Expansion du sang périphérique humain cellules T γδ utilisant zolédronate

Immunology and Infection

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Summary

Une méthode pour développer des cellules T γδ à partir des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) est décrite. PBMC dérivés des lymphocytes T γδ sont stimulés et étendu en utilisant le zolédronate et l'interleukine-2 (IL-2). L'expansion à grande échelle de cellules T γδ peuvent être appliquées à l'immunothérapie cellulaire autologue de cancer.

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Kondo, M., Izumi, T., Fujieda, N., Kondo, A., Morishita, T., Matsushita, H., et al. Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate. J. Vis. Exp. (55), e3182, doi:10.3791/3182 (2011).

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Abstract

L'homme des cellules T γδ peuvent reconnaître et répondre à une grande variété de stress induit par les antigènes, développant ainsi une large activité innée anti-tumorale et anti-infectieux. 1 La majorité des cellules T γδ dans le sang périphérique ont le récepteur des cellules T Vγ9Vδ2. Ces cellules reconnaissent un antigène dans un complexe d'histocompatibilité majeure manière indépendante et de développer de solides cytolytique et Th1-like fonctions effectrices. 1 Par conséquent, γδ lymphocytes T sont des cellules effectrices candidat intéressant pour l'immunothérapie du cancer. Vγ9Vδ2 cellules T de répondre à phosphoantigènes tel que (E)-4-hydroxy-3-méthyl-but-2-ényle pyrophosphate (HMBPP), ce qui est synthétisée dans la bactérie via la biosynthèse des isoprénoïdes; 2 et isopentényl pyrophosphate (IPP), qui est produite dans les cellules eucaryotes par la voie du mévalonate. 3 Dans l'état physiologique, la génération des IPP dans la cellule non transformée n'est pas suffisant pour l'activation des cellules T γδ. Le dérèglement de voie du mévalonate dans les cellules tumorales conduit à l'accumulation des IPP et γδ lymphocytes T d'activation. 3 Parce aminobisphosphonates (comme le pamidronate ou zolédronate) inhibent farnésyl pyrophosphate synthase (FPPS), l'enzyme agissant en aval de la PIP dans la voie du mévalonate, les taux intracellulaires de IPP et sensitibity aux cellules T γδ reconnaissance peut être thérapeutique augmenté de aminobisphosphonates. IPP accumulation est moins efficace dans les cellules nontransfomred que des cellules tumorales avec une concentration pharmacologiquement pertinentes de aminobisphosphonates, qui nous permettent d'immunothérapie pour le cancer en activant les cellules T γδ avec aminobisphosphonates 4. Fait intéressant, IPP s'accumule dans les monocytes lors PBMC sont traitées avec aminobisphosphonates, en raison de l'efficacité l'absorption des médicaments par ces cellules. 5 monocytes qui s'accumulent IPP deviennent cellules présentatrices d'antigène et stimuler Vγ9Vδ2 cellules T dans le sang périphérique. 6 Basé sur ces mécanismes, nous avons développé une technique à grande échelle l'expansion des cultures de cellules T γδ utilisant zolédronate et l'interleukine -2 (IL-2). 7 D'autres méthodes pour l'expansion des cellules T γδ utiliser le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) 8 ou 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) 9. Toutes ces méthodes permettent ex l'expansion in vivo, ce qui entraîne un grand nombre de cellules T γδ pour une utilisation en immunothérapie adoptive. Toutefois, seul le zolédronate est un réactif approuvé par la FDA disponible commercialement. Zolédronate-élargi γδ lymphocytes T CD27 écran - CD45RA - phénotype mémoire effecteurs et leur fonction peut être évaluée par l'IFN-γ test de production 7.

Protocol

1. Isolation des PBMC

  1. Prélever le sang (7,5 à 8,0 ml) dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec de l'héparine de sodium. Le tube contient un anticoagulant héparine sodique et d'un fluide de densité Ficoll-Hypaque, plus une barrière de gel de polyester, qui sépare les deux liquides. Centrifuger le tube / échantillon de sang à température ambiante (18 ° C à 25 ° C) dans un rotor horizontal (swing-out tête) pendant 20 min à 1800 x g. Commutateur centrifugeuse freins hors tension.
  2. Après centrifugation, la séquence de couches se produit comme suit (vu de haut en bas): un plasma) - b) les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et plaquettes - c) la solution de densité - gel de polyester d) - e) les granulocytes - f) globules rouges (fig. 1).
  3. Recueillir une fraction de la couche de plasma, en laissant 5 à 10 mm de plasma au-dessus de l'interphase sans déranger la couche de cellules. Le plasma peut être utilisé pour la culture (article 2.5).
  4. Récolte de la fraction enrichie (PBMC) à l'interphase avec une pipette et transférer dans un tube de 15 ml conique.
  5. Laver les PBMC avec 10 ml de tampon phosphate salin (PBS), en inversant le tube 5 fois, puis centrifuger 5 min à 400 x g.
  6. Répétez les étapes de lavage à deux reprises, puis remise en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de PBS. Déterminer le nombre de cellules. Habituellement 1,3 x10 6 cellules sont récupérées à partir de 1 ml de sang total.
  7. Déterminer la fréquence et le phénotype des cellules γδ T PBMC par cytométrie en flux (section 3) (Fig. 2).

2. L'expansion des cellules T γδ

  1. Centrifugeuse suspensions cellulaires dans 15 ml tubes coniques pendant 5 min à 400 x g à température ambiante, et jeter le surnageant.
  2. Préparer un milieu de culture (CM) en ajoutant l'IL-2 humaine (IL-2) et le zolédronate (Zometa) à des concentrations finales de 1000 UI / ml et 5 uM, respectivement. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) ou OpTmizer (Invitrogen) des médias de soutenir l'expansion des cellules T bonnes γδ (plus d'informations dans les références 6 et 9). Zometa est fourni sous forme liquide (4 flacon mg/5-ml). Pour préparer une solution à 5 uM, ajouter 50 ul de Zometa à 30 ml de milieu de culture.
  3. Resuspendre le culot cellulaire dans un milieu de culture et de s'adapter à 1x10 6 cellules / ml.
  4. Pipeter 1 ml de CM contenant 1x10 6 cellules dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Pour les grandes cultures, les cellules peuvent être ensemencées à 0,5 x 10 6 cellules / cm 2 selon la surface du puits de la plaque, plat, ou le flacon.
  5. Ajouter plasma autologue (section 1.3), regroupés AB humain sérums ou FCS pour qu'il se trouve à environ 10% du volume de la culture (100 pi pour chaque puits d'une plaque de 24 puits). Placer les plaques dans un 37 humidifié ° C, 5% de CO 2 incubateur de 24-48 heures.
  6. Maintenir la culture à une densité cellulaire de 0,5-2 x 10 6 cellules / ml. Ajouter un milieu frais contenant l'IL-2 humaine (1000 UI / ml) seule (sans Zometa) tous les 2-3 jours, et le transfert des cellules cultivées dans des puits nouveaux ou flacons que nécessaire, selon le degré de prolifération cellulaire (Fig. 3). Plasmatique d'alimentation ou de sérum dans le milieu de sorte que la concentration sérique peut être maintenu au moins 1%.
  7. Récolte des cellules le jour 12-14 et déterminer la fréquence, le phénotype et les fonctions des cellules T γδ par cytométrie en flux (voir ci-dessous).

3. L'analyse phénotypique par cytométrie en flux

  1. Transfert de 200 échantillons ul contenant 2 x 10 5 cellules pour le tri de cellules activées par fluorescence (FACS) tubes.
  2. Ajouter 2 ml de PBS froid et centrifuger 5 min à 400 x g. Ensuite, remettre en suspension les boulettes dans 50 ul de tampon FACS (PBS + 1% de FCS azoture de sodium + 0,1%). Ajouter 5 ul de chaque anticorps pour les échantillons (les anticorps monoclonaux sont énumérés dans le tableau 1).
  3. Incuber sur de la glace dans l'obscurité pendant 20 min.
  4. Ajouter 2 ml de tampon FACS à chaque échantillon, puis de vortex. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C. Décanter avec précaution le surnageant.
  5. Resuspendre les cellules dans 300 ul de tampon FACS et les vortex. Analyser des échantillons sur un cytomètre en flux (Fig. 2).

4. IFN-γ test de production 10

  1. Le jour avant le dosage, préparer des cellules stimulatrices en cultivant 3-5 cellules Daudi x10 5 / ml dans du milieu RPMI 1640 plus 10% de FCS (RPMI-10) pendant la nuit avec Zometa (5 uM) (ci-après désignée Z-Daudi).
  2. Recueillir Z-Daudi et remettre en suspension dans du RPMI-10 à 2x10 6 cellules / ml. Ajouter 100 ul de Z-Daudi (2x10 5) à chaque puits d'une plaque à fond rond de 96 puits.
  3. Préparer les cellules T γδ au 2x10 6 cellules / ml dans du RPMI-10 contenant Bréfeldine A à 20 pg / ml. Transférer 100 ul de suspension cellulaire T γδ (2x10 5) à chaque puits contenant les cellules Daudi-Z ou de contrôler des puits (100 pl de RPMI-10 seulement, ou RPMI-10 avec 20 ng / ml de phorbol 12-myristate 13-acétate[PMA] et 2 pg / ml d'ionomycine).
  4. Mélanger à la pipette et à plusieurs reprises. Incuber pendant 4 heures dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
  5. Centrifuger la plaque pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C et remettre les boulettes dans 200 ul de PBS froid.
  6. Transférer les échantillons dans des tubes FACS. Ajouter 4 ml de PBS froid et centrifuger les tubes pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C.
  7. Resuspendre les culots dans 50 ul de tampon FACS avec FITC conjugué anti-TCRVγ9 (5 pi) et de PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 pi). Incuber abri de la lumière pendant 15 min à température ambiante.
  8. Ajouter 100 ul de réactif IntraPrep 1 et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter 4 ml de PBS dans chaque tube et centrifuger 5 min à 400 x g à température ambiante.
  9. Retirer le surnageant par aspiration et ajouter 100 l de réactif 2 IntraPrep. Incuber pendant 5 min à température ambiante sans agitation.
  10. Ajouter 5 ul de PE-conjugué anti-IFN-γ mAb le tube à essai. Incuber abri de la lumière pendant 15 min à température ambiante.
  11. Ajouter 4 ml de PBS dans chaque tube et centrifuger 5 min à 400 x g à température ambiante. Retirer le surnageant par aspiration et resuspendre le culot cellulaire dans 0,5 ml de tampon FACS.
  12. Analyser les cellules par cytométrie en flux. Porte sur le CD3 + + TCRVγ9 cellules et d'examiner l'expression d'IFN-γ (Fig. 4).

5. Les résultats représentatifs:

Il est important de déterminer le pourcentage de cellules T γδ dans PBMC à l'initiation de la culture. Comme le montre la Fig. 2 A, le pourcentage de cellules CD3 + + TCRVγ9 γδ lymphocytes T dans les PBMC a été de 1,6% au jour 0. Les populations dominantes étaient CD27 + CD45RA + CD27 + naïfs ou CD45RA - phénotypes mémoire centrale. Lorsque les cellules T γδ ont été stimulés efficacement, ils ont formé des grappes sur les jours 3-5 (Fig. 3 A et B). Lorsque la formation de grappes a été retardée, la croissance des autres types cellulaires, comme les cellules CD4 + ou CD8 + αβ des cellules T ou des cellules NK pourrait dominer la croissance des cellules T γδ (Fig. 3 C et D). Après 14 jours de culture, de la fréquence des cellules T γδ augmenté à plus de 93,8% des cellules cultivées dans des cultures de cellules γδ réussie T (fig. 2 E). La culture des cellules T γδ surexprimés NKG2D et expression de CD69 (fig. 2 G et H). Ils s'affichent CD27 - CD45RA - phénotype mémoire effecteurs (Fig. 2 F). Les fonctions des cellules T γδ ont été évalués à l'égard de la production de cytokines et la cytotoxicité. L'IFN-γ intracellulaire coloration démontré que les cellules T γδ IFN-γ produit en réponse au PMA / ionomycine traitement ou Z-Daudi cellules qui IPP ​​accumulés après le traitement zolédronate (fig. 4). Ces résultats indiquent que le zolédronate peut efficacement stimuler et de développer des cellules T γδ fonctionnelle.

Tube FITC PE DPE PE/Cy5
1 CD3 CD19 CD45 CD14
2 CD3 TCRap CD4 CD8
3 CD3 CD56
4 TCR Vy9 TCRap CD45 CD3
5 TCR Vy9 NKG2D
6 TCR Vy9 CD69
7 TCR Vy9 IgG1 de souris
8 TCR Vy9 CD45RA CD27
9 TCR Vy9 IgG1 de souris IgG1 de souris

Tableau 1. Les anticorps monoclonaux utilisés dans la coloration des cellules T multicolores γδ. Un exemple de l'analyse phénotypique des cellules T γδ effectué dans notre laboratoire est montré dans la Fig. 2.

Figure 1
Figure 1. Séparation des PBMC. Sang (7,5 à 8,0 ml) est tiré dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec de l'héparine de sodium et directement centrifugé pendant 20 min à 1800 x g. Après centrifugation, les couches résultant comme on le voit du haut vers le boTTOM: un écran plasma) - b) PBMC et plaquettes - solution de densité c) - gel de polyester d) - e) Granulocytes - f) Les globules rouges.

Figure 2
Figure 2. Phénotype de surface typiques des cellules T γδ. PBMC ont été stimulées avec le zolédronate et IL-2 pendant 14 jours. Les cellules ont été colorés avec marqué FITC anti-TCR Vy9 et PE/Cy5-labeled anti-CD3 pour surveiller l'expansion des cellules T γδ (A et E). Les cellules T γδ ont été identifiés par leur expression de TCRVγ9, et leur expression de CD27 et CD45RA (B et F), NKG2D (C et G), ou CD69 (D et H) a été examiné.

Figure 3
Figure 3. Représentant γδ cultures de cellules T. PBMC ont été stimulées par l'IL-2 (1000 UI / ml) et le zolédronate (5 um). Champs représentatifs sont présentés (IX71 microscope inversé [Olympus] x 200). Les clusters et les agrégats de cellules T γδ peuvent être observés au jour 3 (A) et le jour 5 (B), lorsque les cellules T γδ ont été développé avec succès. En revanche, aucun amas ou d'agrégats ont été observés lorsque la croissance des cellules T γδ n'était pas adéquate (C et D).

Figure 4
Figure 4. IFN-γ production. Les cellules T γδ ont été incubées avec du RPMI-10 seulement (A) ou PMA / ionomycine (B) ou Z-Daudi (C) pendant 4 heures. Tout d'abord, l'expression de surface de TCRVγ9 était tachée et ensuite de l'IFN-γ de production a été examiné par l'IFN-γ intracellulaire coloration.

Figure 5
Figure 5. Cinétique de la culture de cellules γδ T. (A) Le nombre absolu de cellules cultivées, (B) le pourcentage de cellules T γδ, et (C) le nombre absolu de lymphocytes T γδ dans les points de temps indiqués.

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Discussion

La méthode présentée ici permet l'expansion efficace des cellules T γδ partir des PBMC. γδ cellules T activées et élargies par le zolédronate et IL-2 développent complète des fonctions effectrices, reflétée par la production de cytokines et la cytotoxicité. Il a été rapporté que le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) et le 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) élargira également les cellules T γδ, mais ils ne sont pas disponibles dans le commerce. En revanche, le zolédronate est déjà homologué pour des applications cliniques que Zometa. Par conséquent, un réactif fiable est facilement disponible.

La sélection de milieux de culture et le sérum est critique. Utilisez les milieux de culture appropriés tels que ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) ou OpTmizer (Invitrogen) pour réussir l'expansion des cellules T γδ. 11 Vérifiez que le plasma autologue, regroupés AB humain sérums ou FCS peut soutenir la culture de cellules T γδ. Rappelez-vous aussi que les PBMC de certains bailleurs de fonds ne parviennent pas à répondre à la stimulation zolédronate indépendamment de réactifs autre culture. Si cela arrive, la seule option est de changer le donateur.

Comme nous l'avons démontré, l'enrichissement des cellules T γδ a été réalisé relativement tôt, presque 80% des cellules cultivées ont été les cellules T γδ par jour 7. Les cellules T γδ continué à proliférer jusqu'à 12-14 jours (fig. 5). Environ 2,2 x 10 8 cellules T γδ peuvent être obtenus à partir de 1 x 10 6
PBMC contenant 1,6 x 10 4 cellules T γδ. Cette méthode de culture a été utilisée en phase I des essais cliniques évaluant l'innocuité et la faisabilité de zolédronate-T γδ élargi la thérapie de transfert de cellules chez des patients atteints de myélome multiple ou de cancer du poumon. 12,13

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZOMETA Novartis AG zoledronate
PROLEUKIN Novartis AG human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin BD Biosciences 362753
RPMI1640 Invitrogen 21870-076
ALyS203- medium Cell Science & Technology Institute 0301-7
OpTmizer Invitrogen 0080022SA
brefeldin A Sigma-Aldrich B5936-200UL
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585-1MG
ionomycin Sigma-Aldrich 13909-1ML
IntraPrep Beckman Coulter Inc. A07803
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-human CD4-ECD Beckman Coulter Inc. 6604727
anti-human CD8-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607011
anti-human CD14-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07765
anti-human CD19-PE Beckman Coulter Inc. A07769
anti-human CD45-ECD Beckman Coulter Inc. A07784
anti-human CD56-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07789
anti-human TCRαβ-PE Beckman Coulter Inc. A39499
anti-human TCR Vγ9-FITC Beckman Coulter Inc. IM1463
anti-human CD27-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607107
anti-human CD45RA-ECD Beckman Coulter Inc. IM2711
anti-human CD69-PE BD Biosciences 555531
anti-human NKG2D-PE Beckman Coulter Inc. A08934
Anti-humal IFNγ-PE Beckman Coulter Inc. IM2717U
Mouse IgG1 isotype control-PE Beckman Coulter Inc. A07796
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07797A07798

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References

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