إنتاج نسيج [ميكروأرس]، وتلطيخ المناعية والتكنولوجيا الرقمية وضمن أطلس البروتين البشري

Biology
 

Summary

ميكروأرس الأنسجة يتيح وسيلة فعالة للحصول على معلومات المتزامنة من عدد وافر من الأنسجة. ويتم تجميع أجزاء من الأنسجة إلى ممثل كتلة البارافين واحد. وتستخدم أجزاء من كتلة لالمناعية وتحليل أنماط التعبير بروتين. المسح الرقمي يولد الصور المقابلة لتوزيع البيانات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjöstedt, E., Pontén, F. Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas. J. Vis. Exp. (63), e3620, doi:10.3791/3620 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نسيج [ميكروأري (TMA) تكنولوجيا يوفر وسيلة لعالية الإنتاجية تحليل للأنسجة وخلايا متعددة. وتستخدم هذه التقنية في إطار مشروع أطلس البروتين الإنسان لتحليل عالمي من أنماط التعبير بروتين طبيعي في الأنسجة البشرية، والسرطان، وخطوط الخلية. هنا نقدم للجمعية من النوى 1 مم، التي تم استردادها من الأنسجة اختيار ممثل مجهريا، في كتلة واحدة المتلقي TMA. يمكن أن تختلف في عدد وحجم النوى في كتلة TMA من ما يقرب من 40 ملم إلى 2 النوى مئات النوى 0.6 مم. وميزة استخدام TMA التكنولوجيا يمكن بسرعة أن كمية كبيرة من البيانات يمكن الحصول عليها باستخدام بروتوكول المناعية واحد لتجنب التقلبات التجريبية. الأهم من ذلك، هناك حاجة إلى كمية محدودة فقط من الأنسجة النادرة، والتي تسمح لتحليل الأفواج المريض كبير 1 2. ويمكن خفض ما يقرب من 250 المقاطع على التوالي (4 ميكرون سميكة) من كتلة والجمعية التونسية للأمهات وتستخدم لstaini المناعىنانوغرام لتحديد أنماط التعبير بروتين معين مقابل 250 الأضداد المختلفة. في المشروع البروتين أطلس الإنسان، تتولد أجسام مضادة تجاه جميع البروتينات البشرية واستخدامها للحصول على البروتين ملامح المناظرة في كل من أنسجة بشرية عادية من 144 أفراد والأنسجة السرطانية من 216 مريضا آخر، وهو ما يمثل 20 الأشكال الأكثر شيوعا من سرطان الإنسان. يتم فحص الملون Immunohistochemically أقسام TMA على شرائح زجاجية لخلق صور عالية الدقة من الذي علم الأمراض يمكن تفسير والتعليق على نتائج المناعية. تصنع الصور جنبا إلى جنب مع البيانات المناظرة الشرح علم الأمراض على أساس المتاحة علنا للمجتمع البحث من خلال بوابة البروتين أطلس الإنسان ( www.proteinatlas.org ) (الشكل 1) 3 4. أطلس البروتين البشري يوفر خريطة تبين توزيع والوفرة النسبية من البروتينات في الجسم البشري. في النسخة الحاليةسيون يحتوي على أكثر من 11 مليون صورة مع البيانات بروتين تعبير عن 12.238 بروتينات فريدة من نوعها، بما يعادل أكثر من 61٪ من جميع البروتينات المشفرة بواسطة الجينوم البشري.

Protocol

1. كيفية تحضير الأنسجة لإنتاج ميكروأري الأنسجة (الرسوم المتحركة 1)

  1. تحديد المواد ذات الصلة الفورمالين البارافين الثابتة جزءا لا يتجزأ من (نسيج أو خلية عينات) بما في ذلك المقابلة الهيماتوكسيلين قسم النسيج الملون.
  2. احتفال منطقة ذات الصلة في قسم الأنسجة. فمن المستحسن أن يكون لها الملون الهيماتوكسيلين قطع طازجة الفرع المقابل لكتلة البارافين.
  3. تصميم قالب المستخدمة في إنتاج TMA. عينات عشوائية داخل القالب لتجنب الآثار الناجمة عن المشاكل التقنية مثل تغطية الجسم المضاد على قسم TMA كامل والمشاكل باجتزاء. إضافة علامات اتجاه إضافية إلى قالب للتوجيه.
  4. تنظيم الأنسجة وفقا للقالب.

2. دليل الإنتاج ميكروأري الأنسجة (الأساسية للتصوير)

  1. لتكون قادرة على الحصول على طول موحد من صميم النسيج، بمناسبة مرود على سبيل المثال 4.5 مم (الشكل 2). Guidelإيناس عن التباعد بين مراكز عينة:
    جوهر حجم 0.6 ملم - 0،8-1،0 مم
    جوهر حجم ملم 1.0 - 1،8-2،0 مم
    جوهر حجم 1.5 ملم - 2،0-3،0 مم
    جوهر حجم 2.0 مم - 2،5-4،0 مم
    فمن المستحسن أن ترك هوامش 2،5-3،0 ملم على كل جانب من كتلة البارافين لتجنب الانشقاق من البارافين.
    1. تحميل اللكمات المختارة لاستخدامها. تبدأ من خلال فك مسامير مأخذ عرافة التي تحمل لكمة في مكان. يتوضع بشكل صحيح لكمة عندما يتم وضع بحزم الأخدود في المركز لكمة على قضيب معدني في البلاستيك V-كتلة. ربط المسامير وتأكد من حافة كليب المعدن هو أفقي.
    2. لكمة المستلم (ملحوظ في الخضراء والحمراء، محددة للموزع) وضعت يجب أن تكون إلى اليسار. لكمة من الجهات المانحة (ملحوظ في الخضراء والزرقاء، محددة للموزع)، والذي يبلغ قطره أكبر قليلا، وضعت يجب أن تكون إلى اليمين (الشكل 3).
    1. نقل اللكمات على طول x و y-محاور باستخدام المقابض تعديل XY. مفتاح تعديل حق نقل اللكمات على طول المحور س ومقبض تعديل اليسار يحرك اللكمات على طول المحور ص.
      هناك قراءات ميكرومتر الرقمية على المقابض التكيف على حد سواء. يتم تنشيط هذه عند نقل المقابض.
    2. إعادة → اضغط على زر صفر / ABS.
      التحول بين بوصة ومم → اضغط على زر في / مم.
      وينبغي أن المسافة بين الثقوب يكون 2.0 مم (تقاس بين المراكز من الثقوب) عند استخدام لكمة 1 ملم لقالب 9x8.
    1. لضمان أن لا يدفع لكمة أيضا إلى أسفل بعيدا في كتلة، لتصل إلى كاسيت وتدمير لكمة، ووضع شريط كاسيت بدون البارافين في حامل وضبط الموقف السفلي من لكمة المتلقي إلى 1 مم فوق الجزء السفلي من كاسيت باستخدام المسمار المحطة في العمقالزاوية اليسرى العليا من Z-دليل (الشكل 3).
    2. وضع حجر المتلقي في حامل واستخدام أصغر مفك البراغي لربط المسامير. لا ربط البراغي إلى ضيق أو البارافين قد كسر فضفاض من كاسيت.
    3. دفع المتلقي لكمة نحو الانخفاض ما يقرب من 5 مم إلى كتلة المستفيدة، واستخدام مقبض في لكمة لكمة لتدوير ذهابا وإيابا مرة واحدة (الشكل 3). وسوف يكون الثقب 5 مم عميق عندما دفع لكمة إلى أقصى حد لأسفل إلى كتلة ممكن.
    4. تخفيف الضغط النزولي دفع ببطء، حتى الينابيع يمكن ان تتحرك لكمة تصل. استخدام مرود لتفريغ لكمة وتجاهل جوهر البارافين.
  2. نقل برج للتبديل إلى لكمة من الجهات المانحة (الشكل 3).
  3. وضع جسر كتلة المانحة مع كتلة المانحة على المتلقي حامل كتلة (الشكل 3).
    1. دفع punc المانحةح في المنطقة التي تم اختيارها من كتلة من الجهات المانحة. استخدام الهيماتوكسيلين المناظرة ويوزين الشريحة الملون حيث تميزت هذه المنطقة من اهتمام لتحديد الأنسجة التي يتم أخذ عينات. عقد يدويا كتلة المانحة في موقف مع يدك اليسرى، ودفع لكمة باليد اليمنى. لاحظ أنه لا ينبغي عليك دفع على مرود. المحطة عمق لا يمنع هذا الاقتراح لكمة في الموقف الصحيح لكتلة من الجهات المانحة، لذلك من المهم أن توقفك عن الدفع عند العلامة الثانية هي واضحة على مرود.
    2. تدوير المقبض على لكمة واحدة (الشكل 3). الافراج عن الضغط إلى أسفل ببطء مع الاستمرار في الضغط على كتلة من الجهات المانحة على الجهات المانحة جسر كتلة.
    3. ويفضل أن يكون لكمات في الأنسجة المانحة 0.5 ملم أقصر من صميم المتلقي. هذه العملية سوف ضمان المواءمة قابل للتعديل من النوى على المتلقي سطح الكتلة، وتجنب فقدان الأنسجة ممثل قيمة.
  4. إزالة الجسر وكتلة من الجهات المانحة. جعلتأكد من أن يتم محاذاة لكمة من الجهات المانحة مع الثقب الذي تم في وقت سابق (النقطة 4). يجب ضبط الموقف لكمة باستخدام مجموعة البراغي إذا لم يتم محاذاة لكمة المانحة وثقب في كتلة المتلقي.
  5. دفع بعناية لكمة نحو الانخفاض حتى تصل إلى طرفها العلوي من ثقب في كتلة المتلقي. في حين عقد هذا الموقف، استخدم مرود لتفريغ جوهر النسيج في حفرة. يجب أن يكون سطح الأساسية بما يتوافق مع سطح الكتلة.
  6. نقل مرة أخرى إلى برج لكمة المتلقي.
  7. الانتقال الى موقف المقبل مع المقابض تعديل XY.
  8. كرر من 4C نقطة فوق حتى مجموعة كاملة.
  9. عند الانتهاء من كتلة مستلم كامل، وتخفيف الخناق في المتلقي حامل كتلة. خبز كتلة في 42 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. وضع كتلة مع المنطقة باجتزاء أسفل على شريحة زجاجية. وضع شريحة زجاجية مع كتلة على رأس أنبوب اختبار حامل (أو البناء مناسبة أخرى)، ومكان في تيسخن هو. بعد الخبز، وإزالة حامل أنبوب اختبار من الفرن وتتسطح سطح كتلة بواسطة التمسيد بلطف الشريحة الزجاجية.
  10. وضع حجر مع شريحة زجاجية على طبق من التبريد لمدة 10 دقائق.
    لضمان الأنسجة ممثل الجمعية التونسية للأمهات في جميع أنحاء يتم تنفيذ ومراقبة الجودة في كل باب من أبواب ال 50.

3. كيفية الواجبات الشهرية قسم (الرسوم المتحركة 2)

  1. قطع 4 ميكرون أبواب سميكة باستخدام مشراح مع نظام نقل قسم (HM 355S، Microm). ويمكن استخدام هذا النظام مع جميع microtomes دوار الحالي. ويتكون النظام من حاملة شفرة مع جسر النقل المتكاملة، وحمام ماء ساخن، ووحدة التحكم. من النصل تنزلق المقاطع على السطح الرطب نقل عن طريق جسر نقل في حمام ماء.
  2. ينبغي أن تؤخذ في المقاطع من حمام الماء مباشرة بعد انهم ممدودة، لتجنب ذوبان البقع الأنسجة الحساسة (الأنسجة الدهنية مثلا غنية مثل سرطان الثدي والدماغ). جيش التحرير الشعبى الصينىCE القسم على شريحة زجاجية superfrost. الوقت يمكن أن تترك الأجزاء في الماء يعتمد على نوع من البارافين مشمع المستخدمة ودرجة حرارة المياه. لدينا شمع البارافين استخدام مختبر من HistoLab المنتجات AB، والتي لها درجة انصهار 56-58 درجة مئوية، ونوصي درجة حرارة حمام ماء من 37-39 درجة مئوية.
  3. ضع الشرائح في حامل الشرائح للتجفيف في درجة حرارة الغرفة (RT) خلال الليل.
  4. هي خبز الشرائح في 50 درجة مئوية لمدة 12-24 ساعة. باستخدام microtom بدون STS لديك لنقل قسم من النصل على حمام مائي يدويا باستخدام مثل فرشاة.

4. الاختبار والمعايرة لإجراء المناعية (الرسوم المتحركة 3)

يخضع كل الأجسام المضادة لإجراء اختبار قياسية باستخدام الواجبات الشهرية المصممة خصيصا التي تحتوي على مزيج من الأنسجة وأنواع مختلفة من الخلايا. والهدف من ذلك هو لتقييم وضع بروتوكول المناعية الفردية والأمثل لكل الأجسام المضادة. في البداية 1 التخفيف، استنادا إلى نملةيتم اختبار ibody تركيز مخزون من الأجسام المضادة الأولية. وتستخدم نتائج هذا الاختبار تلطيخ لتوجيه مزيد من التخفيفات، وتعظيم الاستفادة من بروتوكول.

  1. يتم تنفيذ Deparaffinization والماء في الايثانول الزيلين ومتدرج إلى الماء المقطر قبل المناعية.
  2. يتم تنفيذ الخطوة عرقلة لإرواء البيروكسيديز endogeneous في 0.3٪ H 2 O 2 في الايثانول 95٪ لمدة 5 دقائق.
  3. يتم تنفيذ الحرارة المستحثة حاتمة استرجاع (هير) في درجة الحموضة عازلة استرجاع 6، باستخدام مرجل الضغط (غرفة Decloaking، بيوكير الطبية)، ومصدر الحرارة لمدة 4 دقائق في 125 درجة مئوية. بعد الانتهاء الغليان، والشرائح تبقى في مرجل الضغط وتترك لتبرد إلى 90 درجة مئوية. وقت المعالجة الكلية لهير ما يقرب من 45 دقيقة.
  4. إذا لم يتم الحصول على نتيجة حاسمة في اختبار أولي، وتتم اجراء مزيد من الاختبارات على أساس نمط تلطيخ الملاحظة 5 6. دراسة تجريبية، وذلك في HPA عالية الإنتاجية تصل مجموعة، وأظهرتان استرجاع مستضد مفيدة للغاية حيث يمكن بالطبع هير الهيدروجيني 6، ولكن طرق استرجاع الأخرى مثل حضانة قبل مع الميكروويف، وبروتين والغليان في المنطقة العازلة مع درجة حموضة أعلى أو أدنى يمكن استخدامها. على سبيل المثال عن طريق تغيير حالة IHC مع تغير الزمن حضانة الجسم المضاد، الضد التخفيفات والأوقات Diaminobenzidine حضانة (DAB) ويمكن للنمط تلطيخ تعطي نتائج أكثر حسما.

5. برنامج تلوين، Autostainer 480 (الحرارية فيشر العلمية)

تتم جميع حضانات على RT، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول في مثل إعداد دليل مع الكواشف نفسه.

  1. شطف الغسيل في المخزن.
  2. حضانة مع كتلة V جدا لمدة 5 دقائق.
  3. شطف الغسيل في المخزن.
  4. حضانة مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 30 دقيقة.
  5. شطف الغسيل في المخزن (X2).
  6. حضانة مع الفجل وصفت البيروكسيديز البوليمر لمدة 30 دقيقة.
  7. شطف الغسيل في المخزن (X2).
  8. النامية في حل DABلمدة 10 دقائق.
  9. شطف الغسيل في المخزن (X2).
  10. Counterstaining في الهيماتوكسيلين Mayers ل* 5 دقائق. عند استخدام التلوين بطريقة تدريجية (مثل Mayers الهيماتوكسيلين) شدة يعتمد على الوقت وليس هناك حاجة التمايز. وهناك طريقة تلوين رجعية مثل هاريس الهيماتوكسيلين يتطلب التمايز لإزالة الصبغة الزائدة من أنسجة من أجل إبراز هيكل.
  11. * شطف في مياه الحنفية.
  12. المخفف في ماء شطف كربونات الليثيوم، 01:05 من محلول مشبع ل1 * دقيقة واحدة.
  13. شطف في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق *.
  14. الشرائح هي المجففة في الإيثانول متدرج وcoverslipped الشرائح (PERTEX، Histolab)

يتم تطبيق كافة المواد الكاشفة على وحدة تخزين من 300 ميكرولتر لكل شريحة.
* تتم خطوات 10-14 في صك histostaining (Autostainer XL، لايكا) ويتم ذلك وبالإضافة إلى ذلك coverslipping في نظام coverslipper (الآلي coverslipper زجاج CV5030، لايكا).

6. كيفية المسح الضوئيشريحة

طريقة مسح الشرائح يعتمد على الماسحة الضوئية الرقمية يجري استخدامها، هذا البروتوكول يعرف فقط كيفية مسح شريحة باستخدام نظام المسح الضوئي الآلي Aperio XT (Aperio تكنولوجيز). في الإنسان التكبير أطلس البروتين 20X مجموعة المتابعة ليتم استخدامها في النسيج و40X للخلايا. ويمكن المسح الآلي واجهت مشاكل التركيز بسبب عدم تجانس النسيج وعدد من الأنسجة المختلفة تدرج في الجمعية التونسية للأمهات.

  1. تنظيف شريحة زجاجية من الغراء والأوساخ والتحقق من وجود فقاعات الهواء بين ساترة والقسم. في حالة الفرس البديل فقاعات الهواء الشريحة.
  2. وضع الشريحة في رفوف ووضع رف في الماسحة الضوئية الرقمية. الوقت لمسح TMA في تكبير 20X ما يقرب من 6 دقائق. ويستخدم البرنامج من Aperio لتحديد مجال الاهتمام. يتم اختيار نقطة التركيز تلقائيا في داخل البرنامج. يدويا اختيار منطقة المسح الضوئي، ونقاط التركيز هو ممكن أيضا.
  3. بعد ساعة صورةكما يمكن تولدت يمكن استخدامه لتقييم وشرح لتلطيخ IHC. تبقى الصور كملف نتيجة للتجربة، ويمكن توزيعها على الزملاء للمناقشات واستخدام مزيد من نشر البيانات. يمكن الاطلاع على الصور في البرامج المتاحة بحرية من Aperio.

7. كيفية البحث عن بروتين المفضلة لديك في أطلس البروتين البشري

  1. انتقل إلى www.proteinatlas.org.
  2. أدخل اسم بروتين المفضلة لديك، Ensembl الهوية، وعدد UniProt الانضمام أو HGNC الانسولين على سبيل المثال اسم.
  3. أدخل صفحة ملخص وانزل الى الأنسجة الطبيعية وملخص الجهاز. نظرة عامة يظهر بروتين تعبير في البنكرياس.
  4. انقر على "مزيد من البيانات الأنسجة". إدخال الأنسجة الطبيعية عرض حيث يمكنك ان ترى وشملت فرز جميع الأنسجة من قبل الجهاز.
  5. انقر على البنكرياس لعرض نتائج IHC لمدة 3 الأجسام المضادة الموجهة نحو نفس البروتين. لعرض مرحباGH-دقة وضوح الصورة من فوق البنكرياس على الصورة.
  6. ويمكن الاطلاع على معلومات إضافية حول تعبير البروتين في أنسجة الأورام السرطانية والخلايا ومزيد من التحقق من صحة البيانات داخل أطلس البروتين البشري عن طريق تصفح الموقع أطلس الإنسان البروتين.

8. ممثل النتائج

الرسوم المتحركة 1. كيفية تحضير الأنسجة لإنتاج ميكروأري الأنسجة. اضغط هنا لمشاهدة الرسوم المتحركة 1 .

الرسوم المتحركة 2. كيفية الواجبات الشهرية القسم. اضغط هنا لمشاهدة الرسوم المتحركة 2 .

3 الرسوم المتحركة. ويرد وصف لتقنية المناعية. اضغط هنا لمشاهدة الرسوم المتحركة 3 .

الشكل 1
الشكل 1. الخطة الشاملة للعملية في أوبسالا البروتين أطلس الإنسان.

الشكل 2
مرود الرقم المانحة 2. وضع علامة عليها للطول موحد من النوى النسيج مثلا 4.5 مم.

الشكل (3)
الشكل 3. دليل microarrayer الأنسجة.

الشكل 4
الشكل 4. أمثلة من نوعية مختلفة من الواجبات الشهرية المنتجة. (أ). على التوالي، والانحياز بشكل صحيح TMA مع مساحة كافية بين الصفوف والأعمدة، وكذلك إلى حافة البارافين (ب) والجمعية التونسية للأمهات مع بعض النوى قريبة جدا من حافة مما أدى إلى صعوبات محتملة عندما باجتزاء. (ج) والجمعية التونسية للأمهات التي تم خبز لتيOO الناتجة طويلة في TMA المنهار بدون القالب الصحيح.

الشكل 5
الشكل 5. هيماتوكسيلين والواجبات الشهرية يوزين الملون. (أ) فرع قطع بشكل صحيح مع الأعمدة على التوالي، والانحياز والصفوف. ويمكن استخدام شفرة سيئة أو قذر يؤدي الى تقسيم (B) أو أقسام المضغوطة (C).

الشكل (6)
الشكل (6). قياس الأجسام المضادة. (أ) رد الفعل في خلايا مركز العقدة الليمفاوية يظهر الضد معاير على النحو الأمثل مما أدى إلى تلطيخ 1 حشوية معينة (كما هو موضح في البني) بدون خلفية. (ب) وقسم الأنسجة ويبين تلطيخ ضعيف. تم العثور على تلطيخ سلبي أو ضعيف عند تركيز الأجسام المضادة الأولية منخفضة جدا أو إذا كان الهدف هو بروتين موجود في الأنسجة immunostained. (ج) overstained قسم الأنسجة بسبب استخدام تركيزات عالية جدا من الأجسام المضادة الأولية. دالنتائج لون الفلك في صعوبات تحديد مكان التحت خلوية نظرا لامتداد، عبر التفاعل والإيجابية الكاذبة.

Discussion

المناعية هي حتى الآن تطبيق الأكثر شيوعا عن الواجبات الشهرية. ويمكن استخدام مزيج من IHC والواجبات الشهرية في عدة أماكن مختلفة، مثل الإنتاجية العالية لفحص من أنماط التعبير البروتين في أنسجة 7 8 9 10 والخلايا، والدراسات اكتشاف العلامات البيولوجية على أساس عينات الأنسجة من الأفواج المريض كبير 11 12 وأكثر من ذلك بيولوجية الورم الأساسية دراسات، بما في ذلك مختلف الظواهر / المورثات، مراحل التمايز، تقدم والانبثاث 13. واحد الاستفادة من استخدام الواجبات الشهرية هي التي يمكن تحليلها مواد من أفواج كبيرة في وقت واحد، على حد سواء التجارب توفير المواد البيولوجية ذات قيمة، وضمان أكثر استنساخه. وعلاوة على ذلك، واستخدام تكنولوجيا TMA يوفر في تكاليف كاشف والوقت اللازم لتجهيز مختبر. ك TMA يحتوي فقط على كمية محدودة من الأنسجة، وعدم تجانس الأنسجة هي قضية. اعتمادا على نوع من الأنسجة، والمسائل التي ينبغي معالجتها، قد تكون هناك حاجة إلى عدة عينات من نفس specimeن. لأنسجة الورم، وينصح باستخدام 2-4 النوى من كل عينة كما فقد تبين أن يؤدي إلى درجة عالية من الدقة في تمثيل قطاعات النسيج كله 13 14. واعتمادا على تكوين أنسجة تعديلها القطر من اللكمات (التي تتراوح بين 0.6 ملم إلى 2 ملم). أنسجة معقدة وتتكون من كل من أنواع مختلفة من الخلايا عدة والهياكل والمصفوفة خارج الخلوي. تركيبة كل نوع من أنواع الأنسجة المختلفة التي تحتوي على كميات متفاوتة من الدهون، والأوعية الدموية والنسيج الضام، الغضروف وغيرها، تؤثر على الضغط اللازم لاللكم وجمع النوى منفصلة. ولذلك فإنه من الأهمية لممارسة جميع الخطوات في هذا الإجراء على المواد التي ليست له أي قيمة، وذلك قبل إصدار TMA مع الأنسجة المحددة للتجارب المقصود.

عندما باجتزاء مجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة داخل كتلة TMA يمكن للمرء أن تكوين كتلة التأثير على القدرة على الحصول على أجزاء ذات جودة عالية. ميتم قطع الأنسجة rtain، والجلد على سبيل المثال، ونخاع العظام، الدهون، والدماغ والثدي، وتقديم باجتزاء من كتلة TMA صعبا بسبب تأثير الخلافات في نسيج إحداث أقسام كيف نمد في حمام الماء، وكيف صلابة مختلفة من شفرة الخ. ولذلك يوصى للأنسجة مجموعة مع ميزات مشابهة مثل الأنسجة الدهنية الغنية في واحدة TMA، عند الاقتضاء. غالبية أنسجة السرطان هي في هذا المعنى متجانسة، مما يسهل باجتزاء من الواجبات الشهرية السرطان. ويمكن استخدام طريقة بديلة باجتزاء لتحقيق الاستقرار في الصميم عندما ميكروأري التعامل مع الجمعية التونسية للأمهات مع أنواع غير متجانسة من الأنسجة. ويمكن استخدام لاصق يكون من المفيد لتجنب وقوع خسائر من النوى وسقوط خارج في TMA مقطوع. وينبغي استخدام واستخدام شريط لاصق مع الحذر، لأن الشريط يمكن أن تؤثر في سماكة من النوى مقطوع، وأيضا في وقت لاحق نتائج تلطيخ IHC 15. في الأطلس البروتين البشري انشاء قالب TMA من 9x8 (باستثناء علامات) النوى ARاستخدام البريد. فإنه من الأهمية القصوى للحصول على عدد من الأقسام ومنع جميع الأنسجة ممثلة في جميع أنحاء كتلة. لتوفير الكواشف ووقت المسح الضوئي، ويتم وضعها 2 أقسام على شريحة زجاجية 1 السماح لقالب الحد الأقصى ل9x8.

مستودع كبير للحصول على معلومات من البروتين، 16 العالمي من الموارد البروتين ويشمل ما يقرب من 20،300 استعرض مقالات البروتين البشري، منها سوى ما يقرب من 66٪ لديهم أدلة على مستوى البروتين. أيضا للحصول على غالبية الجينات التي توجد أدلة على وجود على مستوى البروتين، وهناك ندرة أو أي معلومات عن وظيفة البروتين وتوزيع التعبير. يشكل تحديا هاما للمستقبل هو تحليل نمط التوزيع، والوفرة النسبية من هذه البروتينات غير معروف في أنواع مختلفة من الأنسجة البشرية. ويمكن استخدام المعلومات من قواعد البيانات مثل Uniprot، ENSEMBL، البيانات المنشورة من مجلات كدليل لتحديد ما اذا أنماط تلطيخ المناعية باستخدام أجسام مضادة لأجنحة البروتينات غير معروف تمثل ملامح البروتين الفعلي للبروتين الهدف المقصود. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى التحقق من صحة عدة استراتيجيات أخرى لضمان وظائف الجسم المضاد، حصول على وظائف الجسم المضاد سبيل المثال في صفائف البروتين، لطخة غربية، المناعي، المناعية هطول الأمطار، وهدم-التجارب. ولعل أهم أداة من أجل التحقق من وظائف الجسم المضاد هو استخدام الأجسام المضادة المقترنة، أي 2 الأجسام المضادة المختلفة التي أثيرت ضد منفصلة الحواتم غير متداخلة، على البروتين الهدف نفسه، لمقارنة الفحص محددة نتيجة 17.

استنادا إلى المعلومات التي تم جمعها، ويتم اختبار الأجسام المضادة ومعاير وفقا للمعايير IHC وتجربة من تجارب والتحقق من صحتها أكثر من 35،000 الأجسام المضادة في المشروع البروتين أطلس الإنسان. لأكثر من 20٪ من جميع الجينات مع لمحات من البروتين، وقد استخدمت بيانات من الأجسام المضادة المقترنة (2 أو أكثر الأجسام المضادة نحو غير متداخلة الحواتم على البروتين نفسه) لتحديد أفضل استيلم نمط البروتين التعبير المطابق. الأجسام المضادة المقترنة توفير استراتيجية في نهاية المطاف للتحقق من صحة محدد بروتين تعبير المناعية المستندة إلى أنماط. هذه الاستراتيجية هي قيمة لأن العديد من الأنسجة المختلفة المدرجة في الفرز الأساسية يزيد من المخاطر بالنسبة للتفاعل المتبادل. وينبغي أن يلاحظ أيضا أن بعض الأنسجة وبشكل عام أكثر عرضة لإظهار خلفية تلطيخ الضامة مثل العضلات الملساء، الأنابيب البعيدة في الكلى والكبد في الكبد. إضافية للنظر في قضايا تشمل اختلافات في تقنيات معالجة الأنسجة مع مرور الوقت للأنسجة مأخوذة من المواد الأرشيفية، والتي يمكن أن تؤدي إلى سلبية أو إيجابية كاذبة غير مناسب أنماط تلطيخ IHC. تم مصادفة أيضا في تحليل هذه الظاهرة قسم كبير. ضوابط السلبية والإيجابية على حد سواء تعتبر حيوية ويجب استخدامها كلما كان ذلك ممكنا. لتعميق الدراسات بما في ذلك تحليلات وظيفية، وخطوط الخلية مع التعبير القسري وهدم محددة-TR من المناظرةويمكن استخدام anscripts (تكنولوجيا سيرنا) لإنشاء الضوابط. لأفضل النتائج في IHC، من المهم لاختبار واستخدام نظم استرجاع مستضد، منذ التثبيت الفورمالين يدفع التعديلات الكيميائية المختلفة على سبيل المثال عبر ربط، التحلل من قواعد شيف اخفاء مستضد 18.

في الختام، الجسم المضاد القائم على البروتيوميات TMA توظيف التكنولوجيا وIHC هي استراتيجية قوية لتوليد البيانات بروتين تعبير على نطاق واسع. تم تعيين الإنسان مشروع أطلس البروتين تصل إلى وضع خريطة للتعبير البروتين البشري في الأنسجة البشرية الطبيعية والسرطان. والهدف من هذا المشروع هو تقديم أول مشروع لأطلس البروتين البشري شامل بحلول عام 2015. بالإضافة إلى تقديم ملامح بروتين طبيعي في الأجهزة والأنسجة، وهذا الجهد كما يوفر نقطة انطلاق لمشاريع البحوث الطبية الحيوية، بما في ذلك جهود السريرية اكتشاف العلامات البيولوجية. والهدف النهائي هو لإضافة طبقة من المعلومات التالية على رأس تسلسل الجينوم البشري أن وايسوف تكون حاسمة لفهم أعمق لعلم الأحياء وراء الحالات المرضية المختلفة، وتوفر أساسا لتطوير أدوات جديدة في التشخيص والعلاج.

Disclosures

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة كنوت واليس والنبرغ. واعترف كامل من الموظفين في المراكز البروتين أطلس الإنسان في أوبسالا واستوكهولم والهند لما بذلوه من جهود لإنشاء أطلس البروتين البشري. الكتاب أود أن أشكر خصوصا فرانك الحمار وغوستافسون صوفي للحصول على المساعدة مع الصور وKarlberg Elené للحصول على المساعدة في إنتاج TMA عند تصوير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wash buffer Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT
Citrate buffer pH6 Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-250-Pm1X
Antibody diluent Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UD
UltraVision LP HRP polymer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-HL
DAB plus substrate system Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-HDX
Ultra V Block Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UB
Primary Antibody Enhancer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-PB
Mayers hematoxylin Histolab 01820
PERTEX Histolab 00871.0500
Manual tissue micro arrayer Estigen, Beecher Instrument MTA-1
Waterfall microtome Thermo Fisher Scientific, Inc. Microm HM 355S
Automated image scanner Aperio Technologies XT
Automated slide staining system Thermo Fisher Scientific, Inc. Autostainer 480S-2D
Automated slide staining system for deparafinization and dehydration Leica Microsystems Autostainer XL
Automated glass coverslipper Leica Microsystems CV5030
Decloaking chamber Biocare Medical DC2008INTEL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Battifora, H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest. 55, 244-244 (1986).
  2. Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat. Med. 4, 844-844 (1998).
  3. Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies. Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).
  4. Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).
  5. Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells. J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).
  6. Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).
  7. Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics. Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).
  8. Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. The Human Protein Atlas - a tool for pathology. J. Pathol. 216, 387-387 (2008).
  9. Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics. J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).
  10. Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis. Proteomics. 7, 2142 (2007).
  11. Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer. Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).
  12. Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas. Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).
  13. Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).
  14. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources. Cancer J. 7, 24 (2001).
  15. Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts. Biotech. Histochem. (2010).
  16. UniProt. Nucleic acids research. 39, D214 (2011).
  17. Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).
  18. Leong, A. S., Leong, T. Y. Standardization in immunohistology. Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics