם מפגינים חוסר יציבות דומה 26. הדבר מצביע על כך היווצרות טרנסלוקציה עשוי לתרום אירועים בתחילת tumorigenesis ידי קידום אובדן heterozygosity. שנית, ניתוח גנטי מולקולרי נרחב מראים כי SSA, מנגנון יעיל obligatorily הלא שמרנית של משאבי אנוש, הוא המנגנון העיקרי של התהוות טרנסלוקציה ידי HR בעקבות יצירת סימולטני של DSBs על שני כרומוזומי 12,27,28. זהו שיתוףnsistent עם הממצא כי מנות גדולות של התוצאה IR בצפיפות של DSBs מספיק כדי ליצור הפסקות הסמוכים רצפים חוזרים רבים בגנום שמרים, שכיחות גבוהה של היווצרות טרנסלוקציה על ידי משאבי אנוש. יחד, תצפיות אלה מראים כי ההשפעה בשעור של חשיפה IR בבני אדם רשאי, בין השאר, תוצאה של תיקון של DSBs ידי מנגנון יעיל של משאבי אנוש שיוצר טרנסלוקציות, דרך חוסר היציבות הטבוע בהם, לקדם שינויים גנטיים tumorigenesis השיגור. בגלל הקרינה המשמשת לעיתים קרובות לטיפול, סרטן rearrangements הגנום הנובעות לתקן הקרינה הנגרמת DSBs עשויים לתרום לדור של סרטן משני שעולות לעתים קרובות אצל חולים. לפיכך, מודל זה עשוי לסייע לנו להשיג הבנה טובה יותר של הבסיס הגנטי המולקולרי של תגובה קלינית לטיפול חשוב IR.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמוסד הלאומי לבריאות המחקר Beckman המכון של העיר התקווה. ברצוננו להודות לסוקרים הערות קונסטרוקטיביות שלהם הוסיף בהירות כתב היד.

Materials

Materials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, S. K. Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements. The American Journal of Human Genetics. 79, 41-53 (2006).
  2. Han, K. Alu recombination-mediated structural deletions in the chimpanzee genome. Plos Genetics. 3, 1939-1949 (2007).
  3. Zhang, F. Copy number variation in human health, disease, and evolution. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 451-481 (2009).
  4. Goodier, J. L., Kazazian, H. H. Retrotransposons revisited: The restraint and rehabilitation of parasites. Cell. 135, 23-35 (2008).
  5. Lanktree, M., Hegele, R. Copy number variation in metabolic phenotypes. Cytogenet Genome Res. 123, 169-175 (2008).
  6. Mullighan, C. Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia. Nature. 446, 758-764 (2007).
  7. Mattarucchi, E. Microhomologies and interspersed repeat elements at genomic breakpoints in chronic myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 47, 625-632 (2008).
  8. Stenger, J. Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability. Genome Res. 11, 12-27 (2001).
  9. Hedges, D., Deininger, P. Inviting instability: Transposable elements, double-strand breaks, and the maintenance of genome integrity. Mutat Res. 616, 46-59 (2007).
  10. Symington, L. Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair. Microbiol Mol Biol Rev. 66, 630-670 (2002).
  11. Lewis, L., Resnick, M. Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in Saccharomyces cerevisiae. Mutat Res. 451, 71-89 (2000).
  12. Pannunzio, N. R., Manthey, G. M., Bailis, A. M. RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae. DNA Repair (Amst). 7, 788-800 (2008).
  13. Nicholas, R., Pannunzio, G. M. M., Bailis, A. M. RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 56, 87-100 (2010).
  14. Manthey, G. M., Bailis, A. M. Rad51 Inhibits Translocation Formation by Non-Conservative Homologous Recombination in Saccharyomyces cerevisiae. Plos One. 5, (2010).
  15. Knight, W. Confidence Intervals for the Median: Two sided Symmetric --95 or Better. Available from: http://www.math.unb.ca/~knight/utility/MedInt95.htm (2006).
  16. Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57, 267-272 (1987).
  17. Sambrook, J., MacCallum, P., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  18. Iadonato, S. P., Gnirke, A. RARE-cleavage analysis of YACs. Methods Mol. Biol. 75-85 (1999).
  19. Argueso, J. L. Double-strand breaks associated with repetitive DNA can reshape the genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11845-11850 (2008).
  20. Batzer, D. A. Alu repeats and human disease. Molecular Genetic Metabolism. 67, 183-193 (1999).
  21. Fasullo, M., Dave, P., Rothstein, R. DNA-damaging agents stimulate the formation of directed reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae. Mutat. Res. 314, 121-133 (1994).
  22. Richardson, C., Jasin, M. Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks. Nature. 405, 697-700 (2000).
  23. Look, A. T. Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphomas. The Genetic Basis of Human Cancer. McGraw Hill. (2002).
  24. Fasullo, M. T., Davis, R. W. Direction of chromosome rearrangements in Saccharomyces cerevisiae by use of his3 recombinational substrates. Mol. Cell. Biol. 8, 4370-4380 (1988).
  25. Manthey, G. M., Naik, N., Bailis, A. M. Msh2 Blocks an Alternative Mechanism for Non-Homologous Tail Removal during Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 4, e7488-e7488 (2009).
  26. Muller, I. Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).
  27. Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process. Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).
  28. Ivanov, E. L. Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae. Genetics. 142, 693-704 (1996).

Comments

1 Comment

  1. Thanks for sharing your knowledge

    Excellent article :)

    Reply
    Posted by: William E.
    September 27, 2011 - 10:30 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics