Fremstilling af myeloide afledte suppressorceller (MDSC) fra naive og pancreas Tumorbærende mus under anvendelse af flowcytometri, og Automatiseret magnetisk aktiveret cellesortering (AutoMACS)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette er en hurtig og omfattende fremgangsmåden immunfænotypebestemmelse Myeloide afledte suppressorceller (MDSC) og berige Gr-1

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MDSC er en heterogen population af umodne makrofager, dendritiske celler og granulocytter, der ophobes i lymfoide organer i patologiske tilstande, herunder parasitisk infektion, inflammation, traumatisk stress, graft-versus-host-sygdom, diabetes og cancer 1-7. I mus. MDSC udtrykker Mac-1 (CD11b) og Gr-1 (Ly6G og Ly6C) overfladeantigener 7 Det er vigtigt at bemærke, at MDSC godt undersøgt i forskellige tumor-bærende vært, hvor de er betydeligt udvidet og undertrykker anti-tumor immunrespons i forhold til naive modstykker 7-10. Afhængigt af den patologiske tilstand, der er forskellige subpopulationer af MDSC med forskellige mekanismer og mål suppression 11,12. Derfor effektive metoder til at isolere levedygtige MDSC populationer er vigtige til at belyse de forskellige molekylære mekanismer for undertrykkelse in vitro og in vivo.

Nylig Ghansah gruppe har rapporteret om en udvidelse af MDSC i en murin bugspytkirtelkræft model. Vores tumorbærende MDSC viser et tab af homeostase og øget suppressive funktion sammenlignet med naive MDSC 13. MDSC procentdele er signifikant mindre i lymfoide rum af naive versus tumor-bærende mus. Dette er en væsentlig hage, som ofte forhindrer nøjagtig komparative analyser af disse MDSC. Derfor berige Gr-1 + leukocytter fra naive mus forud for fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) forøger renheden, levedygtighed og reducerer sortering tid. Imidlertid berigelse af Gr-1 + leukocytter fra tumorbærende mus er valgfri, da disse er i overflod til hurtig FACS-sortering. Derfor, i denne protokol, beskriver vi en meget effektiv metode til immunfænotypebestemmelse MDSC og berigende Gr-1 + leukocytter fra milt fra naive mus til sortering MDSC i tide. Immunokompetente C57BL / 6 mus inokuleret med murin Panc02 ceLLS subkutant henviser naive mus modtager 1XPBS. Ca. 30 dage efter inokulering, milten høstes og behandles til enkelt-cellesuspensioner ved anvendelse af en celledissociering sigte. Splenocytter derefter røde blodlegemer (RBC) blev lyseret, og en aliquot af disse leukocytter farves med fluorochrom-konjugerede antistoffer mod Mac-1 og Gr-1 immunofænotype MDSC procentdele anvendelse af flowcytometri. I et parallelt eksperiment hele leukocytter fra naive mus farvet med fluorescenskonjugerede Gr-1-antistoffer og inkuberet med PE-mikrokugler og positivt selekteret ved hjælp af en automatiseret magnetisk aktiveret cellesortering (autoMACS) Pro Separator. Dernæst bliver en portion af Gr-1 + leukocytter farvet med Mac-1-antistoffer til at identificere forøgelse MDSC procentdele anvendelse af flowcytometri. Dag er disse GR1 + berigede leukocytter er klar til FACS-sortering af MDSC skal anvendes i komparative analyser (naive vs tumorbærende) i in vivo og in vitro

Protocol

Før start, forberede følgende løsninger:

3% Farvning Media (SM):

-3% Føtalt bovint serum (FBS) i 1X phosphatpuffersaltopløsning (PBS)

MACS Buffer (MB):

- 0,5% albumin fra bovint serum (BSA) i 1X PBS

1. Høst Milte fra mus

  1. Subkutant injektion 6-8 uger alder C57BL / 6 mus (Harlan) med 1,5 x 10 5 murine Panc02 celler suspenderet i 100 pi 1x PBS (tumor-bærende, TB). Kontrol mus (naive) modtager 100 ul 1XPBS.
  2. Ca. fire uger efter injektion, aflive mus ved carbondioxid-kvælning.
  3. Harvest milt fra mus ved stump dissektion med pincet og sakse vejes ved hjælp af en balance. Sted milte i separate, mærket 50 ml koniske rør indeholdende 1 x PBS.

2. Generer en enkelt celle Suspension af leukocytter fra milte

Alle procedurer bør udføres i et sterilt miljø under et biologisk sikkerhedsskab Hood og celler og antistoffer, der holdes på is.

  1. Samle celledissociering sigten ved at indsætte mesh sigte ind i åbningen af ​​koppen mod bunden. Derefter indsætte holderingen i gevind området med den slidsede opad og anvende ringen for at spænde holderingen, således at holde skærmen på plads. Anbring den samlede sigten i en petriskål indeholdende 10 ml 1 x PBS.
  2. Pool milt og anvendelsen glas pistil at formale milte mod mesh skærm celledissociering sien og ind i petriskålen. Gentages for hver behandlingsgruppe af mus.
  3. Filteret cellesuspension i en 50 ml konisk rør ved anvendelse af en 70 um cellefilter og en 5 ml serologisk pipette. Centrifugeres ved 12.000 rpm (250-300 xg) i 5 min.
  4. Fjerne supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml 1 x RBC-buffer pr milt. Afpipettér op og ned kraftigt. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Reaktionen standses ved tilsætning af 20 ml 1 x PBS. Afpipettér op og ned kraftigt. Centrifugeres ved 12.000 rpm (250-300 xg) i 5 min.
  5. Fjerne supernatanten og resuspender pelleten i 20 ml steril 1 x PBS. Afpipettér op og ned kraftigt.
  6. Tæl cellerne med trypan blåt og et hæmacytometer og resuspender i den ønskede koncentration i 3% SM, således at 50 pi er ækvivalent med 5x10 5-1x10 6 celler (1x10 7 celler / ml - 2x10 7 celler / ml).

3. Celleoverfladen farvning / immunofænotypebestemmelse af MDSC anvendelse af flowcytometri

  1. Mærke brøndene i en 96-brønds V bundpladen for kontrol-og forsøgsprøver og samlede farvning for kompensation kontroller (ingen farvning, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC og DAPI).
  2. Tilsættes 5x10 5-1x10 6 celler med 50 gl / brønd af splenocytter til deres respektive brønde i 96-brønds V-bundplade. Centrifugerplade ved 12.000 rpm (250-300 xg) i 5 minutter.
  3. Fremstille "Master Mix" (MM) af mus BD Fc Block (rotte anti-muse CD16/32 monoklonalt antistof) fortyndet i 3% SM, i et 1,5 ml mikrocentrifugerør på is. Som udgangspunkt anvende 1 ug Fc Block i 3% SM til et slutvolumen på 50 ul pr brønd.
  4. Forsigtigt fjernes supernatanten fra hver brønd i 96-brønds V-bundplade ved hurtigt at vende pladen igen og tilbage over en affaldsbeholder eller vask uden afbrydelse af cellepellets.
  5. Vortex, kortvarigt centrifugeres Fc Block mM for 5 sekunder, og der tilsættes 50 pi til alle pellets i 96-brønds V-bundplade. Bland godt ved forsigtigt at pipettere op og ned, hvorved prøverne i deres boringer. Inkuber plade i 15 minutter i mørke på is. Centrifugeres plade ved 12.000 rpm (250-300 xg) i 5 min.
  6. Forbered "Master Mix" (MM) af fluorokromkonjugerede antistoffer fortyndet i 3% SM i et 1,5 ml mikrocentrifugerør på is, mens prøverne inkuberes med Fc Block. Antistoffer bør titreresat bestemme optimale fortyndinger til farvning procedurer. Som udgangspunkt kombinere en 1:25 fortynding af Mac-1-FITC og 1:20 fortynding af Gr-1-APC i 3% SM til et slutvolumen på 50 ul pr brønd.
  7. Forsigtigt fjernes supernatanten fra hver brønd i 96-brønds V-bund, som tidligere beskrevet.
  8. Vortex, kortvarigt centrifugeres mM fluorescenskonjugerede farvning antistoffer i 5 sekunder, og der tilsættes 50 pi til kontrol og eksperimentelle pellets. Bland godt ved forsigtigt at pipettere op og ned. Til enkelt-pletten kompensation, tilsættes en 1:25 fortynding af Mac-1-FITC, 1:20 fortynding af Gr-1-APC og 75 ng / ml DAPI i 3% SM til et slutvolumen på 50 ul pr brønd deres respektive brønde. Tilsættes 50 pi 3% SM til ufarvede brønde (ingen farvning). Bland godt og inkuber cellerne i 96-brønds V-bund plade i 30 minutter i mørke på is.
  9. Etiket FACS-rør (5 ml, 12 mm x 75 mm polystyren rundbundede rør) for at svare til hver brønd i 96-brønds V-bundplade. Tilsæt 200 pi 3% SM til hver FACSrør.
  10. Centrifugeres plade ved 12.000 rpm (250-300 xg) i 5 minutter og fjern supernatanter. Vask pellets ved tilsætning af 100 pi 3% SM til hver pellet og bland godt ved forsigtigt at pipettere op og ned. Centrifugeres plade ved 12.000 rpm (250-300 xg) i 5 min. Gentag vaske trin en gang mere.
  11. Forsigtigt fjernes supernatanten fra hver brønd i 96-brønds V-bund, som tidligere beskrevet. Resuspender hver pellet i 100 gl 3% SM og bland godt.
  12. Overfør 100 ul resuspenderede pellet fra hver brønd i 96-brønds V-bundplade med deres respektive mærket FACS-rør.
  13. Før flowcytometrianalyse, tilsættes 75 ng / ml DAPI at kontrollere og eksperimentelle prøver og DAPI enkelt plet erstatning kontrol.
  14. Udføre flowcytometrisk dataregistreringen MDSC procenter. Udføre kompensation ved hjælp af negative (ingen farvning kontrol) og de enkelte positive kontroller. Opret en dot-plot, der viser fremad (FSC) versus sidespredning (SSC) i log-skala, så leukocytpopulationer afinteresse, kan identificeres. Tegn en stor port på alle leukocytter, bortset fra rester og klumper med den laveste fremad og sidespredning. Fra denne forælder port, oprette en ny dot-plot, der viser SSC versus DAPI og porten på DAPI-(live) celler. Vælg denne nyligt kanaliserede befolkning og skabe en dot-plot, der viser Mac-1 versus Gr-1 og port på din dobbelt positive (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Magnetisk Berigelse af GR-1 + Leukocytter

  1. Alikvote 1x10 7 resterende ufarvede leukocytter til passende mærkede FACS-rør og centrifugeres ved 12.000 rpm (250-300 xg) i 5 minutter.
  2. Forberede mM Gr-1-PE-antistof i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Op til 10 7 celler, anvender en 1:10 fortynding af Gr-1-PE-antistof i 50 pi MB, per prøve. For større celleantal, opskalere volumener i overensstemmelse hermed. Kort fortalt centrifugeres i 5 sekunder, tilsættes til leukocytter i FACS-rør og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C i mørke. Tilsæt 2 ml MB til FACS-rør og centrifugeres ved 12.000 opm (250-300 xg) i 5 minutter og kassér supernatanten.
  3. Forberede MM af anti-PE mikroperlerne i en 1,5 ml mikrocentrifugerør. Op til 10 7 celler, anvender en 1:4-fortynding af anti-PE mikroperlerne i 200 pi MB, per prøve. For større celleantal, opskalere volumener i overensstemmelse hermed. Kort fortalt centrifugeres i 5 sekunder, tilsættes til leukocytter i FACS-rør og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C i mørke.
  4. Tilsæt 2 ml MB til FACS-rør og centrifugeres ved 12.000 opm (250-300 xg) i 5 minutter og kassér supernatanten. Resuspender pellet i 3 ml SB. Filtreres gennem et 70 um si i en ny, mærket 50 ml konisk rør.
  5. Forberede og Prime Auto MACS Pro Separator. Refill alle flasker med de relevante løsninger og tomme affaldet flaske, hvis det er nødvendigt. Tænd instrumentet og gennemgå status for væsketanke og kolonne (r) efter initialisering. Alle symboler skal være grøn. På menuen, vælg "Separation" fra den øverstemenulinjen efterfulgt af "Vask nu" fra den nederste menulinjen. Vælg "Skyl" fra pop-up option efterfulgt af "Run" for at starte grunding processen. Når priming-processen er fuldført, vil instrumentet så vise, at det er "Klar til Separation" under menuen Status.
  6. Vælge passende kølet rør stativ til rørstørrelser og anbringes 50 ml konisk rør med magnetisk mærkede celler i række A, 50 ml konisk rør for negativ fraktionsopsamling i række B og 15 ml konisk rør for positiv fraktionsopsamling i række C.
  7. Vælge "POSSEL_S" celleseparation for positiv selektion af mærkede målceller i følsomme tilstand fra prøver. Magnetisk mærkede målceller tilbageholdes på automater kolonne umærkede celler frigives i den negative fraktion opsamlingsrøret i række B. På automatiseret tilbagetrækning af magneten, vil de mærkede målceller frigives i den positive opsamlingsrøret i række C i røret rack.

+ berigede Leukocytter

  1. Beretter Gr-1 + og Gr-1 - fraktioner under anvendelse af trypan blåt og et hæmacytometer. Resuspender celler i den ønskede koncentration i 3% farvning medium, således at 50 ul svarer til 5x10 5-1x10 6 celler (1x10 7 celler / ml - 2x10 7 celler / ml) og overføres 50 pi til tilsvarende mærkede FACS-rør.
  2. Fremstilling af en MM med Mac-1 alene, ved en 1:25 fortynding i 3% SM til et slutvolumen på 50 pi per prøve. Farves cellerne og fremstilling af en enkelt plet kompensation af Gr-PE, Mac-1 FITC og DAPI til flowcytometri-analyse. Tilsæt 200 pi 3% SM og DAPI levedygtighed farvestof som tidligere beskrevet.
  3. Udfør flowcytometrisk dataopsamling til at bestemme Gr-1 + og Gr-1 - procenter, og også at sammenligne MDSC procenter præ-og post-autoMACS berigelse.

6. Repræsentative resultater

Her viser vi r epresentative resultater for autoMACS berigelse af Gr-1 + leukocytter fra poolet, naive miltene for senere FACS-sortering af MDSC (figur 1). 1x10 6 naive leukocytter blev farvet med Mac-1-FITC og Gr-1-APC-antistoffer for at identificere MDSC procentdele ved hjælp af en BD LSRII instrument, før autoMACS sortering. 1x10 7 naive leukocytter blev derefter farvet med anti-Gr-1-PE-antistoffer, og PE-mikroperler til berigelse af Gr-1 + leukocytter med en autoMACS Pro Separator. Post-autoMACS berigelse, Gr-1 procenter i Gr-1 + og Gr-1 - opsamlede fraktioner blev vurderet ved anvendelse af flowcytometri. 1x10 6 Gr-1 + leukocytter blev fjernet og farvet med Mac-1-FITC-antistof til at analysere og sammenligne MDSC procentdele af beriget, fælles naive leukocytter til ikke-berigede poolede tumorbærende leukocytter ved flowcytometri.

fig1.jpg "/>
Figur 1. AutoMACS berigelse af naive Gr-1 + leukocytter til MDSC FACS-sortering. Miltene blev høstet fra pankreatiske tumorbærende og naive mus og forarbejdes til en enkelt-cellesuspensioner. Flowcytometrianalyse af naive leukocytter overflade farvet med Mac-1 og Gr-1 fluorescens-konjugerede antistoffer, før autoMACS berigelse (A). Flowcytometrianalyse af Gr-1 + (B) og Gr-1 - (C) fraktioner efter autoMACS berigelse af Gr-1 +-celler fra puljede naive leuckocytes farvet med Gr-1-PE-antistoffer og anti-PE-mikroperler. Flowcytometrianalyse af MDSC og Gr-1 + procentdele efter autoMACS berigelse af Gr-1 +-celler fra puljede naive leukocytter (D) sammenlignet med ikke-berigede puljede leukocytter fra tumorbærende mus (e) (naive mus, n = 5 ; tumor-bærende mus, n = 3). MDSC og Gr-1 procentsatser er gated i de repræsentative kontur plots og histogrammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette er en detaljeret metode til behandling og immunophentyping MDSC befolkninger, der gælder for forskellige lymfoide væv fra forskellige dyremodeller. Især kan autoMACS berigelse kan anvendes til isolering af forskellige leukocytpopulationer, herunder Gr-1 udtømning af splenocytter 4, oprensning af myeloide delmængder af splenocytter og lymfeknuder 5, isolering af knoglemarv neutrofiler 14 og oprensning af CD8 + T-celler fra milt og lymfeknuder 15. Uanset cellepopulationen af ​​interesse, generere en enkelt-cellesuspensioner af leukocytter fra de ønskede lymfoide væv kræves for optimal overfladefarvning, flowcytometri-analyse, autoMACS berigelse og FACS-sortering. I denne protokol, brugte vi mekanisk dissociation at skabe en enkelt celle suspension af leukocytter. Men ved hjælp af fordøjelse såsom collagenase D er også en passende alternativ til denne protokol for at øgeudbyttet af leukocytter fra milte eller andre lymfoide organer 5.

Flowcytometri er en vigtig metode til immunofænotypebestemmelse leukocytter. Derfor passende forberedelse til flowcytometri og berigelse kræver også anvendelse af passende buffere til cellesuspensionen og fortynding af antistofreagenser. Mange protokoller skiftevis FBS og BSA til fremstilling farvning medier og MACS puffer. Imidlertid er disse reagenser er også kommercielt tilgængelige fra firmaer, såsom eBioscience, BD Pharmingen og Miltenyi Biotec. Som forklaret af Miltenyi Biotec og eBioscience både BSA og FBS forhindre ikke-specifik binding ved farvning leukocytter med fluorochrom-konjugerede antistoffer. Mere vigtigt lave procentdele af disse dyr serumproteiner opretholde levedygtigheden og forhindre sammenklumpning af leukocytter 16. Men fra vores erfaring, arbejder BSA bedre for optimal farvning og bedre opløsning til autoMACS berigelse end FBS, og det anbefalesderet i den beskrevne protokol.

I denne protokol, kendetegnet vi murine MDSC ved hjælp CD11b-FITC og Gr-1-APC fluorescens-konjugerede antistoffer og flowcytometri. Det er vigtigt at titrere disse antistoffer forud for anvendelse til at reducere høj baggrund fluorescensfarvning at forhindre ikke-optimale resultater. Hertil kommer, ved valg af antistoffer til flerfarvet flowcytometrianalyse mulige spektral overlapning af fluorokromer er også en kritisk faktor, der skal overvejes 17,18. Derfor kompensation styrer i form af en enkelt farve pletter for hver fluorochome-konjugeret antistof renter eller erstatning perler, kan korrigere for udstedelser af spektral overlapning 18. En anden vigtig overvejelse for nøjagtige flowcytometri resultater er anvendelsen af ​​levedygtighed farvestoffer. Døde celler kan ikke-specifikt binder til antistoffer, hvilket skaber falske positive resultater 19. I denne protokol, bruger vi nukleinsyre pletten, DAPI som en levedygtighed farvestof tiludelukke døde celler fra vores analyser, som det bedst supplerer panel af fluorokromkonjugerede antistoffer anvendes med minimal spektral overlapning. Imidlertid kan andre levedygtighed farvestoffer, såsom 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) og propidiumiodid (PI) anvendes med de beskrevne farvningsmetoder afhængigt panel af anvendte antistoffer. I øjeblikket er der også et antal kan begrænses døde celler pletter tilgængelige som tillader farvede celler at blive fastgjort og permeabiliseres uden at miste evnen til at skelne levedygtighed (Invitrogen). Samlet set andre farvningsteknikker er også vigtige til nøjagtig flowcytometrianalyse. For eksempel i denne protokol anvendelse af 96-brønds V-bundformede plader tillader små koncentrerede mængder af celler og reagenser, der skal anvendes til analyse af MDSC og leukocyt procentdele hjælp af flowcytometri. Brugen af ​​Master Mix (MM) tilgang er også en væsentlig teknik for lige immunfluorescens mærkning af leukocytter i små mængder ved hjælp af enten 96-brønds V-bund plATES eller FACS rør. Disse teknikker reducerer risikoen for krydskontaminering af prøver, opretholde sterile antistoffer og reducere mængden af ​​anvendte reagenser og antistoffer.

Den autoMACS Pro Separator giver mulighed for effektiv og automatiseret isolering af cellepopulationer fra flere prøver, i enhver art. I denne protokol, er indirekte magnetisk mærkning af leukocytter ved hjælp af Gr-1-PE antistoffer og magnetiske PE mikrokugler anvendes til autoMACS berigelse af Gr-1 + leukocytter. Denne procedure kan modificeres til autoMACS separation under anvendelse Mikroperler andre fluorokromkonjugerede, biotinylerede og ukonjugeret primære antistoffer til berigelse af forskellige cellepopulationer 20. I denne procedure, har vi anbefaler anvendelse af PE-konjugerede antistoffer og anti-PE-mikroperler i modsætning til FITC for eksempel som PE molekyle siges at have flere bindingssteder, hvilket resulterer i stærkere og mere magnetisk mærkning (Miltenyi Biotec ). En anden pULIGE modifikation af denne protokol er anvendelsen af ​​direkte magnetisk mærkning, som der er en bred vifte af MLA Mikroperler til isolering af human, mus og rotte leukocytter (Miltenyi Biotec). Imidlertid indirekte magnetisk mærkning under anvendelse af en fluorokromkonjugerede primære antistof tillader flowcytometri evaluering af beriget eller depleteret leukocyt fraktioner uden behov for yderligere farvning. Der er også en række Macs Separatorer tilgængelig, men autoMACS Pro Separator System er fordelagtigt, da det giver mulighed for høj hastighed, automatisk sortering af op til seks prøver til skånsom selektion af meget levedygtige leukocytter, i forhold til manuelle MLA separatorer. Men manuelle MLA Separatorer er egnede alternativer til autoMACS Pro Separator, hvis de er tilgængelige. For yderligere at berige naive Gr-1 + leukocytter, en potentiel ændring til denne protokol ville være at igen køre positivt opsamlede fraktion med en ny autoMACS kolonne på autoMACS Pro Separator. Enrichmentaf Gr-1 + tumor-bærende leukocytter vha. autoMACS Pro Separator anbefales ikke i denne protokol, da dette resulterer i en betydelig reduktion i inddrivelse af Gr-1-fraktioner som disse celler har tendens til at holde sig til de kolonner under berigelse i forhold til naive leukocytter . Derfor denne protokol anbefaler på det kraftigste at samle tumor-bærende leukocytter for efterfølgende FACS sortering af levedygtige MDSC.

Præ-beriget, samlet naive leukocytter og poolet tumorbærende leukocytter kan anvendes til fremtidige anvendelser såsom lav hastighed FACS-sortering til isolering af MDSC populationer. Denne protokol er specielt udformet til at omgå trivielle og rettidig FACS-sortering af MDSC fra naive mus, som er på grund af signifikant lavere procentdele af MDSC. AutoMACS berigelse af Gr-1 + leukocytter fra naive mus derefter muliggør hurtige, bekvem og effektiv FACS-sortering af levedygtige og funktionelle MDSC for deres anvendelse in vivo ogin vitro-forsøg. Direkte sortering af ydmyge udtrykte cellepopulationer som naive MDSC er en meget ineffektiv proces med lange sortere gange, høje omkostninger og reduceret celle genopretning og levedygtighed. Fremstilling og autoMACS berigelse af Gr-1 + leukocytter fra naive mus tager cirka 45 minutter og forøger MDSC procentdele er større end 4 gange (figur 1). Dette berigelse reducerer tiden for FACS-sortering fra cirka 12 timer for ikke-berigede leukocytter til 20-30 minutter for isolering af mindst 1x10 6 levedygtige beriget MDSC fra poolede naive leukocytter. Imidlertid FACS-sortering af levedygtige MDSC fra ikke-berigede puljede leukocytter fra tumorbærende mus vil kræve mindre tid på grund af en forøget forekomst af MDSC procentdele som reaktion på tumorbyrde. Det er vigtigt at bemærke, at sorterede MDSC og andre leukocytter kan derefter anvendes i begge funktionelle assays, såsom blandede leukocyt reaktioner (MLR) og in vivo adoptiv overførsel eksperimenter 21 såvel som i ikke-funktionelle assays, herunder QRT-PCR 22, Western Blot 23 og cytospin / mikroskopi analyser 14. Generelt kan denne protokol modificeres til immunofænotypebestemmelse og berigelse af immunosuppressive og andre leukocytter fra lymfevæv eller perifert blod fra mus, rotte og mennesker, der skal anvendes i et utal af in vivo og in vitro assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Vi anerkender USF Flowcytometri Core Facility. Vi vil gerne takke Dr. Denise Cooper til deling af ressourcer. Vi vil også gerne takke Maya Cohen, Laura Pendleton og Diana Latour for deres bistand til at oprette og filme i denne video. NN støttet af NSF FG-LSAMP Bridge til Doktorgrad Fellowship HRD # 0929435. Dette arbejde blev finansieret af American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center tildelt TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics