Отслеживание нейтрофилов внутрипросветный Crawling, трансэндотелиальной миграции и Хемотаксис в ткани Прижизненное микроскопии видео

Published 9/24/2011
2 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Мы опишем протокол светлое прижизненной микроскопии для измерения динамических нейтрофилы, эндотелиальные клетки при взаимодействии нейтрофилов вербовки в ответ на источник нейтрофилов хемоаттрактант в естественных условиях. Нейтрофилов внутрипросветный ползать, трансэндотелиальной миграцию и хемотаксис в мышечной ткани мышей кремастер визуализируются с временем истек фотографии видео и отслеживается с ImageJ.

Cite this Article

Copy Citation

Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296, doi:10.3791/3296 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Вербовки циркулирующих лейкоцитов из крови к воспаленной ткани является важным и сложным процессом воспаления 1,2. В посткапиллярных венул воспаленных тканей, лейкоцитов первоначально троса-н-ролл на просвета поверхности венул стене. Роллинг лейкоцитов ареста на эндотелий и пройти фирмы адгезии в ответ на хемокинов или других хемоаттрактантов на венул поверхности. Многие приверженцем лейкоцитов переселиться из начальном участке адгезией к соединительного сайт кровоизлияние в эндотелия, процесс, который называют внутрипросветный ползком 3. После сканирования, лейкоциты перемещаются по эндотелия (переселение) и мигрировать в ткани внесосудистое к источнику хемоаттрактант (хемотаксис) 4. Прижизненные микроскопия является мощным инструментом для визуализации лейкоцитов эндотелиальных взаимодействий клетка в естественных условиях и выявление клеточных и молекулярных механизмов лейкоцитов вербовки 2,5. В этом докладе, мы предоставляем полное описание использования светлого прижизненной микроскопии для визуализации и определяет конкретные процессы нейтрофилов набора мышечной мыши кремастер в ответ на градиент нейтрофилов хемоаттрактант. Для стимулирования нейтрофилов найма, небольшой кусок геля агарозы (~ 1 мм, 3 размера), содержащие нейтрофилов хемоаттрактант MIP-2 (CXCL2, хемокинов CXC) или WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, синтетический аналог бактериальных пептид) помещается на мышечной ткани, прилегающих к наблюдали посткапиллярных венулы. С течением времени, истек фотографии видео-и компьютерные программы ImageJ, нейтрофилов внутрипросветный ползет по эндотелия, нейтрофилов трансэндотелиальной миграция и миграция и хемотаксис в ткани визуализируются и отслеживаться. Этот протокол позволяет надежно и количественного анализа многих нейтрофилов параметры набора таких как внутрипросветный скорость сканирования, переселение время, отряд время миграция скорости, хемотаксис скорости и хемотаксис индекса в ткани. Мы показываем, что с помощью этого протокола, эти параметры набора нейтрофилов может быть стабильно и определяется одним передвижения ячейки удобно отслеживать в естественных условиях.

Protocol

1. Подготовка хемоаттрактант в агарозном геле

  1. Внесите 10 мл 2 х PBS в 50-мл коническую трубку, и согреться трубке, поместив его в стакан с горячей водой.
  2. Внесите 10 мл дистиллированной воды и добавляют 0,4 г порошка агарозы в другой 50-мл коническую трубку (с ее вершины слегка ослаблены) и нагревайте смесь до кипения только в микроволновой печи (в течение ~ 1 мин в 700-Вт микроволновая печь) .
  3. Добавить нагревается 2 × PBS в агарозном решение трубки, вихревые смешанный раствор и держать его в теплой стакан горячей воды.
  4. Микропипетки хемоаттрактант решения (например, 10 мкл 0,5 мкг CXC хемокинов MIP-2 или 12 мкл 1 мМ WKYMVm) в крышку 1,5 мл Eppendorf пробирку, содержащую 3 мкл тушью и хорошо перемешать стремлением использовании микропипетки (избегайте воздушный пузырь).
  5. Отрежьте кончик конце 200-мкл кончика пипетки и микропипетки 110 мкл агарозном решение (42 ° С) в крышке и сразу хорошо перемешать с использованием другого кончика пипетки (избегайте воздушных пузырей).
  6. Магазин хемоаттрактант содержащих гель при температуре +4 ° С.

2. Подготовка мышц Кремастер для Прижизненное микроскопии (рис. 1)

  1. Обезболить взрослого самца мыши, IP-инъекция смеси 10 мг / кг ксилазина и 200 мг / кг кетамина гидрохлорид.
  2. Бритье области за правой наружной яремной вены и передняя поверхность мошонки с электрической бритвой. После анестезии, очень важно уделять особое внимание и заботу к анестезии мыши. Тепло лампы может быть использован для предотвращения мышь от переохлаждения. Мышь должна быть свободна от боли рефлекс.
  3. Сделать горизонтальный надрез, найти и катетеризации яремной вены использованием ПЭ-10 трубки заполнены 100 ЕД / мл гепарина физиологического раствора. Катетеризация яремной вены необходимо для управления дополнительными анестетиков и наркотиков, когда это требуется.
  4. Fix мыши задние ноги с пупочной лента с мышью лежал лицом вверх на самодельных кремастер мышц плате (рис. 1).
  5. Подключение платы к 37 ° С воды циркуляционный держать мышцы кремастер и мышь тело в тепле.

Примечание: Все процедуры от 2,6 до 2,14 должны выполняться очень нежно 5.

  1. Сделайте разрез на мошонке кожи подвергать мышцу левого кремастер. Осторожно рассекают мышцы от связанных фасции.
  2. Переливать мышц кремастер с 37 ° C-нагревается гидрокарбонатно-солевой буфер (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, в мМ, рН 7,4) с помощью перистальтического насоса.
  3. Tie 4-0 шва до дистального конца мышцы кремастер провести его на пьедестал ясно стекла просмотра борту мышцы кремастер.
  4. Cauterize мышц кремастер продольно. С 4-0 шва, удерживайте мышцы плоскими и закрепите его по краям на пьедестале. Отдельные яичка и придатка из основных мышц и переместить их в брюшной полости.
  5. Переливать мышц при ~ 0,6 мл / мин при 37 ° С разогреть перфузии буфера и крышки подвергаются мышцы с 22 × 22 покровного стекла мм.
  6. Место борту кремастер мышцы на столике микроскопа, исследовать мышцы под микроскопом, найти подходящую посткапиллярных венулы (Выберите венулы, что прямая и неразветвленные и нормальной скоростью сдвига и диаметром 25-40 мкм) и настроить видеокамеру чтобы венулы, чтобы быть визуализированы в вертикальном положении на левой или правой части телевизора.
  7. После 30 мин равновесия, записать видео-изображения выбранного посткапиллярных венулы в течение 5 мин в качестве базовых контроль данных с использованием видеомагнитофона.
  8. Стоп superfusion и удалить покровное на мышцы.
  9. Место ~ 1 мм, 3 размера хемоаттрактант-геля на поверхности мышц кремастер в заданный район 350 мкм от и параллельно наблюдается посткапиллярных венулы, добавьте покровное провести гель на месте и переливать мышечной ткани в очень медленно (≤ 10 мкл / мин), чтобы позволить создание градиента хемоаттрактант, который медленно освобождается и формируется из геля.
  10. Запись видеоизображения в течение 90 мин после добавления хемоаттрактант содержащего геля. Во время записи, настроить и сохранить микроскопом сосредоточиться на соблюдении, ползание, переселяющимся и chemotaxing лейкоцитов в венулы и в мышечной ткани.
  11. После эксперимента, импортировать видео файл на компьютер для анализа.

3. Сотовые Отслеживание Использование ImageJ

  1. На компьютере, извлекать и конвертировать видео в AVI-формате (например, использование свободных bitRipper компьютерного программного обеспечения для преобразования DVD видео в файл AVI).
  2. Используйте программное обеспечение для редактирования видео, для создания временных истек кино. Например, можно использовать Windows Movie Maker, чтобы времени истек фильм (до 1 / 512 или 1 / 1024 покадровойт 30-кадр ставка) от оригинала, в реальном времени видео. Преобразование и сохранение несжатых времени истек фильм DV-AVI формате.
  3. Запись изображения калибровки микрометра под микроскопом же настройки, импорт изображений в компьютер, откройте изображение с ImageJ. В ImageJ, общее число пикселей на верхней левой части экрана (например, 720 × 480 пикселей). Измерьте размер экрана в обоих X и Y осей (например, 200 × 150 мкм). Исходя из этого, подсчитать количество пикселей в мкм (например, х = 720/200 = 3,6 пикселей / мкм, а у = 480/150 = 3,2 пикселей / мкм).
  4. Чтобы импортировать кино, открытые ImageJ еще раз, нажмите "Файл-Импорт-Использование Quicktime фильмы Плагин", выбрать фильм, которые будут проанализированы и нажмите кнопку "OK" на стыке "QT фильм открывалка".
  5. Нажмите кнопку "Плагины-Ручной отслеживания", чтобы отслеживать клеток. Заполните соответствующую информацию в поля, на дне до начала отслеживания. Короче говоря,
    1. Временной интервал (в секундах) = fold-time-lapse/30 (например, 1020 × покадровой будет 1020/30 = 34 сек / кадр интервала).
    2. х / у = калибровки мкм / пиксел измерения с использованием калибровки образ микрометра.
    3. г калибровка = 0 (как мышцы мыши кремастер является чрезвычайно тонкий слой ткани и клеточных ползать и миграции примерно 2D при ярком поле просвечивание).
    4. Поиск квадратных размеров для центрирования = 1.
    5. Dot размер / Line ширина / Размер шрифта: они могут быть скорректированы в случае необходимости.
  6. Выберите стабильные и четкие точки, точки отсчета. Эта контрольная точка может быть любой четкие и небольшие структурные такой степени, что остается неизменным и стабильным на протяжении всего эксперимента. Нажмите кнопку "Добавить трек", чтобы отслеживать точки отсчета от первого до последнего кадра и нажмите кнопку "Конец пути". Данные появляются на таблицу результатов автоматически.
  7. Трек ползать и миграции нейтрофилов один за другим: нажмите кнопку "Добавить трек", чтобы отслеживать клетки от ее появления в ткани к его исчезновению в каждом кадре и нажмите кнопку "Конец пути", чтобы закончить и сохранить результаты в Microsoft Excel.

4. Анализ нейтрофилов Параметры Набор

  1. Откройте файл результатов в Microsoft Excel, а также анализировать данные (принять изменения точкой отсчета в анализе).
  2. Внутрипросветный сканирование
    1. Сканирование расстояние: общее расстояние клетка ползет в просвете от начальной приверженцем сайт оптимального места переселения (мкм).
    2. Сканирование Скорость: ползком расстояние / время (мкм / мин).
  3. Трансэндотелиальной миграции
    1. Переселение время: с того времени, клетка начинает переселяться через эндотелий в то время, когда все тело ячейка находится совсем рядом с венулы и не тело клетки можно увидеть на просвет (мин или сек).
    2. Отряд время: с того времени, все тело ячейка находится совсем рядом с венулы (сразу после переселения) в момент времени, когда клетка теряет контакт с венулы (хвост втягивается) (мин или сек).
  4. Хемотаксис в ткани
    1. Миграция расстояние: сумма расстояния клетка переходит от начальной точки до конечной точки миграции в ткани (мкм).
    2. Скорость миграции: миграция в тканях расстояние / время (мкм / мин).
    3. Хемотаксис расстояние: сумма расстояния клетка мигрирует в оси Х в ткани (мкм).
    4. Скорость хемотаксис: хемотаксис расстояние / время (мкм / мин).
    5. Хемотаксис индекс: отношение деления хемотаксис расстояния миграции расстояние в ткани.

5. Представитель Результаты:

Хотя bightfield прижизненной микроскопии для исследования лейкоцитов эндотелия взаимодействия клеток и, возможно, не обязательно для нейтрофилов, мы подтвердили, что, по нашим исследования гистологии, более 95% от набранных клетки нейтрофилов хемоаттрактант обработанных мышцы кремастер действительно нейтрофилов . В этом докладе, используя нейтрофилов-селективные хемоаттрактантов, мы представляем процедуры отслеживания набора нейтрофилов в естественных условиях. В частности, мы описываем протокол отслеживания нейтрофилов внутрипросветный ползать, трансэндотелиальной миграцию и хемотаксис в кремастер мышечной ткани у мышей под наркозом использованием покадровой прижизненной микроскопии видео и ImageJ. Хемоаттрактант содержащих агарозном гель на мышцы кремастер медленно выпускает хемоаттрактант и позволяет хемоаттрактант градиент, который будет создан в тканях. Нейтрофилов хемоаттрактант побуждает нейтрофилы, эндотелиальные взаимодействия ячейку в cremasteric посткапиллярных венул у мышей. Весь эксперимент визуализируется при вертикальном светлое прижизненной микроскоп с видео-изображения, проецируемые на цветная камера видео на экран телевизора и записаны видеомагнитофон. Мы определили нейтрофиловвнутрипросветный ползать, трансэндотелиальной миграция и миграция и хемотаксис в мышечной ткани в ответ на нейтрофилов хемоаттрактант MIP-2 и WKYMVm подготовлен в агарозном геле (рис. 2). Мы обнаружили, что MIP-2 (на 0,5 мкМ) и WKYMVm (на 0,1 мм) вызвал нейтрофилов внутрипросветный ползком на аналогичных скоростей, нейтрофилов трансэндотелиальной миграции и отрыва от венулы за сопоставимый период времени, миграцию нейтрофилов и хемотаксис в мышечной ткани почти той же скоростью и с аналогичными хемотаксис нейтрофилов индексы (Р> 0,05, студент т теста).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение прижизненной системы микроскопа. Мышцы мыши кремастер является экстериоризируется на пьедестал ясно просмотра кремастер мышц доску на столик микроскопа и superfused с 37 ° C-нагревается гидрокарбонатно-солевой буфер. Прямой микроскоп связано с видео CCD цветная камера для микроскопии светлого прижизненной. Монохромный глубокого охлаждения CCD цифровой камеры также связан с микроскопом порт для флуоресцентной прижизненной микроскопии, изображения с которых непосредственно обработан на компьютере.

Рисунок 2
Рисунок 2. Нейтрофилов набора параметров светлое прижизненной микроскопии. Нейтрофилов набора было вызвано постепенное высвобождение нейтрофилов хемоаттрактант MIP-2 или WKYMVm в подготовке агарозном геле размещены 350 мкм, прилегающих к посткапиллярных венулы. Времени истек видео данных были проанализированы ImageJ после обработки записи в реальном времени видео эксперимента. Нейтрофилов внутрипросветный ползком (), время переселения и отряд времени (В), скорость миграции и хемотаксиса скорость в ткань (C), и хемотаксис индекс в кремастер мышцы (D) были определены после введения MIP-2 или WKYMVm агарозном гель на кремастер мышцы в C57BL / 6 мышей (п = 3, # гусеничных клетки = 22 (в А и В) и 27 (на С и D), соответственно, для MIP-2, а = 26 (в А и В) и 44 ( в С и D), соответственно, для WKYMVm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Прижизненные микроскопия является существенным инструментом для выявления клеточных и молекулярных механизмов лейкоцитов вербовки во время воспаления. Количественные визуализации для определения лейкоцитов эндотелиальных клеток взаимодействий в микроциркуляторном русле полупрозрачная тканей, таких как кремастер мышц и брыжейки остается золотым стандартом для применения техники 1,5. Обычные микроскопии прижизненной светлое имеет много уникальных технических характеристик и набор механизмов проявляется в этих тканях, применимы для большинства тканей в естественных условиях 1,2,6. Тем не менее, механизмы лейкоцитов набора в некоторых других тканей, таких как легкие, печень и мозг были обнаружены сильно отличаются от тех, раскрывается в кремастер мышц и брыжейки 1. Кроме того, флуоресцентной микроскопии должна быть использована в некоторых менее прозрачной ткани.

По сравнению с флуоресценцией-микроскопии, который известен фотоповреждения к функциям живые клетки, светлое прижизненной микроскопии более физиологические и менее вредные для клеток и тканей (поэтому с меньшим количеством артефактов), когда долгое время визуализации для наблюдения динамического поведения в сотовых живых животных необходимо 7. Кроме того, более удобным, менее дорогостоящими и не флуоресцентные маркировки не требуется. С другой стороны, с просвечивание изображений в прижизненной микроскопии, автоматическое слежение сотовых движение невозможно в настоящее время коммерческое программное обеспечение визуализации на рынке. Тем не менее, она очень проста в настройке отдельных флуоресценции прижизненной визуализации системы (например, путем проецирования изображения флуоресценции ПЗС-камеры и компьютера) на том же светлое прижизненной микроскопии (рис. 1). Это обеспечивает удобство переключения между микроскопии светлого и флуоресценции на той же подготовки образца в одном эксперименте. Это также позволяет автоматически отслеживать движение флуоресцентно меченых клеток под флуоресценции прижизненной микроскопии, когда контраст между интенсивности флуоресценции меченых клеток и фона достаточно велика, и подходит изображений программное обеспечение устанавливается на компьютер.

Как показано здесь, в нашей презентации, мы демонстрируем ценность этого в естественных техника для прямого наблюдения весь процесс нейтрофилов найма и для определения функции клеток и молекул в каждом наборе шаг. С хемоаттрактант, содержащиеся в подготовке агарозном геле и провел на ткани, однонаправленный градиент хемотаксиса могут быть установлены в ткани, что вызывает лейкоцитов ответы набора напоминающие естественные во время местное воспаление 8,9. Направленное движение от лейкоцитов посткапиллярных венулы к источнику хемоаттрактант можно четко визуализируются с помощью светлого прижизненной микроскопии и видео съемки. При покадровой обработки видео, движения клетки могут быть отслежены по ImageJ и ряд весьма воспроизводимые параметры могут быть измерены. Что касается конкретно трансгенных мышей, ингибиторы и селективные хемоаттрактантов, анализа система помогает нам выявить функции специфических белков в лейкоцитарной вербовки. Например, этот метод помогает нам определить роль LSP1 в эндотелиальных клетках, как привратник в регулировании миграции нейтрофилов трансэндотелиальной 10, роль для Mac-1 (αMβ2 интегрин) в нейтрофилов внутрипросветный ползать, существенным шагом для оптимального трансэндотелиальной миграции 3, а также роль PI3Kγ в нейтрофилов хемотаксис в ткани 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана исследовательский грант Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR, СС-86749). Л. Лиу является получателем CIHR Новая премия следователя (MSH-95374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene tubing, PE10 Becton Dickinson 427401 I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm        
India ink Speedball Art Super Black 100% carbon black pigment, no dyes
Cautery Aaron Medical AA03
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc. DIN 01989529
Murine recombinant MIP-2 R&D Systems 452-M2
WKYMVm Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 072-12
Agarose Invitrogen 15510-027 Ultrapure
Heparin Sigma H-3393
Upright microscope Olympus BX61WI
3CCD color video camera SONY DXC-990
HD-DVD video recorder LG Electronics Inc. RH398H-M
TV monitor LG Electronics Inc. 22LG30
Water circulator Thermo Scientific HAAKE DC10
Peristaltic pump Gilson; Pharmacia Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3
Cremaster muscle board University of Saskatchewan Home-made

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
  2. Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
  3. Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
  4. Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
  5. Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
  6. Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
  7. Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. 3-43 (2007).
  8. Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
  9. Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
  10. Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
  11. Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).

Comments

2 Comments

  1. Great job!! Would you let me know:
    What size (diameter) of the postcapillary venule in cremaster muscle in mice was be selected in your imaging?
    Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 1:58 PM
  2. I would like to see your article but I don´t have acess in my institute can you please send to me a "free" link to your article.
    Thank you in advance,

    Reply
    Posted by: Ana S.
    September 5, 2013 - 12:39 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats