Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş * These authors contributed equally

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Parazitoit (asalak) arılar dahil olmak üzere birçok böceklerin doğal düşmanları önemli bir sınıfını teşkil

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response. J. Vis. Exp. (63), e3347, doi:10.3791/3347 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Deney için protokol tüm dört adım (Şekil 9) bölünür. Sinek larvalarıyla (1) Kültürleme eşekarısı, (2) enfeksiyonları kurma ve diseksiyon için hayvanların hazırlanması; (3) İzolasyon ve ana / parazit yapıları belirlemek; (4) bağışıklık doku analizi.

1. Drosophila Larva üzerinde Kültüre Eşek Arıları

Wasp kültürlerin Bakım dikkatli bir planlama gerektirir. Artan sinekler Göre, oldukça emek yoğun bir iştir. Biz 24 ° C'de Drosophila yw suşunun larva veya pupa üzerinde laboratuvarda bizim arısı kolonileri korumak Kültürleme eşekarısı sağ aşamada konak sürekli bir kaynak tutulması ve yaban arıları yapmadan önce ortaya çıkan sineklerin "enfekte" şişeleri temizlemek içerir. Eşek Arıları cinsiyet tayini haplodiploid yöntemi takip ve onlar hosts bulaşmadan önce kadın eşleştirirsek bu nedenle önemlidir.

  1. 1. günde, taze öncesi küçük bir dab ekleyinpared maya yapıştırın (taze bir sinek gıda şişeye kuru maya yaklaşık 1 g 1 mL su karıştırılarak yapılan sinek yemek tarifi önemli değildir;. biz corn-meal/sucrose/agar orta sinekler büyür. Yer 50-60 genç (2-4 gün yaşlı) Yetişkin yw (veya diğer temelde vahşi suşu) 24 ° C'de 48 saat için yumurtalarını bırakmak için uçar
  2. 3. günde, flakonlarından sinekler çıkarın. Vızıltı fişi iç tarafında bal bir damla flakon bir vızıltı fiş yerleştirin. Bal distile su içinde 2:01 seyreltilir.
  3. CO 2 kullanılması, arı uyutmak ve 6-8 dişi ve yaklaşık 2-3 gün geçmiş 6-8 erkek sıralayabilirsiniz. 0-48 saatlik eski konaklar içeren flakon onları ekleyin. Arı sinek fazla CO 2 karşı daha duyarlıdır ve gaza maruz kaldıkları kalibre edilmesi gerekebileceğini unutmayın. Drosophila araştırmacılar standart bir Drosophila anestezi istasyonu tasarım kullanmayın. Eşekarısı uyutmak için iyi bir başlangıç ​​noktası CO 2 basıncını ayarlamaktıranestezi sinekler için gerekli olan hususlar yaklaşık yarısı kadar.
  4. Şişesindeki vızıltı fişi (bal ile) değiştirin. Eşekarısı uyanmak kadar hafifçe yan şişe yerleştirin.
  5. 24 ° C inkübatör içinde sinek larvaları ve arı bu şişe yerleştirin.
  6. Başarılı enfeksiyonları hafif pupariation geciktirir. Wasp krizi geçirdi, ancak (ya da enfekte değilse) kendilerini savunmak edebiliyoruz olan Konaklar, normal program ve ergin sinek iyi öncesinde arıların bu ise yine ortaya izleyerek gelişme devam eder.
  7. 25-30 gün içinde arı türleri ve sıcaklık, eşek arıları eclose bağlı.
  8. Arıların gelişmekte hangi flakonlarından ergin sinek çıkarın.

2. Enfeksiyonlar kurma ve Diseksiyon için Enfekte hayvanlar hazırlanması

Başlamadan önce, temiz bir cam veya plastik Petri, 9 çukur, Kimwipes, damıtılmış su (bir squirt şişe) ile bir borcam diseksiyon çanağı bir çift var,% 70 etanol (bir squirt şişe), 1X PBS (bir squirt şişe), mikroskop lamı, ve kullanışlı küçük, temiz bir spatül.

  1. Enfeksiyonları kurmak için, yukarıdaki 1-5 adımları izleyin. Deneye bağlı olarak, bu gelişme hemen hemen aynı aşamasındaki uçların kullanımı için gerekli olabilir. Bunun için, 2-6 saat egglays enfeksiyonu için kullanılabilir.
  2. Hastalıklı larvalar (bağışıklık dokuları ve parazit diseksiyonu) hasat için, küçük bir cam veya plastik Petri kabına sinek flakon içeriği kaldırın.
  3. Dikkatli 6-10 larva, birer-bir seçim olduğunu ve 1X PBS ilk iyi bir depresyon içine yerleştirmek, bir stereomikroskopta ve ince forseps (cımbız) kullanarak, daha sonra suya aktarın,% 70 etanol, su ve 1X PBS, arda. Bu adımların amacı, sinek gıda hayvanları kurtarmak ve iyice yüzeyi temizlemek ve sterilize etmek. Su ile durulayın etanol sulandırır ve PBS etanol kaldırır nihai durulayın. Aşağıda Adım 3 için, bırakmak iyi değil10 dakikadan daha uzun süre PBS içinde hayvanlar.

3. Host / parazit Yapılar İzolasyon ve Tespit

Arkaplan

Larva lenf bezi küçük bir hematopoetik organı 7'dir. Üçüncü larva az, lenf bezi ön loblar büyük bir çifti içermesi kanadını dorsal kabın (Şekil 3A, 6B-C, D-7A). Ön loblar daha fazla benzersiz hücre özellikleri 7 ile özel bölgelerine ayrılmıştır. Üç hücre tipleri, plazmatositler, lamellocytes ve kristal hücrelerin ataları ön lob bulunur. Perikardiyal hücrelerin küçük bir arka lob ile ön lobları ayırın. Drosophila lenf bezi böcek ve memeli hematopoez 8,9 için bir modeldir.

Yağ gövdesi memeli karaciğer işlevsel olarak benzer. Humoral cevap vücut yağ aşağıdaki mikrobiyal veya yabanarısı enfeksiyon 1,4,10 tetiklenir. GibiBunun sonucunda, antimikrobiyal peptit genler benzersiz bir kombinasyonu aktive edilir ve peptidler hemolimf 1 salgılanmaktadır. Vücut yağ ayrıca glikojen ve trigliserid üretim ve depolama 11 için birincil dokudur. Larva, vücut yağ hemocoel önemli bir hacim kaplar ve böylece lenf bezi aksine, onu bulmak kolay. Biz şimdi üçüncü evre larvaları gelen lenf bezi ve vücut yağ teşrih nasıl gösterecektir.

Başlamadan önce

Ince forseps (cımbız) ve etanol-temizlenir mikroskop gerekiyor.

Larva lenf bezi diseksiyonu

  1. Ince forseps kullanarak 1X PBS tutulan bir gezgin Üçüncü dönem larva seçin.
  2. Bir mikroskop lamı üzerine larva yerleştirin.
  3. Forseps kullanarak yukarı ventral yüzü hayvan yerleştirin.
  4. Iki çift forseps kullanılarak, ya da arka uç tarafında (ok başlıkları 1, Şek. 3A) ve g'de hayvan tutmakkardiak defekt, manikür küçük, yüzeyel gözyaşı tanıtmak kütikül çekin.
  5. Hemosit, gut, ve vücut yağ içeren hemolimf vücut boşluğunda kaçmaya başlayacaktır. Hemolimf gerekirse, yayma yapmak için bir 10 ul "pipetteman" ile alınabilir.
  6. Ağız kancalar (ok uçları 2, Şek. 3A) altında hayvanın sağ tarafında hem forseps yerleştirilmesi, yavaşça kütikül gözyaşı.
  7. Ağız kancalar (ok uçları 2, Şek. 3A) altında hayvanın sol tarafına hem forseps taşıyın ve dikkatli bir küçük gözyaşı olun.
  8. Ağız tutarak hayvan kancaları da, yavaşça hayvanın arka uç (geri soyma sanki) doğru kütikül aşağıya çekin.
  9. Kütikül geri çekilir gibi, beyin, vücut yağ, hayali diskler, tükrük bezleri ve proventriculus maruz olacak. Müstakil kütikül posterior sonunda artık ama yine de ona bağlı lenf bezi ile dorsal gemi olacak. </ Li>
  10. Proventriculus kesin ve lenf bezi alanı uzağa taşıyın. Lenf bezi bunu görmek mümkün olmayabilir bile beynin altında olacak.
  11. Dikkatle vücut yağ, gut, tükrük bezleri ve bezi üzerinde oturuyor olabilir diğer yapılar uzak kızdırmak. Beyne posteriorunda yer alan halka bezi ve dorsal gemiden lenf bezi ayırmak için dikkatli olun. Lenf bezi mikroskop lamı karşı düz konumda olacaktır.
  12. Tüm bezinin ön lobu ile perikard hücrelerin nihai dizi izlerken kadar dikkatlice lenf bezi uzak tüm ek dokuların kaldırın.

Not: Bir doğru disseke lenf bezinin ön lob ve dorsal damar boyunca arka lob (Şekil 6B) iki set bir çift olacak. Loblar kolayca zarar görebilir veya dorsal geminin yola düşebilir. Örnekler bu nedenle büyük bir dikkatle ele alınmalıdır. Ayrıca bezi hshrivel veya sözleşme için bir eğilim olarak. Yavaşça arka ucunda organı dışarı düzleştime bütün kısımlar ve hücreler de sunulması için olanak sağlar. Bu İmmünoboyama protokolleri için özellikle gereklidir.

Fay vücut diseksiyonu

  1. Zeiss 1000 diseksiyon mikroskobu (diseksiyon mikroskobu, herhangi bir stereo kullanılabilir) ve diseksiyon Sahnede, olay ışık örnek aktarılmasını sağlayan bir ışık kutusu yerleştirin. 1X PBS 200 ul bir mikroskop lamı üzerine 2. Adım bir Üçüncü dönem larva yerleştirin. Organizmanın saydam görünür ve bu nedenle iç organları görselleştirmek kolay olacak şekilde numune uzak ışık kaynağı eğin.
  2. Anterior ucu sizden uzağa böylece forseps, pozisyon hayvan kullanma.
  3. Forseps kullanarak ağzına kanca sol tarafında (ok 1, Şek. 3B) üzerinde larva kütikül tutun. Diğer forseps kullanarak hafifçe kütikül posterior sonuna kadar tüm yol (ar gözyaşırowhead 2, Şekil 3B). Posterior sonunda vücuttan kütikül yırtmayın.
  4. Çok hafifçe bir tarafa gut kaldırarak başlayın.
  5. Yavaşça beyin, hayali diskler ve halka bezi dorsal damar yoluyla çalışan lenf bezi ile temizleyin.
  6. Bu bezler bağlı kalarak vücut yağ olmadığı için tükürük bezlerinin çıkarmayın.
  7. Yavaşça kütikül kaldırmak ve 1X PBS slaytta vücut yağ bırakın.

Not 1: vücut yağ tek bir hücre tabakası vardır ve tüm hücreleri cam slayt aynı düzlemde basık olması önemlidir. Hücreler endopolyploid ve görselleştirmek için kolaydır. İyi disseke vücut yağ örneği normal hücre kişileri korumak gerekir ve disseke örnek etrafında az yağ damlacıkları (Şekil 6i, J) olması gerekir.

Not 2: yabanarısı yumurtalarını konak bağışıklık sistemi tarafından etkilenmez, bunlar başlamıştır; olacakhemen e-geliştirme. Parazit (konak larva itibaren) Erken gelişim evreleri disseke hemocoel (Şekil 8) kolayca erişilebilir. Parazit yumurta veya larvaların da vücut yağ ya da diğer organlara bağlı, ya da sadece diseksiyonu sırasında cam slayt üzerine slip.

4. Bağışıklık Dokular Analizi

  1. PBS içinde hazırlanan% 4 paraformaldehit ile 5-10 dakika düzeltmeden önce vücut yağ slayttan 5-10 dk ve kaldır 1X PBS Hava kuru lenf bezleri. Her slayt boyama için birkaç disseke lenf bezleri olabilir. Sonraki adımlar için bir ev yapımı nemlendirilmiş odasına sabit örnekleri ile slaytlar taşıyın. Bu odanın boş bir plastik mikropipet ucu kutusunun altındaki katlanmış, nemli kağıt havlu iki adet koyarak hazırlanır. Örnekleri ile bir veya daha fazla slayt ipuçları tutmak için kullanılan bölücü üstüne yerleştirilebilir.
  2. Bunun gibi, bağışıklık dokuların analizi, standart yöntemler takiben yapılırin vivo hücre etiketleme ve dolaylı immünhistokimya 4 birleştirir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

  1. Wasp enfeksiyon Toll yolu muhabiri Drosomycin-GFP (Şekil 6G, J) ifadesi etkinleştirir. Bu deneyde, gen ekspresyonu arı bulaşmayı etkisi Dr organizatörü 12 bağlantılı bir GFP-muhabiri kullanarak in vivo görüntülenmiştir. Enfekte olmamış kontrol hayvanları olarak, GFP tanımı tespit edilmez. GFP sinyali açıkça L. ile enfekte olmuş hayvanlardan parçalanmış, vücut yağ hücrelerinin sitoplazması ve çekirdeğinde algılandığında victoriae. En iyi sonuçlar, Arı oranını elde etmek için: hosts 1:10 olması gerekir. Enfeksiyon en az 2 saat sürmelidir. Mesaj istilası, Drs-GFP sinyali yoğunlaşıyor ve birçok vücut yağ hücreleri bile 72 saate kadar 1,4 GFP-olumludur.
  2. Wasp enfeksiyonu l lamellocytes farklılaşmasını indüklerymph bezinin (Şek. 6D). Lamellocytes çevreleyen ve (Şekil 6H) wasp gelişimi engeller. Lenf bezleri L. sonra ön lobları indüklenen hücresel değişiklikleri görmenizi disseke edilir victoriae enfeksiyonu. Yeni diferansiye lamellocytes disseke lob periferinde var; lamellocytes şekilsiz artırıcı (MSNF9-GFP) tarafından yönlendirilen bir GFP transgen ile işaretlenmiştir. Tüm hücreler rodamin-etiketli Phalloidin kullanarak ipliksi aktin görselleştirilmiştir. , Ön loblar bütünlüğünü normalde (Şekil 6C) sürekli lob çevreleyen bazal membran olarak, bu bezlerde, bozulur fark (Şek. 6D) artık süreksiz olup. Aynı disseksiyonlar gelen, içinde hemolimf lamellocytes da (Şekil 6G) sürüntülerinde görüntülenmiştir olabilir; bunlardan bazıları parazit gelişim (Şekil 6H) engellemek için oluşan kapsül yapısı ile ilgilidir.
  3. Spätzle proteini larva lenf bezinin (Şek. 7C, D) en hücreler olarak ifade edilir. Disseke lenf bezlerinde SPZ algılamak için, poliklonal anti-SPZ antikorlar 4 ile lenf bezi hücrelerinin boyaması için standart bir protokol izledi. In vivo olarak, yaban arısı bulaştıktan sonra lenf bezi hücrelerinde SPZ seviyeleri artış (paneller Şekil karşılaştırın. 7C, E 7G, ben, ve paneller 7D 7H, F, J).
  4. Konukçu larva ve pupa (Şekil 8). Gelen yaban arısı gelişiminin erken ve geç evrelerinde Arıların gelişim aşamaları incelemek için, hastalıklı larvalar ovipozisyon sonra farklı zaman noktalarında disseke edilir. Burada Leptopilina spp bu aşamaların bir örnekleme göstermektedir. Enfekte yabani türü D. melanogaster ev sahipliği yapıyor.

Şekil 1
Şekil 1. Farklı arı türleri ve yaban arısı yumurta yumurtlama. Tüm görüntüler bir Leica stereomikroskop kullanılarak elde edilmiştir. A Trichopria drosophilae dişi yabanarısı bir D. içine yumurta oviposits ana pupa. C Melanized lekeleri Trichopria drosophilae yumurtlama arasında melanogaster pupa. B Büyütme ovipozisyon yerinde yaranın iyileşmesini göstermektedir. D L. boulardi erkek. E G. xanthopoda kadın. F L. victoriae kadın. G L. heterotoma erkek (solda) ve kadın.

Şekil 2
Şekil 2. Sinek / arısı silahlanma yarışını gösteren yaşam döngüleri. Iki sonuçtan biri Yumurtlama sonuçları. Konağın immün reaksiyonlar Ya arısı gelişimi (solda), ya da eşek arısı engellemek için başarılı konağın bağışıklık respo önüne geçilebilirnses ve (sağda) başarılı olur. Melk ve Govind, 1999 18 modifiye edilmiştir.

Şekil 3
Şekil 3. Önce diseksiyon ilgi organları gösteren Üçüncü Larvalar. Tüm görüntüler bir Leica stereomikroskop kullanılarak elde edilmiştir. GFP (yeşil) ile HML> GFP larva lenf bezinin bireysel hücrelerin floresans (ok) lenf bezinin genel konumu gösterir sağlam bir hayvan. Larva floresans ve parlak bir alan optik ile görüntülendi. Ok uçları metinde açıklanan lenf bezi diseksiyonu protokolü için önemli noktalarına işaret ediyor. Bozulmamış bir anim içinde organın yerini göstermek için vücut yağ GFP ile B Cg> GFP larvaark. Ok uçları metinde anlatılan vücut yağ diseksiyonu protokolü için önemli noktalarına işaret ediyor.

Şekil 4
Şekil 4. Toll yolunun parazitoit saldırı. Çekirdek bileşenleri karşı konak immün yanıtın immüno-genetik devre gösterilmiştir. ; Pestolu spatzlé (SPZ) proteaz; pestolu spatzlé işleme enzim, SPE tarafından aktive edilir. Aktifleştirilmiş SPZ Toll için bir ligand olarak hizmet eder. Hücre içi sinyal Dorsal ve Dif NF-KB transkripsiyon faktörleri, aktivasyonuna yol açar. Cactus yolunun IkB inhibitörü olarak hizmet eder. Drosomycin, kurallı bir Toll yolu hedef gen, etkinleştirme (bkz. Şekil. 6i, J) GFP muhabiri ile transgenik sinek suşlar kullanılarak izlenebilir.

Şekil 5,
Şekil 5. L. yanıt olarak kapsülleme içinde victoriae istilasıSerpent> GFP-dl Drosophila hosts. Serpent geninde artırıcı kan hücreleri 13 olarak ifade edilir. Bu artırıcı bir transgen içinde GFP-Dorsal füzyon proteininin ifadesi sürücüler zaman, Dorsal kapsül ve agrega makyaj bazı plazmatositler ve lamellocytes içinde YFP yeşil floresan yoluyla tespit edilir. Tüm resimler Zeiss EKK konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. L. Bir Yumurta Panel B'de örnek yumurta ekspres GFP-dorsal arka sonunda victoriae. BD Lamellocytes (beyaz oklar). CD Yüksek büyütme EH Örnekleri ipliksi aktin (F-aktin, kırmızı) görselleştirmek için rodamin etiketli Phalloidin ile zıt olan ve Hoechst 33258 ile L. DNA (mavi). E Encapsulated yumurta görselleştirmek için L. victoriae. F Melanized kapsül victoriae. GH L. victoriae INFEction kan hücresi (plasmatocyte ve lamellocyte) birleştirme neden olur.

Şekil 6
6 Şekil. Wasp enfeksiyonuna karşı bağışıklık yanıtları. Panelleri Görüntüler A ve B Zeiss Axio Kapsam kullanılarak elde edilmiştir. CJ Zeiss EKK konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir panellerde Görüntüler. Şeffaf kütikül aracılığıyla melanized kapsüllü wasp yumurta (ok) gösteren Host larva. Hoechst 33258 ile boyanan B Temsilcisi Üçüncü dönem larva lenf bezi tüm loblar ve serpiştirilmiş perikardiyal hücreleri hücre ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu 100 μ temsil eder. CJ Tüm numuneler Hoechst 33258 (etiket çekirdek) ve rodamin Phalloidin (F-aktin etiketlemek için) ile zıt edildi. CD anterior lenf bezi lobları kontrolünden (C) ve L. victoriae-enfekte (D) MSNF9-GFP hayvanlar. La özel enfekte hayvanların, MSNF artırıcı ifade, içindemellocytes 14, bir nükleer GFP muhabiri ile tespit edilir. enfekte hayvanlardan izole E Plazmatositler GFP ifade yoktur. Bu hayvanlar çok az varsa, herhangi bir lamellocytes. L. zayıf nükleer GFP ile F Plazmatositler (GFP-negatif, kısa ok) ve yeni-farklı, daha büyük lamellocytes (uzun oklar) Bir L. hemocoel gelen victoriae-enfekte MSNF9-GFP larva. G Ücretsiz ve toplu plazmatositler ve lamellocytes victoriae-enfekte Drs-GFP larva. Dr-GFP muhabiri ifadesi bazı plazmatositler (kısa ok) aktif, ancak lamellocytes de (uzun oklar) sonrası enfeksiyon. H Kapsüllenmiş ve L. melanized arısı larvası değil MSNF9-GFP konak larva boulardi-enfekte. Sayısız MSNF9-GFP pozitif lamelloctyes arısı larva (karanlık yapısı, kalın ok) saran ve güçlü nükleer GFP (uzun oklar) sergilerler. Bu panEl önceden PLoS One 15 yayınladı. IJ Yağ vücut hücreleri enfekte (I) ve L. diseke victoriae-enfekte (J) Drs-GFP larva. GFP nükleer ve enfekte hayvanların vücut yağ hücrelerinde sitoplazmik olduğunu. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 7
Şekil 7. Parazitoit wasp enfeksiyondan sonra; pestolu spatzlé ifade. AJ Numuneler DNA görselleştirmek için Hoechst 33258 ile zıt edildi. Tüm resimler Zeiss EKK konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. Bulaşmamış yw larva diseke AF ön lob. Numuneler primer antikor olmadan dolaylı immun için işlenmiş (A ve B) veya anti-SPZ antikoru (kırmızı, C, D, E, F) ile yapıldı ve (yeşil renkli bir etiket hücrelerinde F-aktin için Alexa Un-Phalloidin ile zıt;G, H, I, J) ve Alexa Fluor-Phalloidin (yeşil;;. Enfekte yw larva ve lekeli anti-SPZ antikoru ile (kırmızı diseke B, D, F) GJ anterior loblar. Panelleri H, J) EF Yüksek büyütme sırasıyla, sırasıyla, C ve D, G, H örneklerinin. IJ Yüksek büyütmelerde, numune. Paneller AD, G Ölçek barlar, H 50 um temsil eder.

Şekil 8
Şekil 8. L. larva ve pupa evreleri heterotoma ve L. belirtildiği gibi boulardi. Bireysel aşamalarında, larva veya pupa sinek hosts yazılan istilasına karşı izole edilmiştir. Tüm resimler Zeiss Axio Kapsam kullanılarak elde edilmiştir. Üst satır AF L. heterotoma aşamaları, 1-6 gün sonra enfeksiyon. Alt satır AF Postembryonic L. boulardi aşamalarında, enfeksiyondan sonra 4 ila 12 gün.

Şekil 9 Şekil 9. Deneysel protokol akış şeması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila parazitik yabanarısı Faiz tüm genom çözmek için moleküler teknikler verimli ve maliyet-etkin hale kabaran edilir. Ancak, son derece iyi çalışılmış hosts göre, yaban arısı biyoloji pek çok büyüleyici özelliği belirsiz kalır. Bu aralık, bağışıklık bastırma, süperparazitizm ve davranışlarını ev sahipliği ile ilgili konuları içerir. Bu sunumun odak sinek bağışıklık dokularda enfeksiyon etkileri göstermekti. Burada gösterildiği Diseksiyon teknikleri RNA düzeyinde (in situ hibridizasyon), ya da mikroarrayler ya da PCR için, ya da proteinlerin Western analizleri için nükleik asidin çıkarılması için gen ekspresyonunun analizi için kullanılabilir. Sinek türlerinin bir çok çeşitli stok merkezleri ve bağışıklık hücreleri manipüle ve etiketlemek için bireysel araştırma laboratuarları mevcuttur. Sinek suşların seçimi deneysel sorular tarafından dikte edilir. Bu Diseksiyon teknikler de bağışıklık analizi için kullanılabilirlerDiğer Drosophila türlerinin doku.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz Trichopria drosophilae, transgenik sinek suşları için Prof Tony Ip, ve anti-; pestolu spatzlé antikorları Prof Carl Hashimoto için Prof Todd Schlenke minnettarız. Biz Bu tanıtımı katkıları için laboratuar şimdiki ve geçmiş üyeleri teşekkür ederiz. NIH (S06 GM08168, RISE 41.399-009 ve G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2.006-03.817 ve 2009-35302-05277) ve PSC-CUNY sahibi: Bu çalışma aşağıdaki bağışları ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Fisher Scientific S80245-3 Active Dry
Fly Food Home made Corn meal, sugar Standard
Honey Dutch Gold From the store Clover
Vials Fisher Scientific AS514
Cotton plug/Foam stopper Fisher Scientific 14-127-40A
Spatula Fisher Scientific 21-401-15
Pyrex dissecting dish Fisher Scientific 50-930-382 9-well
Microscope slides pre-cleaned Fisher Scientific 7101 25.4 mm x 76.2 mm
Glass coverslips Pearl D12544 22 x 50
Glass coverslips Pearl G12544 22 x 60
Pasteur Pipette J H Berge 71-5200-05
100 mm Tweezers Sigma-Aldrich T-4662 Style # 5
Wash Bottle Fisher Scientific 03-409-22A Fisherbrand
Kim Wipess Fisher Scientific 34155 Kimberly Clark
Paper Towel Fisher Scientific Fisher X-101-C 1/8 x 13 1/8 in.
Leica stereomicroscope Empire Imaging Systems, INC. 10446208 MZFLIII
Zeiss Stereomicroscope Carl Zeiss, Inc. 000000-1006-126 "Stemi" 1000 or 2000-C
Light Source -LED Gooseneck illuminator Fisher Scientific 12563501
Stage Carl Zeiss, Inc.
Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Incubator Thermo Fisher Scientific, Inc. 815
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X Fisher Scientific MT-21-030-CM Mediatech
Ethanol Fisher Scientific 64-17-5 99.5 %
Formaldehyde (37% w/w) Fisher Scientific F79-1
H–chst 33258 Molecular Probes, Life Technologies H-1398 0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm
Rhodamine phalloidin Molecular Probes, Life Technologies R415 200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm
Alexa Fluor 488 phalloidin Molecular Probes, Life Technologies A22289 Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml
CO2 tank TW Smith
Anti-Spz antibody Gift Dr. C. Hashimoto (Yale)
Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50. Jackson ImmunoResearch 711-165-152 Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm
Antifade MP Biomedicals ICN10274790 0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS
Wasp Strains Fly Strains
L. victoriae16 y w
L. boulardi 171 UAS-GFP-Dorsal17
L. heterotoma2 SerpentHemoGal413
L. heterotoma 141 MSNF9-moCherry14
Trichopria drosophilae MSNF-GFP15
G. xanthopoda18 y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc4
y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
  2. Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
  3. Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
  4. Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234 (2010).
  5. Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated. Dev. Biol. 243-265 (2002).
  6. Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila. Genetics. 166, 1343-1356 (2004).
  7. Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132, 2521-2533 (2005).
  8. Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).
  9. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).
  10. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
  11. Schlegel, A., Stainier, D. Y. Lessons from "lower" organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism. PLoS Genet. 3, e199 (2007).
  12. Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).
  13. Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).
  14. Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila. Genesis. 47, 771-774 (2009).
  15. Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster. PLoS One. 4, e6429 (2009).
  16. Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae. J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).
  17. Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue. J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).
  18. Melk, J. P., Govind, S. Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics