组织芯片,​​免疫组织化学染色和数字化生产在人类蛋白质图集

Biology
 

Summary

组织芯片允许一个有效的方法,从众多的组织中获得的并发信息。组织的代表零件组装成一个单一的石蜡块。从块中的部分用于免疫组化和蛋白表达模式的分析。数字扫描生成相应的图像数据分布。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjöstedt, E., Pontén, F. Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas. J. Vis. Exp. (63), e3620, doi:10.3791/3620 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

组织芯片(TMA)技术提供了多个组织和细胞的高通量分析手段。这项技术被用于人类蛋白质图集项目内,在正常的人体组织,癌症和细胞系的蛋白质表达模式的全球分析。在这里,我们提出了1毫米的核心组件,检索,从微观选择的代表组织成一个单一的收件者公会块。在TMA块核心的数量和大小可以改变数百个0.6毫米的核心大约四十2毫米的核心。使用TMA技术的优点是,可以迅速获得大量的数据,使用单一染色协议,以避免实验变异。重要的是,数量有限,只有稀缺的组织是必要的,允许对大量病人的分析同伙1 2。约250名(4微米厚)的连续部分可以从TMA块切割,用于免疫组化staini吴以确定特定的蛋白质表达模式为250种不同的抗体。在人类蛋白质图集项目,对所有人类蛋白质产生抗体,和来自216个不同的病人,代表人类癌症的20个最常见的形式,获得相应的蛋白质图谱,从144个人和癌组织,在正常的人体组织。 TMA的免疫组化染色玻片上部分扫描创建高分辨率的图像,从病理学家可以解释和注释免疫组化的结果。图像与相应的病理基础的注释数据为研究社会公开可通过人类蛋白质图集门户网站( www.proteinatlas.org )( 1)3 4。人体蛋白质图谱,提供了地图显示的蛋白质在人体中的分布和相对丰度。当前版本的锡安包含超过11万与12.238独特的蛋白,相应的超过61%的人类基因组编码的所有蛋白质的蛋白表达数据的图像。

Protocol

1。如何准备组织芯片生产组织(动画1)

  1. 选择有关福尔马林固定石蜡包埋材料,包括相应的​​苏木染色组织切片(组织或细胞样本)。
  2. 马克的组织切片上的相关领域。建议将新鲜切割的苏木染色部分相应的石蜡块。
  3. TMA的生产中使用的模板设计。随机样本,模板,以避免技术问题,如覆盖在整个TMA节和切片问题的抗体引起的工件内。添加额外的导向标志为导向的模板。
  4. 组织的组织,根据模板。

2。手动组织芯片制作(拍摄基本)

  1. 为了能够获得标准化组织核心长度,标志着如管芯4.5毫米( 图2)。 guidelINES为样本中心之间的间距:
    核心规格0.6毫米 - 0.8-1.0毫米
    核心大小1.0毫米 - 1.8-2.0毫米
    核心规格1.5毫米 - 2.0-3.0毫米
    核心规格2.0毫米 - 2.5-4.0毫米
    建议离开2.5-3.0毫米利润率每一侧的石蜡块,石蜡,以避免开裂。
    1. 装入选定要使用的拳。开始持有的地方冲六角螺丝松动。冲床正确定位时,在冲枢纽的凹槽坚决反对的金属棒放在塑料V型块。拧紧螺丝,确保边缘的金属夹子水平。
    2. 收件人冲床(红色和绿色,分销商的具体标记)应放置到左边。捐助冲(绿色和蓝色,经销商具体标明),其中有一个稍大的直径应放置到正确的( 图3)。
    1. 移动通过XY调节旋钮沿x和y轴的拳。正确调节旋钮沿x轴移动拳和左调节旋钮沿Y轴移动的拳。
      两个调节旋钮上有一个数字千分尺读数。这些动旋钮时被激活。
    2. →按重置的ZERO / ABS键。
      英寸和毫米之间的转变→按/毫米按钮。
      孔之间的间距应为2.0毫米(测量孔中心之间),当使用一个9x8的模板1毫米​​打孔。
    1. 为了确保你不推入块一拳太远下来,击中录音带和破坏冲,放无石蜡的持有人的录像带,并设置收件人的冲床的底部位置1毫米以上的纸盒底部通过在深度停止螺丝左上角的Z-指南( 图3)。
    2. 在持有人把的收件人块和用最小的螺丝刀拧紧螺丝。不紧或拧紧螺丝,石蜡可能打破从纸盒宽松。
    3. 收件人块推入收件人冲床下降约5毫米,并使用在冲手柄旋转冲头,来回一次( 图3)。将块推入冲床时尽量下尽可能为5毫米深的洞。
    4. 慢慢减轻向下推压,使弹簧可以移动一拳。使用管芯清空冲和丢弃的石蜡核心。
  2. 移动炮塔切换到捐助冲床( 图3)。
  3. 放置捐助块桥与超过收件人块持有人的捐助块( 图3)。
    1. 推动捐助puncH +进入捐助块选定区域。使用相应的苏木精和曙红染色幻灯片感兴趣的区域已标记为找到组织进行采样。手动举行捐助块,用左手的位置,并用右手推了一拳。请注意,你不应该管芯上推。深度停止不阻止拳打在适当的位置捐助块的议案,所以重要的是,你停止推动时的第二个标志是在管芯上可见。
    2. 旋转手柄上冲一次( 图3)。慢慢释放向下压力,同时仍保持对捐助块桥捐助块。
    3. 捐助组织是最好砸出0.5毫米比收件人核心短。这一过程将确保在收件人的块面的内核可调对齐,避免宝贵的代表组织的损失。
  4. 拆除的桥梁和捐助块。使确保捐助冲床与早些时候作出的(4点)的孔对齐。你必须调整使用的固定螺钉,如果不对齐的捐助力度和在收件人块孔的打孔位置。
  5. 小心推冲头向下,直到其尖端到达收件人块孔上方。持这种立场的同时,使用管芯流到洞的组织核心。核心表面应该是对齐的块面。
  6. 移动炮塔后面的收件人冲。
  7. 与XY调节旋钮,移动到下一个位置。
  8. 从以上点4C重复,直到数组是完整的。
  9. 当完成整个收件人块,松开在收件人块支架的螺钉。烤40分钟,42°C间的块。放在玻片上面临的切片面积的块。试管持有人(或其他适当的建设),并在T地点上放置块玻片他烤箱。烘烤后,从炉中取出试管支架和扁平块表面轻轻抚摸玻片。
  10. 放置玻片上一个10分钟的冷却板块。
    为了确保整个公会的代表组织,质量控制上每节50 进行。

3。如何节TMAs(动画)

  1. 第传输系统(航模355S,MICROM)的使用切片机,切4微米厚的部分。该系统可用于所有当前的旋转切片机。该系统包括一个刀架与综合传输的桥梁,热水浴和一个控制单元。从刀片的部分通过转移到水浴桥湿转让表面上滑行。
  2. 应采取的部分,从水浴后,他们立即伸出,避免敏感的组织点(如富含脂质,如乳腺癌和脑组织)的融化。解放军CE节上superfrost玻片。部分可以留在水中的时间取决于石蜡打蜡使用和水温。我们的实验室使用石蜡HistoLab产品AB,其中有一个熔点56-58℃,我们建议的水浴温度37-39°C。
  3. 过夜干燥,在室温(RT),放置在一个幻灯片持有人的幻灯片。
  4. 在50℃烘烤12-24小时的幻灯片。你有没有STS的运输如使用刷子部分手动从刀片水浴一个microtom。

4。试验和免疫组织化学滴定法程序(动画3)

每个抗体是一个标准化的测试程序,使用专门设计TMAs包含组织和不同类型的细胞组合。其目的是评估个人和优化每一个抗体染色协议。最初稀释,基于蚂蚁ibody股票的主要抗体浓度进行测试。这个测试染色的成果用于指导进一步的稀释和协议的优化。

  1. deparaffinization和二甲苯和梯度乙醇水化蒸馏水之前进行免疫。
  2. 阻塞一步解渴内源性过氧化物酶的H 2 O 2 0.3%,95%乙醇5分钟。
  3. 热诱导表面抗原检索(HIER)的执行中检索缓冲pH值6,使用压力锅炉(Decloaking室,医疗Biocare公司)作为热量来源为4分钟,在125°C。幻灯片完成后沸腾,保持中压锅炉,并让其冷却到90°C。为HIER总加工时间约45分钟。
  4. 如果没有在最初的测试中取得决定性的结果是,做进一步的测试的基础上观测到的染色模式5 6。一项试验研究,在HPA高吞吐量的设置,显示其中HIER pH为6,但其他检索方法,如蛋白酶,微波炉和沸点较高或较低的pH值的缓冲预孵化,当然可以使用的最有用的抗原检索。通过改变免疫组化的条件,如改变抗体孵育时间,抗体稀释和二氨基联苯胺(DAB)的孵育时间,染色模式可以提供更确凿的结果​​。

5。染色程序,Autostainer自动480(赛默飞世尔科技)

全部孵化完成后在室温下,此协议也可以用作手动设置在一个相同的试剂。

  1. 在洗涤缓冲液冲洗。
  2. 超V型块的潜伏期为5分钟。
  3. 在洗涤缓冲液冲洗。
  4. 潜伏期30分钟的主要抗体。
  5. 在洗涤缓冲液冲洗(X2)。
  6. 孵育30分钟标记的辣根过氧化物酶聚合物。
  7. 在洗涤缓冲液冲洗(X2)。
  8. 在民建联发展的解决方案10分钟。
  9. 在洗涤缓冲液冲洗(X2)。
  10. 在迈耶斯苏木为5分钟* Counterstaining。当使用一个渐进的染色方法(例如:迈耶斯苏木)的力度取决于时间和没有分化是必需的。一种倒退的染色方法,如哈里斯苏木需要从组织中删除多余的染料,以突出结构的分化。
  11. *自来水冲洗。
  12. 在碳酸锂水冲洗,经稀释的饱和溶液1分钟* 1:5。
  13. 在自来水冲洗5分钟。
  14. 幻灯片梯度乙醇脱水和幻灯片coverslipped(PERTEX,Histolab)

适用于所有的试剂体积300μL每张幻灯片。
*步骤10-14在histostaining仪器(Autostainer自动XL,莱卡)和盖片是加在coverslipper系统(自动玻璃coverslipper的CV5030,徕卡)。

6。如何扫描幻灯片

扫描幻灯片的方法是依赖于正在利用数字扫描仪,该协议只定义了如何使用自动扫描系统Aperio XT(Aperio技术)扫描幻灯片。在人类蛋白质图集设置20倍放大倍率的细胞组织和40X。自动扫描可能会遇到的焦点问题,由于异质性组织,包括在TMA不同组织的数量。

  1. 清洁的载玻片和污垢,胶水检查盖玻片节之间的气泡。在气泡重新安装幻灯片的情况。
  2. 在机架上放幻灯片,并将其放置在数字扫描仪机架。在20倍放大倍率1 TMA扫描时间约6分钟。从Aperio的软件是用来选择感兴趣的领域。在软件自动对焦点选择。手动扫描区域和着力点的选择也是可能的。
  3. 后的图像Ĥ已经产生,它可用于免疫组化染色的评价和注解。图像仍然是一个实验的结果文件,并可以向同事派发的讨论,并进一步公布的数据使用。这些图像可以被视为在Aperio一个免费软件。

7。如何搜索您最喜爱的蛋白在人类蛋白质图集

  1. 浏览到www.proteinatlas.org。
  2. 输入您最喜爱的蛋白质,Ensembl的ID,UniProt加入号码或HGNC名称,如胰岛素的名称。
  3. 进入摘要页面,向下滚动到正常组织和器官的总结。概述显示在胰蛋白表达。
  4. 点击“更多组织的数据”。你进入正常组织观看在这里你可以看到包括所有组织器官排序。
  5. 对胰腺点击查看针对相同的蛋白质抗体的免疫组化结果。要查看一喜胰腺点击图片GH-高分辨率图像。
  6. 有关蛋白表达在癌组织,细胞和人类蛋白质图集内的进一步验证数据的附加信息可以发现人类蛋白质图集网站浏览。

8。代表结果

动画1。如何准备组织芯片的生产组织。 点击这里查看动画1

动画2。第TMAs。 点击这里查看动画2

动画3。免疫组化技术描述。 点击这里查看动画3

图1
图1。在人类蛋白质图集乌普萨拉进程的总体方案。

图2
图2。捐助管芯标准化组织核心的长度标记,例如4.5毫米。

图3
图3。手册组织微阵列。

图4
图4。TMAs生产不同质量的例子。 (A)直和正确对齐TMA的行和列以及石蜡边缘之间有足够的空间。 (B)与一些核心公会过于接近切片时可能困难的边缘。 (C)财资市场公会已烤为TOO长在倒塌的公会不正确的模板。

图5
图5。苏木精和曙红染色TMAs。 (A)直和对齐的列和行的部分适当削减。用坏的或脏的刀片可能会导致分裂(B)或压缩的部分(三)。

图6
图6。抗体滴定。 (一)反应中心细胞在淋巴结显示最佳剂量的抗体,导致在一个特定的细胞质染色,无背景(棕色)。 (二)组织切片显示弱阳性。阴性或弱阳性,被发现时,初级抗体的浓度过低或如果目标蛋白是不存在的免疫染色组织。 (三)组织部分overstained由于使用初级抗体浓度过高。在D在确定由于溢出,交叉反应和假阳性的亚细胞定位的困难方舟的色彩效果。

Discussion

免疫组化是迄今为止TMAs最常用的应用程序。 IHC和TMAs的组合,可以用来在几个不同的设置,如高通量筛选组织7 8蛋白的表达模式和细胞组织样本从大的病人同伙11 12及以上的基本肿瘤生物学基础9月10日 ,生物标志物的发现研究研究,包括不同的基因型/表型,分化阶段,进展和转移13。使用TMAs的一个好处是,大同伙的材料可以在同一时间进行分析,既节省了宝贵的生物材料,并确保更多的重复性实验。此外,TMA技术的使用,节省试剂成本和实验室处理时间。作为一个公会只包含数量有限的组织,组织的异质性是一个问题。根据组织类型和要解决的问题,可能需要几个样品相同specimeN。对于肿瘤组织,利用两到四个内核,每个试样建议,因为它已被证明,导致在整个组织切片13 14代表高度的准确性。根据组织组成的拳(范围从0.6毫米至2毫米)直径可以调整。组织是复杂的,既有多种不同的细胞类型,结构和细胞外基质组成。每个不同类型的可变数量的脂肪组织中含有的成分,血管,结缔组织,软骨等,会影响冲压和收集单独的内核所需的压力。因此,它是重要的前1 TMA的生产与组织定义为实验目的,练习过程中的所有步骤上,是没有任何价值的材料。

当一个公会块切片在各种不同的组织块的组成可能影响的能力,以获得高品质的部分。 CErtain组织,如皮肤,骨髓,脂肪,大脑和乳腺癌,渲染切片的TMA块困难,因为质地差异影响如何节伸展在水浴的作用,以及如何不同硬度被切断刀片等因此,建议类似的功能组组织成一个公会的脂质丰富的组织,例如,当适用。癌组织中的大多数在这个意义上是均匀的,这有利于癌症TMAs切片。处理异构类型的组织1 TMA时,可以采用替代切片稳定的芯片内核的方法。胶带的使用可以帮助,以避免在切片TMA的核心和下降的损失。胶带的使用,应采用谨慎,因为磁带可以影响切片内核的厚度和随后也IHC染色15的结果。在人类蛋白质图集设置了9x8公会的模板(不含标志)内核ARE中。它是获得最大数量的部分,并保持整个街区为代表的所有组织的重要性。为了节省试剂和扫描时间,2节被放置在一个玻璃允许9x8的最大模板的幻灯片。

主要为蛋白质信息库,通用的蛋白质资源的16包括约20.300审查人类蛋白质项,其中只有约66%,在蛋白质水平的证据。也为广大的基因,这些基因的蛋白质水平上存在的证据,有很少或没有表达的蛋白质的功能和分布的信息。对于未来的一个重要挑战是分析的分布格局和这些未知的蛋白质在人体组织的各类相对丰度。如Uniprot,ENSEMBL公布的数据显示,从医学数据库中的信息可用于为指导,以建立,如果使用抗体免疫组化染色模式病房未知的蛋白质代表实际的预定目标蛋白的蛋白质图谱。此外,其他几个验证战略的需要,以确保抗体的功能,例如蛋白质阵列的抗体,免疫印迹,免疫荧光,免疫沉淀和下拉实验功能。也许抗体的功能验证的最重要的工具是使用配对的抗体,即反对独立,互不重叠的表位的两种不同的抗体,对同一目标蛋白,比较具体分析的结果17。

的基础上编制的信息,抗体测试和滴定根据免疫组化的标准和35.000抗体在人类蛋白质图集项目的测试和验证的经验。对于超过20%的基因与蛋白质表达谱,配对抗体(2个或更多的对非重叠的表位相同的蛋白质的抗体)的数据已被用来确定最佳估计相应的蛋白表达模式的队友。配对抗体提供验证基于特定的免疫组化蛋白表达模式的最终战略。这一战略是有价值的,因为多种不同的组织包括在基本筛选增加了交叉反应的风险。还应当指出的是,某些组织一般更容易显示背景染色,如巨噬细胞,平滑肌,肾远端小管和肝细胞。额外要考虑的问题包括组织处理技术的变化,随着时间的推移,从档案材料中所采取的组织,这可能会导致假阴性或不适当的免疫组化染色阳性模式。这种现象也遇到了大断面分析。正面和负面的控制是至关重要的,应尽可能使用。为更深入的研究,包括功能分析,被迫表达的细胞株和相应的TR的具体敲anscripts(RNA干扰技术),可用于创建控件。免疫组化的最佳效果,它是重要的抗原检索系统进行测试和使用,因为福尔马林固定引起不同的化学修饰,如交联,水解希夫基地掩盖抗原18。

总之,采用TMA技术和IHC抗体为基础的蛋白质组学是一个强大的战略产生了大规模的蛋白表达数据。人体蛋白质的Atlas项目已成立,创造了人类在正常的人体组织和​​癌蛋白表达的地图。这个项目的目的是提出一个全面的人类蛋白质图集“的第一稿,到2015年。除了在正常组织和器官的蛋白质图谱,这项工作还提供了一个生物医学研究项目,包括临床生物标志物的发现工作的出发点。最终目标是在人类基因组序列的顶部添加下一个信息层,无线网络将是至关重要的一个潜在的各种疾病状态的生物学更深入的了解,并为开发新的诊断和治疗手段提供依据。

Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgements

这项工作是由Knut和Alice Wallenberg基金会赠款支持。整个人类蛋白质图集中心在乌普萨拉,斯德哥尔摩和印度的工作人员都承认他们的努力产生的人类蛋白质图集。作者希望拍戏时特别感谢的照片和忆念美Karlberg留言弗兰克·Hammar和SOFIE古斯塔夫森的援助援助与TMA的生产。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wash buffer Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT
Citrate buffer pH6 Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-250-Pm1X
Antibody diluent Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UD
UltraVision LP HRP polymer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-HL
DAB plus substrate system Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-HDX
Ultra V Block Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UB
Primary Antibody Enhancer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-PB
Mayers hematoxylin Histolab 01820
PERTEX Histolab 00871.0500
Manual tissue micro arrayer Estigen, Beecher Instrument MTA-1
Waterfall microtome Thermo Fisher Scientific, Inc. Microm HM 355S
Automated image scanner Aperio Technologies XT
Automated slide staining system Thermo Fisher Scientific, Inc. Autostainer 480S-2D
Automated slide staining system for deparafinization and dehydration Leica Microsystems Autostainer XL
Automated glass coverslipper Leica Microsystems CV5030
Decloaking chamber Biocare Medical DC2008INTEL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Battifora, H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest. 55, 244-244 (1986).
  2. Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat. Med. 4, 844-844 (1998).
  3. Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies. Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).
  4. Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).
  5. Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells. J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).
  6. Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).
  7. Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics. Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).
  8. Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. The Human Protein Atlas - a tool for pathology. J. Pathol. 216, 387-387 (2008).
  9. Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics. J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).
  10. Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis. Proteomics. 7, 2142 (2007).
  11. Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer. Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).
  12. Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas. Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).
  13. Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).
  14. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources. Cancer J. 7, 24 (2001).
  15. Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts. Biotech. Histochem. (2010).
  16. UniProt. Nucleic acids research. 39, D214 (2011).
  17. Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).
  18. Leong, A. S., Leong, T. Y. Standardization in immunohistology. Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics