Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

Neuroscience

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Summary

Identificación de inmuno periféricos subtipos de fibras nerviosas sensoriales (y la detección de la expresión de proteínas en ella) son fundamentales para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la sensación periférica. A continuación se describen los métodos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral, como los huesos y la piel del miembro, por inmunotinción específica de las fibras nerviosas sensoriales periféricas.

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Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

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Abstract

Detección y procesamiento primario de los físicos, químicos y térmicos estímulos sensoriales de las fibras nerviosas sensoriales periféricas es la clave para la percepción sensorial en animales y humanos. Estas fibras nerviosas sensoriales periféricas expresan una gran cantidad de receptores y las proteínas de los canales iónicos que detectan e iniciar los estímulos sensoriales específicos. Se dispone de métodos para caracterizar las propiedades eléctricas de las fibras nerviosas sensoriales periféricas que inervan la piel, que también puede ser utilizado para identificar la expresión funcional de proteínas específicas de canales de iones en estas fibras. Sin embargo, los métodos electrofisiológicos similares no están disponibles (y también son difíciles de desarrollar) para la detección de la expresión funcional de los receptores y las proteínas de los canales iónicos en las fibras nerviosas sensoriales periféricas que inervan otras vísceras, incluidos los tejidos más difíciles, como los huesos. Por otra parte, estos métodos electrofisiológicos no puede ser utilizado para determinar la expresión de la proteína no excitabless en las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Por lo tanto, la inmunotinción de muestras de tejidos periféricos / visceral de horario de oficina nervio sensorial ofrece la mejor manera posible para determinar la expresión de proteínas específicas de interés en estas fibras nerviosas. Hasta ahora, la mayoría de los estudios de expresión de proteínas en las neuronas sensoriales han utilizado los procedimientos de tinción en los ganglios sensoriales, donde se limita la información a la expresión de proteínas específicas en el cuerpo celular de tipos específicos o subconjuntos de neuronas sensoriales. Aquí mostramos los métodos detallados / protocolos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral de la inmunotinción de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. En especial, detalle los métodos para la preparación de la piel o el plantar biopsia en sacabocados y hueso (fémur) secciones de los ratones de la inmunotinción de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Estos métodos no sólo son clave para la determinación cualitativa de la expresión de proteínas en las neuronas sensoriales periféricas, sino que también proporcionan un método de análisis cuantitativo paradeterminar los cambios en los niveles de expresión de proteínas en los tipos o subconjuntos específicos de las fibras sensoriales, así como para determinar los cambios morfológicos y / o anatómicas en el número y la densidad de las fibras sensoriales en varios estados patológicos. Además, estos métodos no se limitan a la coloración de las fibras nerviosas sensoriales sólo, pero también puede ser utilizado para la tinción de los tipos de fibras nerviosas de la piel, los huesos y el tejido visceral otros.

Protocol

1. Los animales fueron perfundidos

Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio son aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Iowa, y seguir las pautas del NIH para el uso de animales en la investigación.

  1. El día antes de la perfusión, preparar 1 litro de solución amortiguadora de fosfato (0,2 M PB en doble destilada H 2 O, pH 7,4), y se almacenan a 4 ° C. Esto será utilizado para los procesos de la perfusión y posterior fijación.
  2. En el día de la perfusión, preparar 500 ml de 4,0% de paraformaldehído en 0,1 M PB (PFA, pH 7,4), solución fijadora, un volumen suficiente para la perfusión de 2 ratones: microondas 200 ml de ddH2O en un vaso de cristal durante 30 segundos o hasta que se acerca a la ebullición. Añadir 20 g de paraformaldehído granular (PFA) al vaso de precipitado con agitación constante bajo una campana extractora. Añadir 5 ml de NaOH 5 N, gota a gota y revuelva hasta que la solución se aclare. Cuando la PFA se disuelva por completo, enfriar la solución a temperatura ambiente (TA). Slowly añadir 250 ml de 0,2 M PB agitando continuamente. Utilizando cada vez más débiles soluciones HCl (6 N a 1 N a 0,1 N), ajustar el pH a 7.4. Ajustar el volumen final de 500 ml y enfriar en hielo. También hay que preparar 400 ml de 0,1 M PB de 0,2 M de valores mediante la dilución de 1:1 en ddH2O y enfriar en hielo.
  3. Anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de una sobredosis de anestésico (pentobarbital sódico, 80 mg / kg, administrada con una aguja 27G).
  4. Durante la perfusión, 50 ml de 0,1 M PB (diluir 0,2 M PB acciones 1:1 con ddH 2 O) y 150 ml de PFA se pasará de forma secuencial en la circulación del ratón. Configure la bomba peristáltica, llenando la tubería con el PP y la fijación de una aguja de 23 1 / 2 G mariposa en un extremo. Sumerja el otro extremo de la tubería en el vaso que contiene 0,1 M PB. Ajuste la velocidad de la bomba peristáltica a 10 ml / min, y la bomba a través de una cantidad suficiente de la solución para asegurarse de que no hay burbujas de aire en la tubería.
  5. Espere hasta que el unonesthetized ratón ya no muestra ninguna actividad refleja, como una pizca tep / cola y reflejo de parpadeo. Coloque el animal en un lado la bandeja de disección ventral en el interior de una campana de humos y seguro de las patas con cinta adhesiva. Rocíe el pelo con un 70% de etanol. Hacer una incisión a través de la piel a lo largo de la línea media para exponer la caja torácica y el cuarto más alto de la pared abdominal. Luego, cortar a través de la pared abdominal en la base de la caja torácica. Después de hacer la incisión, el diafragma y el extremo inferior del esternón debe ser visible. Con cuidado, corte de izquierda a derecha a través del margen de la membrana, ya lo largo de toda la longitud del esternón, teniendo cuidado de no dañar los pulmones. Un poco de sangrado menor desde el esternón en esta etapa es normal y no comprometer la perfusión. Una vez que la incisión a lo largo del esternón se ha hecho y el corte del diafragma, debería ser posible para levantar cada uno la mitad de la caja torácica hacia arriba y hacia fuera, de tal manera que el corazón está expuesto. Hazte a un lado los pulmones si es necesario. Las dos mitades de la caja torácica puedese mantiene en esta posición con el uso de pinzas hemostáticas. Insertar la aguja de mariposa (23 1 / 2 G) unido a la bomba peristáltica 4.3 mm en el ventrículo izquierdo, paralelo al eje longitudinal del animal. Esta posición minimiza el riesgo de que la aguja cada vez desalojado. Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha para permitir la circulación de retorno a salir del corazón.
  6. Comenzar la perfusión con 0,1 M PB a 10 ml / min por 4-5 min. Si todavía hay una gran cantidad de sangre que emana de la aurícula derecha en este punto, continúe hasta que el flujo está claro.
  7. Detener el flujo de PB y el interruptor de la entrada en la bomba peristáltica para la solución al 4% PFA. Reducir la velocidad de flujo a 5 ml / min y volverá a bombear solución PFA durante 20-25 min. A medida que la PFA entra en la circulación, los músculos entran en espasmo y, después de unos minutos, el animal debe ser, literalmente, "fijo" en su posición. Esta rigidez se puede probar empujando suavemente contra las patas traseras, teniendo cuidado de no mover al animal unaª desalojar la cánula. Buena perfusión evitará que el miembro de la flexión en la respuesta. Una vez que la perfusión con PFA se ha completado, la cánula y pinzas hemostáticas y se puede desconectar el cadáver preparado para la disección de los tejidos. El enfoque utilizado depende de la disección del tejido específico.
  8. Prepare un 4% PFA / 5% (v / v) de ácido pícrico (PA, para la recogida y posterior fijación de golpe plantar solamente) mediante la adición de una solución saturada de ácido pícrico al 4% PFA. La inclusión de PA mejora significativamente la detección de antígenos en los tejidos periféricos neuronal 1
  9. Prepare hueso / cartílago solución tejido descalcificación / crioprotector - 10% de EDTA 0,1 M en PB con 0,07% de glicerol y 15% de sacarosa. EDTA soluciones basadas en la descalcificación del tejido preservando epítopos 2.
  10. Prepare la solución crioprotector - 30% de sacarosa en 0,1 M PB.

2. La disección del tejido / eliminación, Post-fijación y seccionamiento

  1. Plantar perforación
    Coloque la perfusiónsed lado animal ventral hacia abajo sobre un tapete de corte o superficie sólida otros. La celebración de la superficie plantar del pie plano, presione firmemente hacia abajo con la herramienta de biopsia (3 mm de diámetro; Harris micro-perforación, Ted Pella Inc) en la parte media del pie. A su vez la herramienta de la biopsia de ida y vuelta de 180 grados para confirmar la herramienta de corte a través de la biopsia de la totalidad de la pata trasera. Saque la herramienta de biopsia de los pies y la expulsión de los tejidos en el tubo estéril de 2 ml con tapa, que contiene 1 ml de PFA al 4% / 5% de solución de PA.
  2. La extremidad del hueso (fémur por ejemplo)
    Haga una incisión lateral a lo largo del lomo del animal a nivel de la pelvis, continuando hacia abajo a lo largo de las dos extremidades traseras. Corte en la pelvis y el músculo que rodea a separar del fémur de la pelvis dejando la cabeza proximal del fémur intacto. Corte en la tibia / peroné dejar la cabeza distal intacta, eliminando el músculo que rodea / periostio del eje del hueso. Coloque el fémur en un tubo de 2 ml que contiene 1 ml de 4% PFA /5% PA solución.
  3. Después de fijar las muestras de tejido en el 4% PFA / 5% de solución de PA, con mezcla suave en una mecedora durante 16-18 horas a 4 ° C
  4. Descalcificar el tejido de la siguiente manera: Para plantar golpe (de descalcifica los huesos pequeños del pie) coloque el bisturí del tejido en un tubo estéril de 2 ml con tapa, que contiene 1,5 ml de solución al 10% EDTA 0,1 M en PB con 0,07% de glicerol y 15 % de sacarosa. Coloque el tubo en una mecedora con la mezcla suave durante 16-18 horas a 4 ° C. Para huesos de las extremidades lugar del tejido en un tubo estéril de 2 ml con tapa, que contiene 1,5 ml de solución al 10% EDTA 0,1 M en PB con 0,07% de glicerol y el 15% de sacarosa. Coloque el tubo en una mecedora con leve mezcla durante 6-7 días a 4 ° C. La solución de descalcificación se debe cambiar cada 24 horas y el tejido supervisado por la pérdida de rigidez con un par de pinzas.
  5. Transferir el tejido en un tubo estéril de 2 ml con tapón con 1,5 ml de solución de crioprotectores (30% de sacarosa en 0,1 M PB), y colocar el tubo en un rockero wITH mezcla suave durante 16-18 horas a 4 ° C.
  6. Preparar los tejidos para el corte: colocar un volumen de lecho de la temperatura óptima de corte (OCT) compuesto (Sakura Finetek EE.UU. Inc.) en un bloque de tejido criostato de montaje y permita que se congele en la cámara de criostato (normalmente se mantiene a -20 ° C). Un aerosol criogénico (cito-congelación, control Co. EE.UU.) también puede ser rociado en la OCT para acelerar el proceso de congelación. Lugar muestra de tejido en este lecho de octubre y se cubre con una capa adicional fina de octubre Suavemente aplique este octubre con aerosol criogénico hasta que haya endurecido y el tejido en el congelador está. Muestra el lugar en el cabezal de corte en la cámara de criostato y permitir que el bloque de muestra de tejido que se equilibre a la temperatura de corte - por lo menos 1 hora. Tratando de sección cuando el compuesto incorporación sigue siendo los resultados muy frío en las secciones frágiles y daño tisular.
  7. Una vez que el tejido ha alcanzado la temperatura óptima de corte, empezar a cortar la muestra y generan el 40 secciones micras.
  8. para el sacador plantar recoger el cryosections en placas de 12 pocillos de cultivo de tejido que contiene 0,1 M PB con 10 mM de azida de sodio. Asegúrese de que las secciones permanecen sumergidas en esta solución a 4 ° C. Las secciones pueden ser almacenados de esta manera durante un máximo de 4-6 meses para fines de inmunotinción. Por otra parte, de libre flotación secciones se pueden almacenar por tiempo indefinido en una solución de crioprotectores a -20 ° C (500 ml PBS 0,1 M, pH 7,2, 30 g de sacarosa, 10 g PVP40, 300 ml de glicol de etileno). Ajustar el volumen final de 1 litro con agua destilada) 3. Para recoger los huesos de las extremidades cryosections directamente sobre de gelatina previamente revestida de diapositivas (o Superfrost Diapositivas, además, Fisher Scientific) y dejar secar al aire durante 1 hora, antes de guardar a -20 ° C. Secciones del hueso en las diapositivas almacenadas de esta manera se puede utilizar para fines inmunotinción a los 2-3 meses.

3. Inmunotinción de secciones de tejido de las fibras nerviosas sensoriales

3.1. Plantar golpesecciones - tinción sección flotante

  1. Usando una hoja de afeitar, cortar 6-7 mm del extremo de una punta de 1 ml micropipeta. Condición previa el interior de la punta aspirando 1% de suero fetal bovino (SFB) en 0,1 M PB varias veces (esto inhibe la adherencia de los cortes de tejido en las paredes de la punta). La transferencia de las secciones plantar golpe a teñir a una placa de tejido de 24 pocillos. Normalmente 8-10 secciones deben ser manchados por pozo para asegurarse de varias secciones de alta calidad se generan por inmunotinción.
  2. Lávese las secciones plantar golpe con 500 l de 0,1 M PB por así durante 5 minutos con una mezcla vigorosa en un agitador a temperatura ambiente. Repite 2 veces más.
  3. Deseche la solución de lavado e incubar las secciones golpe plantar en solución de bloqueo, que consiste en suero de cabra al 10% y el 0,3% de Triton X-100 en 0,1 M PB (500 l de solución de bloqueo por pocillo), con mezcla suave en una mecedora durante 1 h a 4 ° C.
  4. Deseche la solución de bloqueo y se incuban los cortes de tejido en primaria Antibody / anticuerpos diluidos en 250 l solución de bloqueo durante 18-24 h con agitación suave en un agitador a 4 ° C. Con base en las necesidades experimentales investigador, inmunomarcaje individual (con un anticuerpo primario contra una proteína específica o un marcador de la fibra nerviosa), o inmunomarcación doble (con dos anticuerpos primarios contra dos proteínas o marcadores de las fibras nerviosas) se puede realizar en la misma sección. Durante la realización de inmunomarcación doble, es importante verificar que los dos anticuerpos primarios utilizados son criados en diferentes especies huésped (por ejemplo, un ratón y se crió en una en conejo), o bien, anticuerpos monoclonales purificados de diferentes inmunoglobulina G (IgG) isotipos (por ejemplo, una IgG1 e IgG2a) se puede utilizar. Es recomendable para sellar la placa con Parafilm para incubaciones durante la noche para evitar la evaporación excesiva. Con el fin de manchar las fibras nerviosas sensoriales periféricas, varios anticuerpos específicos pueden ser utilizados. Los anticuerpos contra la proteína de neurofilamentos 200 (NF200, Sigma) etiqueta large fibras de diámetro, mientras que el gen de la calcitonina péptido relacionado con el (CGRP, Sigma) y el potencial de receptor transitorio peptidergic etiqueta vaniloide 1 (TRPV1, Neuromics) de diámetro pequeño y las fibras sensoriales periféricas. Todas las fibras nerviosas periféricas también se puede teñir con anticuerpos contra β3-tubulina. En la piel, el colágeno IV (Abcam) se utiliza para definir la membrana basal que separa la epidermis de la dermis. Como regla general, los anticuerpos deben ser de 5-10 veces más concentrada que la de cultivo celular basada en los ensayos de inmunofluorescencia, por lo general a una concentración de trabajo de 5.10 g / ml.
  5. Lavar los cortes de tejido con 500 l de solución de bloqueo (con Triton X-100) por así durante 5 minutos con la mezcla vigorosa en un agitador a temperatura ambiente. Repita 3 veces más.
  6. Deseche la solución de lavado y las secciones de tejido se incuban en determinados fluoróforo y conjugado con anticuerpos secundarios (normalmente diluido 1:1000 en solución de bloqueo, 500 l) con mezcla suave en un agitador a 4 ° C. La placa de must ser envuelto en papel de aluminio para evitar photobleaching de fluoróforos.
  7. Lavar los cortes de tejido con 500 l de solución de bloqueo por así durante 10 minutos con la mezcla vigorosa en un agitador a temperatura ambiente. Luego lavar con 500 l de 0,1 M PB con una mezcla vigorosa durante 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, lavar con 500 l de 0,05 M PB con una mezcla vigorosa durante 10 min a temperatura ambiente.
  8. Usando una micropipeta de 1 ml con una punta de FBS-tratados (corte de 6-7 mm desde el final), aspirar las secciones de la placa de cultivo de tejidos y transferir a SuperFrost Además de portaobjetos de microscopio. Organizar las secciones y absorber el exceso de tampón de lavado con un pincel fino. Evite la exposición prolongada a la luz. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente, con el fin de permitir que las secciones se sequen las secciones de la diapositiva (5-30 min).
  9. Aplique varias gotas de medio de montaje (ProLongGold, Vectashield o similar), poco a poco el lugar un cubreobjetos sobre las secciones. Permita que las diapositivas que se siente en la oscuridad durante 5 minutos, y luego sellar los bordes cubreobjetos con esmalte transparentepulido. Permita que el aire de secado durante 15-20 min. Las diapositivas se puede visualizar o almacenadas a -20 ° C durante varios años sin una pérdida significativa de la fluorescencia.

3.2. Secciones de las extremidades del hueso - en diapositivas tinción

  1. Permita que las diapositivas para volver a RT de -20 ° C en almacenamiento. Usando una pluma de barrera hidrofóbica (Super Pen Pap líquido de bloqueo, Ted Pella Inc) circunscribir la región en la diapositiva que contiene las secciones del hueso que se tiñeron con una generosa capa de solución. Deje secar al aire durante 10-15 min.
  2. Lavar las secciones del hueso con 250 l de 0,1 M PB por diapositiva durante 5 minutos y repita la operación dos veces más.
  3. Deseche la solución de lavado e incubar las secciones óseas en la solución de bloqueo, que consiste en suero de cabra al 10% y el 0,3% de Triton X-100 en 0,1 M PB (250 l de solución de bloqueo por diapositiva) durante 1 hora a 4 ° C.
  4. Deseche la solución de bloqueo e incubar las secciones de hueso en el anticuerpo primario (o la combinación de anticuerpos primarios, en caso dede inmunomarcación doble como se menciona en 3.1.4) diluida en solución de 250 l bloqueo de 18 a 24 horas a 4 ° C. Es muy importante tener en cuenta que las diapositivas debe ser colocado en una cámara húmeda con una tapa sellada, con el fin de evitar el secado de la solución de anticuerpo primario. Con el fin de manchar las fibras nerviosas sensoriales periféricas, el mencionado conjunto de anticuerpos (ver sección 3.1.4) se puede utilizar con concentraciones similares de trabajo.
  5. Lavar los cortes de tejido con 250 l de solución de bloqueo (con Triton X-100) por diapositiva durante 15 min a temperatura ambiente y repetir 3 veces más.
  6. Deseche la solución de lavado e incubar las secciones óseas en adecuada fluoróforo y conjugado con anticuerpos secundarios (normalmente diluido 1:1000 en solución de bloqueo, 250 l) a 4 ° C. La cámara de tinción deben ser envueltos en papel de aluminio para evitar photobleaching de fluoróforos. Para mayor comodidad, se recomienda el uso de colores oscuros cámaras de manchas (por ejemplo, caja de incubación de diapositivas bandeja /, RPI Corp.).
  7. Wcenizas de las secciones del hueso con 250 l de solución de bloqueo en cada diapositiva durante 15 min a temperatura ambiente. Luego lavar con 500 l de 0,1 M PB durante 15 min a temperatura ambiente. Finalmente, lavar con 500 l de 0,05 M PB durante 15 min a temperatura ambiente. Sumerja brevemente en ddH2O para enjuagar las diapositivas y luego se incuban a temperatura ambiente con el fin de permitir que las secciones de los huesos se sequen al aire (5-30 min). Evite la exposición prolongada a la luz.
  8. Aplique varias gotas de medio de montaje (ProLongGold o similar) y poco a poco el lugar un cubreobjetos sobre las secciones. Dejar que el pie se desliza en la oscuridad durante 5 minutos, y luego sellar los bordes cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Deje secar durante 15-20 min. Las diapositivas se pueden almacenar a -20 ° C durante varios años sin pérdida de fluorescencia.

4. Resultados representante

4.1. Plantar secciones golpe

Plantar las secciones de tejido golpe puede ser visualizada en microscopio de epifluorescencia, o bajo un microscopio confocal con un objetivo de 10X, 40X o 63X.

Figura 1
Figura 1. Mostrar el anuncio de la tinción con anticuerpos colágeno IV (verde) en las membranas basales, en el cruce de la epidermis, la dermis y en el cartílago y los músculos. Numerosas fibras CGRP (AB, de color rojo) y NF200-positivos (CD, de color rojo) se distribuyen por toda la piel del ratón en la región plantar (flechas). β3-tubulina es un marcador pan-neuronal (E, de color rojo), mientras que TRPV1 tinción (F, rojo) se limita principalmente a las pequeñas fibras de diámetro que también CGRP-positivas (verdes, puntas de flecha). A y C son imágenes tomadas de epifluorescencia con un objetivo de 10 aumentos (barra de escala -500 m), B, D, E y F son compuestos generados a partir de la imagen confocal un 11-Z-stack tomadas en incrementos de 2 micras en un objetivo de 60X (escala bar - 50 micras).

4.2. Secciones de las extremidades del hueso

Extremidades secciones de tejido óseo también se pueden visualizar al microscopio de epifluorescencia, o bajo un Microscop confocale con un objetivo de 10X, 40X o 63X.

Figura 2
. La figura 2 muestra la inmunotinción con anticuerpos anti-CGRP (AB, rojo, flechas), anti-NF200 (CD, rojo, flechas), anti-β3-tubulina (E, de color rojo) y anti-TRPV1 (F, rojo), co-manchadas con anticuerpos anti-CGRP (verde, flechas). Estas imágenes muestran los subtipos de las fibras nerviosas sensoriales distribuidas por toda la matriz del hueso en la región de la cabeza esponjosa del fémur del ratón. A y C son imágenes tomadas de epifluorescencia con un objetivo de 10 aumentos (barra de escala -500 m), B, D, E y F son compuestos generados a partir de la imagen confocal un 11-Z-stack tomadas en incrementos de 2 micras en un objetivo de 60X (escala bar - 50 micras).

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Discussion

Aquí hemos detallado los métodos para la preparación de la piel del ratón y las secciones de tejido óseo para la inmunotinción y detección de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Las secciones producido a partir de biopsias por punción plantar contienen la piel lampiña y peludo, lo que significa que el protocolo puede ser utilizado en cualquier tipo de piel. Estas técnicas también pueden utilizarse para teñir otros tipos de células en estos tejidos (leucocitos, el endotelio vascular, músculo liso, entre otros). Estos métodos proporcionan un excelente compromiso entre la conservación óptima ultraestructurales (que se logra mediante la fijación del glutaraldehído, pero con frecuencia resulta en la interrupción de los epítopos y disminución de la calidad de inmunotinción manchas) y detección inmunocitoquímica, si se siguen los procedimientos paso a paso de manera rigurosa.

La detección de las fibras nerviosas sensoriales de estos tejidos puede ayudar en nuestra comprensión de la regulación de la neurite periférica y el brote 4, uns así como los cambios anatómicos en periféricos aferentes sensoriales en diferentes condiciones patológicas. Además, los cambios en la expresión de neurotransmisores, receptores, canales iónicos o de otros marcadores fenotípicos en las condiciones normales o patológicas del desarrollo también se puede estudiar 3,5-10. Junto con las pruebas adecuadas electrofisiológicos, bioquímicos y de comportamiento, cambios en las neuronas sensoriales periféricas patrones de coloración puede ser utilizado para probar las hipótesis relacionadas con los estados de dolor diversas 6,9, la inflamación 11 y neuropatías 5,12. En conclusión, estas técnicas proporcionan una valiosa fuente de datos in vivo que complementa y refuerza anatómicas, los datos estructurales y funcionales adquiridos a través de enfoques adicionales, ampliar nuestro conocimiento de la regulación y la adquisición de la plasticidad de las fibras nerviosas sensoriales periféricas de la salud y la enfermedad.

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Disclosures

No hay conflictos de intereses declarados.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Yuriy M. Usachev por su ayuda en la estandarización inicial de microscopía confocal de imágenes / del ratón plantar inmunotinción de biopsia, y la Dra. Donna L. Hammond, por su ayuda continua y la crítica constructiva en este trabajo. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NINDS / NIH (NS069898), y un desarrollo de la idea de concesión de subvenciones del Departamento de Defensa Programa de Investigación de Cáncer de Próstata (DoD-PCRP-101096) para DPM

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

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