Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Periferik duyusal sinir lifi alt tiplerinin İmmünositokimyasal kimlik (ve orada protein ekspresyonu tespit), periferik hissi altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için kilit öneme sahiptir. Burada periferik duyusal sinir lifleri belirli immün için, deri ve bacak kemikleri gibi periferik / visseral doku örnekleri, hazırlama yöntemleri açıklanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Algılama ve periferik duyusal sinir lifleri tarafından fiziksel, kimyasal ve termal duyusal uyaranlar birincil işleme, hayvanlarda ve insanlarda duyu algı anahtar. Bu periferik duyusal sinir lifleri, algılayabilir ve belirli duyusal uyaranlar başlatmak reseptörleri ve iyon kanal proteinlerinin bir bolluk ifade eder. Yöntem aynı zamanda bu liflerin belirli bir iyon kanalı proteinlerin fonksiyonel ifade tanımlamak için kullanılabilir cilt innerve periferik duyusal sinir lifleri, elektriksel özellikleri karakterize etmek için kullanılabilir. Ancak, benzer elektrofizyolojik yöntemler mevcut değildir (ve de geliştirmek için zor), periferik duyusal sinir lifleri, kemik gibi en zorlu dokuların da dahil olmak üzere diğer visseral organları innerve reseptörleri ve iyon kanal proteinlerinin fonksiyonel ifade algılama. Ayrıca, bu gibi elektrofizyolojik yöntemler olmayan Uyarılabilir protein ifade belirlemek için kullanılanperiferik duyusal sinir lifleri var. Bu nedenle, duyusal sinir fivers periferik / visseral doku örnekleri immün Bu sinir lifleri ilgi spesifik proteinlerin ekspresyonunu belirlemek için en iyi şekilde sağlar. Şimdiye kadar, duyusal nöronlarda protein ekspresyonu çalışmaların çoğu bilgi, belirli proteinlerin hücre vücudun belirli türleri ya da duyusal nöronların alt kümelerini ifade sınırlı duyu ganglionlar, prosedürleri immün kullanılmaktadır. Burada, periferik duyusal sinir lifleri immün periferik / visseral doku örneklerinin hazırlanması için ayrıntılı yöntemleri / protokoller raporu. Biz özellikle deri veya plantar punch biyopsi ve kemik (femur), periferik duyusal sinir lifleri immün farelerden elde edilen bölümleri hazırlanması için ayrıntılı yöntemleri. Bu yöntemler sadece periferik duyusal nöronlar protein ekspresyonu kalitatif tayin önemli değildir, aynı zamanda bir kantitatif yöntem sağlamakduyusal liflerin belirli türleri veya altkümelerini protein ekspresyon düzeylerinde değişiklikler tespit yanı sıra, çeşitli patolojik durumları sırasında duyusal liflerin sayısı ve yoğunluğu, morfolojik ve / veya anatomik değişiklikler belirlemek için. Ayrıca, bu yöntemler sadece duyusal sinir liflerinin boyanması sınırlı değildir, aynı zamanda deri, kemik ve diğer visseral doku herhangi bir tür sinir liflerinin boyanması için kullanılabilir.

Protocol

1. Hayvan Perfüzyon

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve araştırma hayvanların kullanımı için NIH yönergeleri izleyin.

  1. Perfüzyon bir gün önce, 4 ° C'de 1 L fosfat tamponu (0.2 M PB çift distile H 2 O, pH 7.4), ve mağaza hazırlamak Bu perfüzyon ve fiksasyonu sonrası süreçler için kullanılır.
  2. : 30 saniye için 200 ml cam beher GKD 2 O mikrodalga perfüzyon gününde, (PFA, pH 7.4)% 4.0 paraformaldehid 0.1M PB fiksatif çözüm 2 farelerin perfüzyon için yeterli bir hacmi 500 ml hazırlamak veya kaynar yaklaşımlar kadar. Davlumbaz altında sürekli karıştırılarak beher 20 g granül paraformaldehid (PFA) ekleyin. 5 N NaOH 5 ml damla bilge ve çözüm netleşene kadar karıştırın. PFA tamamen çözülür, oda sıcaklığında (RT) soğutulur. Slowly 0.2 M PB 250 ml sürekli karıştırarak ekleyin. Giderek zayıflar HCl çözümleri (6 N 1 K 0.1 N) kullanarak, pH 7.4 'e ayarlayın. Son hacim 500 ml ve buz üzerinde soğuk ayarlayın. Ayrıca buz üzerinde chill 2 O ve GKD 1:1 seyreltilmesi ile 0,1 M PB 400 ml 0.2 M stok hazırlamak.
  3. Intraperitonial aşırı dozda anestezi (27G bir iğne ile uygulanan pentobarbital sodyum, 80 mg / kg) enjeksiyonu fare anestezisi.
  4. Perfüzyon sırasında, 0.1 M PB (GKD 2 O ile seyreltilmiş 0.2 M PB stok 1:1) ve PFA 150 ml, 50 ml fare dolaşıma sırayla geçmiş olacak. PB ile tüp dolum ve bir ucunda 23 1 / 2 G kelebek iğne sabitleme peristaltik pompa ayarlayın. 0,1 M PB içeren behere Hortumun diğer ucunu bırakın. Ile 10 ml / dak peristaltik pompa ve pompa hızı, çözümün bir tüpün içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olmak için yeterli miktarda ayarlayın.
  5. A kadar bekleyin.nesthetized fare artık ayak / kuyruk tutam ve göz kırpma refleksi olarak herhangi bir refleks aktivite gösterir. Bir davlumbaz içinde bir diseksiyon tepsi ventral tarafta hayvan Lay ve bant ile pençeleri güvenli. % 70 etanol ile kürk Sprey. Göğüs kafesi ve karın duvarı açığa çıkarmak için üst çeyrek, orta hat boyunca deri yoluyla bir kesi olun. Daha sonra, göğüs kafesi tabanı karın duvarı kesti. Bu kesi yaptıktan sonra, diyafram ve sternum alt ucunda görünür olmalıdır. Dikkatli bir şekilde akciğerlere zarar vermemeye özen diyafram marjı ile soldan sağa doğru ve sternumun tüm uzunluğu boyunca kesilmiş. Bu aşamada sternum Bazı küçük kanama normaldir ve perfüzyon taviz olmaz. Bir kez sternum boyunca kesi yapılmış ve diyafram kesilmiş, kalp maruz kaldığı gibi göğüs kafesi yukarı ve dışa doğru, her bir yarısı kaldırmak mümkün olmalıdır. Gerekirse akciğerlerde bir kenara taşıyın. Göğüs kafesinin her iki yarısıhemostatik kelepçeler kullanımı ile bu pozisyonda yapılacaktır. Hayvan uzun eksenine paralel, sol ventrikül içine peristaltik pompa 3-4 mm bağlı kelebek iğne (23 1 / 2 G), takın . Bu yerleşim iğne yerinden olma riskini en aza indirir. Dönüş dolaşımı, kalp dışarı akmasına izin sağ atriyuma küçük bir kesi olun.
  6. 0.1 M PB ile 4-5 dk 10 ml / dak perfüzyon başlayın. Eğer hala bu noktada sağ atrium kaynaklanan önemli miktarda kan akışını temizlenene kadar devam etmektedir.
  7. PB akışını durdurun ve% 4 PFA çözüm için peristaltik pompa giriş anahtarı. 5 ml / dak akış hızı düşürün ve 20-25 dakika süreyle PFA çözüm pompalama devam. PFA dolaşıma girerken, birkaç dakika sonra kasların spazmı içine gidin ve hayvan anlamıyla konumunda "sabit" olmalıdır. Bu katılık, hayvan taşımak için özen hindpaws karşı hafifçe iterek test edilebilirnd kanül yerinden. İyi perfüzyon yanıt olarak esneme ekstremite önleyecektir. PFA perfüzyon tamamlandıktan sonra, kanül ve hemostatik kelepçeler kesilir ve kadavra doku diseksiyonu için hazırlanmış olabilir. Diseksiyonu yaklaşım kullanılan özel doku bağlıdır.
  8. % 4 /% 5 (v / v) PFA pikrik asit (PA) sadece plantar yumruk toplama ve post fiksasyon için% 4 PFA için doymuş pikrik asit çözeltisi ekleyerek hazırlayın. PA Eklenmesi nöronal periferik dokularda 1 antijen seçilebilirliği önemli ölçüde artırır
  9. % 0.07 gliserol ve% 15 sakaroz ile 0.1 M PB% 10 EDTA - kemik / kıkırdak doku kireç önleyici / dölveriminin çözüm hazırlayın. EDTA-tabanlı çözümler epitoplar 2 muhafaza ederken doku kirecini.
  10. 0.1 M PB% 30 sakaroz - dölveriminin çözüm hazırlayın.

2. Doku Diseksiyon / Kaldırma, Post-fiksasyon ve Kesit

  1. Plantar Punch
    Perfu yerleştirin.aşağı bir kesim mat veya diğer sağlam bir yüzey sed hayvan ventral tarafta. Ortasına ayak, ayak plantar yüzey-up, punch biyopsi aleti (Harris mikro-yumruk, Ted Pella A.Ş. 3 mm çapında) sıkıca bastırın Holding. Biyopsi aracı arka pençe tamamını kesti onaylamak için biyopsi aracı 180 derece ileri ve geri çevirin. Ayak yavaşça biyopsi aracı kaldırmak ve doku çıkarma kapaklı steril 2 ml tüpe 1 ml% 4 PFA /% 5 PA çözüm içeren.
  2. Ekstremite Kemik (örneğin, femur)
    , Hem de arka bacaklarda boyunca devam pelvis düzeyinde hayvanın arka boyunca yatay bir kesi yapmak. Pelvis ve femur proksimal femur başkanı zedelemeden iken pelvis ayrı çevreleyen kas içine Kes. Tibia / fibula distal kafa dokunmadığınızdan oyulmuş, kemik mil çevresindeki kas / periost kaldırılıyor. Femur% 4 PFA / 1 ml 2 ml içeren bir tüp içine yerleştirin% 5 PA çözüm.
  3. 16-18 saat süreyle bir rocker nazik karıştırma ile 4,% 4 PFA /% 5 PA çözüm doku örnekleri Post-fix ° C
  4. Aşağıdaki gibi doku kirecini: plantar yumruk (küçük ayak kemikleri kirecini) için 2 ml tüp içinde steril bir kap ile doku yumruk,% 0.07 gliserol ve 15 ile% 10 EDTA çözeltisi 0,1 M PB 1,5 ml içeren % sakaroz. 16-18 saat süren hafif karıştırma ile 4 ° C bacak kemikleri% 0.07 gliserol,% 10 EDTA çözeltisi 0,1 M PB 1,5 ml içeren 2 ml tüp içinde steril bir kap ile doku yerde bir rocker tüp yerleştirin. ve% 15 sakaroz. 6-7 gün, 4 ° C için hafif karıştırma ile bir rocker tüp yerleştirin. 24 saat ve bir çift forseps katılık kaybı için izlenen doku her decalcification çözümü değiştirilmesi gerekir.
  5. 2 ml steril bir tüpe 1,5 ml (0,1 M PB% 30 sakaroz) dölveriminin çözüm kap doku transferi ve bir rocker w tüp yerii. hafif karıştırma 16-18 saat 4 ° C
  6. Kesit için doku hazırlayın: bir yatak optimal kesim sıcaklığının hacmi (OCT) bileşik bir Kriyostat doku montaj bloğu (Sakura Finetek USA Inc) ve (tipik olarak -20 ° C'de muhafaza) Kriyostat odasında dondurmak için izin. Kriyojenik aerosol (Sito-freeze, Kontrol Co ABD) dondurma işlemi hızlandırmak için OCT püskürtülür. Place doku OCT bu yatak örnek ve OCT ek bir ince tabaka ile kaplayın. Sertleşti ve doku içinde donmuş kadar yavaşça bu Ekim kriyojenik aerosol sprey. Place Kriyostat odasında kesme kafası üzerine numune ve doku örneği blok kesme sıcaklığına gelmesini sağlayınız - en az 1 saat. Gömme bileşik hala kırılgan bölümleri ve doku hasarı çok soğuk sonuçlar bölümüne çalışıyorum.
  7. Doku kez optimum kesim sıcaklığına ulaştığında, numune kesme başlayacak ve 40 mikron bölümleri oluşturmak.
  8. plantar yumruk içeren 10 mM sodyum azid ile 0,1 M PB 12 iyi doku kültürü plakaları cryosections toplamak. 4 ° C'de bu çözüm bölümleri sular altında kalmasını emin olun. Bölüm immün amaçlar için 4-6 ay bu şekilde saklanabilir. Alternatif olarak, serbest bölümler -20 ° C (500 ml 0.1 M PBS, pH 7.2, 30 g sukroz, 10 g PVP40, 300 ml etilen glikol) dölveriminin çözüm süresiz olarak saklanabilir. 3.) saf su ile son ses seviyesini ayarlama 1L bacak kemikleri, jelatin kaplı öncesi slaytlar (veya SuperFrost üzerine cryosections doğrudan toplamak için Plus slaytlar, Fisher Scientific) ve -20 ° C'de saklamadan önce, 1 saat süreyle kurumaya izin Kemik bölümlerinde bu şekilde saklanan slaytlar üzerinde 2-3 ay içinde amaçlar immün için kullanılabilir.

3. Duyusal sinir lifleri Doku Bölümler immün

3.1. Plantar yumrukbölümleri yüzer bölüm boyama

  1. Bir tıraş bıçağı kullanarak, 1 ml mikropipet ucunun sonunda 6-7 mm kesti. Ön koşul (uç duvarlara doku bölümleri yapışmasını engeller) 0,1 M PB birkaç kez% 1 fetal sığır serumu (FBS) aspire ucu içinde. 24 iyi doku kültürü plakası lekeli olması plantar yumruk bölümleri aktarın. Normalde 8-10 bölümlerde çeşitli yüksek kaliteli bölümleri immün başına oluşturulur sağlamak için de her boyanmış olmalıdır.
  2. 500 ul başına dinç RT bir rocker karıştırma ile 5 dakika, 0.1 M PB plantar yumruk bölümleri ile yıkayın. 2 kez daha tekrarlayın.
  3. Yıkama solüsyonu atın ve 1 saat süre ile bir rocker nazik karıştırma ile,% 10 keçi serum ve 0.3% 0.1 Triton X-100 M PB (ortalama iyi bir çözüm engelleme 500 ul) oluşan, çözüm engelleme plantar yumruk bölümleri inkübasyon 4 ° C
  4. Engelleme çözümü birincil antibo atın ve doku kesitlerinde inkübe4 nazik bir rocker karıştırma ile 18-24 saat için 250 ul engelleme çözümü seyreltilmiş dy / antikorlar ° C Araştırmacı deneysel gereksinimleri, tek immunolabeling (belirli bir protein ya da sinir lifi işaretleyici karşı bir birincil antikor ile) veya çift immunolabeling (iki protein veya sinir lifi işaretleri karşı iki primer antikorları ile) dayanarak, aynı bölümde yapılabilir. Çift immunolabeling yerine getirirken farklı immünoglobulin G (IgG) isotypes (örneğin monoklonal antikorlar saflaştırılmış, alternatif olarak kullanılan iki birincil antikorlar farklı konak türleri (örneğin bir fare ve tavşanlarda gündeme yükseltilmiş) yükseltilmiş olduğunu doğrulamak için önemli olan, ya da bir IgG1 ve bir IgG2a) kullanılabilir. Aşırı buharlaşma önlemek için bir gecede inkubasyon Parafilm plaka sızdırmazlık için tavsiye edilir. Periferik duyusal sinir lifleri leke için, birkaç spesifik antikorların kullanılabilir. 200 protein nörofilaman karşı antikorlar (NF200, Sigma) etiket large-çapı elyaf, kalsitonin gen-ilişkili peptid (CGRP Sigma) ise ve geçici reseptör potansiyeli vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) etiket peptiderjik, küçük çaplı periferik duyusal lifler. Tüm periferik sinir lifleri de β3-tubulin karşı antikor ile boyandı. Ciltte kollajen IV (Abcam) epidermis, dermis ayıran bazal membran tanımlamak için kullanılır. Genel bir kural olarak, antikorlar genellikle 5-10 mg / ml konsantrasyonda hücre tabanlı kültürlü immünofloresan deneyleri için daha konsantre 5-10 kat olması gerekir.
  5. Doku kesitlerinde engelleme çözümünün 500 ul başına (Triton X-100) ve RT bir rocker üzerinde güçlü karıştırma ile 5 dakika yıkayınız. 3 kez daha tekrarlayın.
  6. 4 bir rocker nazik karıştırma uygun fluorofor-konjuge sekonder antikorlar (genellikle çözüm, 500 ul engelleme 1:1000 sulandırılmış) çamaşır çözüm ve inkübe doku kesitlerinde ° C atın Plaka must fluorophores, photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile sarılmış.
  7. 500 ul engelleme çözümü için iyi RT bir rocker üzerinde güçlü karıştırma ile 10 dakika ile doku bölümleri yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kuvvetli karıştırma ile 0,1 M PB 500 ul ile yıkayın. Son olarak, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuvvetli karıştırma ile 0.05 M PB 500 ul ile yıkayın.
  8. FBS-tedavi ucu (sonundan itibaren 6-7 mm kesim) ile 1 ml mikropipet kullanarak, doku kültürü ve plakası, transfer SuperFrost üzerine bölümleri aspirat Plus mikroskop slaytlar. Bölümleri düzenlemek ve ince bir fırça ile aşırı yıkama tamponu emer. Uzun süre ışığa maruz kalmaktan kaçınınız. Bölümler slayt (5-30 dk) bölümleri kurutmak için izin vermek amacıyla, RT slaytlar inkübe edin.
  9. Montaj orta (ProLongGold, Vectashield veya benzeri) birkaç damla uygulayın, yavaş yavaş bölümleri üzerine bir cam lamel yerleştirin. Slaytlar, 5 dakika süreyle karanlıkta oturup, ve daha sonra şeffaf tırnak lamel kenarları mühür izin verparlatın. 15-20 dakika süreyle hava kurutma izin verin. Slaytlar şimdi floresan herhangi önemli bir kayıp olmadan birkaç yıldır görüntülenir ya da -20 ° C'de saklanabilir.

3.2. Ekstremite kemik bölümleri - slayt boyama

  1. Slaytları -20 ° C depolama RT dönmek için izin verin. Hidrofobik bir bariyer kalem (Süper Pap Sıvı Engelleme Kalem, Ted Pella Inc.) Kullanarak çözüm cömert bir tabaka ile boyanmış kemik bölümleri içeren slayt bölge çemberle. 10-15 dakika kurumaya bırakın.
  2. 5 dakika boyunca slayt başına 0,1 M PB 250 ul kemik bölümleri yıkayın ve 2 kez daha tekrarlayın.
  3. Yıkama solüsyonu atın ve çözümü engelleme,% 10 keçi serum ve 4 1 saat süreyle% 0.3 Triton 0.1 X-100 M PB (slayt başına çözüm engelleme 250 ul) ° C oluşan kemik bölümleri inkübe
  4. Durumunda, engelleme çözümü atın ve primer antikor (ya da birincil antikor birlikte kemik bölümleri inkübe3.1.4 altında belirtildiği gibi çift immunolabeling), 4 saat süreyle 18-24 250 ul engelleme çözümü ° C seyreltilir Bu, slaytları primer antikor çözüm kurumasını önlemek için, kapalı bir kapak ile nemlendirilmiş bir odasında yerleştirilir gerektiğini not etmek çok önemlidir. Periferik duyusal sinir lifleri leke için, antikor (bkz. bölüm 3.1.4) yukarıda belirtilen benzer çalışma konsantrasyonları ile kullanılabilir.
  5. 250 slayt başına RT az 15 dakika süreyle bloke çözüm ul (Triton X-100) ile doku bölümleri yıkayın ve 3 kez daha tekrarlamak.
  6. Yıkama solüsyonu atın ve uygun fluorofor-konjuge sekonder antikorlar (genellikle engelleme çözümü, 250 ul 1:1000 sulandırılmış) kemik bölümleri inkübe 4 ° C Boyama odası fluorophores, photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile sarılmış olmalıdır. Kolaylık sağlamak için, koyu renkli boyama odaları (örneğin Slayt kuluçka tepsi / kutu, RPI Corp) kullanılması tavsiye edilir.
  7. WRT 15 dakika boyunca slayt başına çözüm engelleme 250 ul kül kemik bölümleri. Daha sonra RT az 15 dakika süreyle 0,1 M PB 500 ul ile yıkayın. Son olarak, oda sıcaklığında 15 dakika için 0,05 M PB 500 ul ile yıkayın. GKD 2 O Dip kısaca slaytlar çalkalayın ve kuru hava (5-30 dk) kemik bölümleri izin vermek için RT inkübe. Uzun süre ışığa maruz kalmaktan kaçınınız.
  8. Montaj orta (ProLongGold veya benzeri) birkaç damla uygulayın ve yavaş bölümleri üzerine bir cam lamel. 5 dakika süreyle karanlıkta slaytlar standı, ve daha sonra şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarları mühür edelim. 15-20 dakika kurumasını bekleyin. Slaytlar floresan kaybı olmadan birkaç yıl boyunca -20 ° C'de saklanabilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

4.1. Plantar yumruk bölümleri

Plantar yumruk doku bölümleri veya 10X, 40X veya 63X amacı ile konfokal mikroskop altında, Epifloresans mikroskop altında görüntülendi olabilir.

Şekil 1
Şekil 1, epidermal-dermal kavşakta ve kıkırdak ve kas Kollajen IV antikor (yeşil), bazal membran ile boyama AD gösterisi . Sayısız CGRP (AB, kırmızı) ve NF200-pozitif lifler (CD, kırmızı), plantar bölgede fare deri (oklar) boyunca dağıtılır. (; kırmızı F) esas (ok uçları yeşil) CGRP-pozitif küçük çaplı lifler sınırlı boyama TRPV1 ise β3-tubulin, bir pan-nöronal belirteç (E, kırmızı). A ve C 10X objektif (-500 mikron çaplı bar) ile alınan Epifloresans görüntüler, B, D, E ve F 2 mikron artışlarla, 60X objektif (ölçek altında alınmış bir 11-görüntü z-yığını üretilen konfokal görüntü karışımları bar - 50 mikron).

4.2. Ekstremite kemik bölümleri

Ekstremite kemik doku bölümleri de Epifloresans mikroskop altında, ya da bir konfokal mikroskop altında görüntülenir.10X, 40X veya 63X amacı ile e.

Şekil 2
, Anti-NF200 (CD, kırmızı; oklar), anti-β3-tubulin (E; kırmızı) ve anti-TRPV1 (F; kırmızı) co-lekeli; Şekil 2 anti-CGRP (oklar AB, kırmızı) ile immün anti-CGRP antikor (yeşil oklar). Bu görüntüler, süngerimsi kafa bölgede fare femur kemik matriks boyunca dağıtılan duyusal sinir lifleri alt tipleri göstermektedir. A ve C 10X objektif (-500 mikron çaplı bar) ile alınan Epifloresans görüntüler, B, D, E ve F 2 mikron artışlarla, 60X objektif (ölçek altında alınmış bir 11-görüntü z-yığını üretilen konfokal görüntü karışımları bar - 50 mikron).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada fare, cilt ve immün ve periferik duyusal sinir lifleri algılama kemik doku kesitlerinde hazırlanması için yöntemler ayrıntılarıyla belirttik. Plantar punch biyopsi üretilen bölümleri hem tüysüz ve saçlı deri içeren protokol, her cilt tipine kullanılabilir anlamına gelir. Bu teknikler aynı zamanda diğer hücre türleri (örneğin lökosit, vasküler endotelin, düz kas diğerlerinin yanı sıra) bu dokuların leke istihdam edilebilirler. Bu yöntemler en iyi ultrastrüktürel korunması arasında mükemmel bir uzlaşma (glutaraldehid fiksasyonu elde edilir, ancak sık sık epitopları ve azalmış immün boyama kalitesi bozulması sonuçlar) ve immünositokimyasal seçilebilirliği, titiz bir şekilde prosedürleri takip adım adım sağlar.

Algılama, bu dokuların duyusal sinir lifleri, periferik neurite akıbet düzenleme anlayışımız yardım ve çimlenme 4 birler de farklı patolojik durumlarda periferik duyusal aferentlerde anatomik değişiklikler gibi. Ayrıca, nörotransmitterlerin, reseptörler, iyon kanalları veya diğer fenotipik belirteçler normal gelişimsel ya da patolojik durumları ifade değişiklikler 3,5-10 okudu olabilir . Uygun, elektrofizyolojik, biyokimyasal ve davranış testleri ile birlikte, periferik duyusal nöron boyanma gibi değişiklikler ağrı çeşitli devletlerin 6,9, inflamasyon 11 ve nöropatiler 5,12 ile ilgili hipotezleri test etmek için kullanılabilir . Sonuç olarak, bu teknikler diğer anatomik, yapısal ve fonksiyonel verileri, ek yaklaşımlar yoluyla edinilen, sağlık ve hastalık periferik duyusal sinir lifleri düzenleme ve plastisite edinimi hakkındaki bilgilerimizi geliştirerek tamamlar ve güçlendirir in vivo veri paha biçilmez bir kaynak sağlar .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Acknowledgments

Ona sürekli yardım ve bu işe yapıcı eleştiri ve Dr. Donna L. Hammond; konfokal mikroskopi / fare plantar punch biyopsi immün görüntüleme ilk standardizasyon yardımlarından dolayı Dr. Yuriy M. Usachev teşekkür ederiz. Bu çalışma NINDS / NIH (NS069898) hibe ve DPM, Savunma Prostat Kanseri Araştırma Programı Bakanlığı (DoD-PCRP-101.096) Fikir Kalkınma Hibe Ödülü tarafından finanse edildi

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics