Preparación de células mieloides supresoras derivadas (MDSC) de ingenuo y de páncreas ratones portadores del tumor mediante citometría de flujo magnético y automatizado de células activadas clasificación (AutoMACS)

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Summary

Este es un método rápido y completo de inmunofenotipo mieloide derivados de células supresoras (MDSC) y enriquecedora Gr-1

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Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

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Abstract

MDSC son una población heterogénea de los macrófagos, células dendríticas inmaduras y granulocitos que se acumulan en los órganos linfoides en condiciones patológicas, incluyendo la infección parasitaria, inflamación, estrés postraumático, la enfermedad de injerto contra huésped, la diabetes y el cáncer de 1-7. En ratones, MDSC expresa Mac-1 (CD11b) y Gr-1 (Ly6G y Ly6C) antígenos de superficie 7. Es importante señalar que MDSC se ha estudiado bien en varios portadores de tumores anfitriones donde son significativamente expandidas y reprimir anti-tumorales respuestas inmunes frente a las contrapartes no tratados previamente 7-10. Sin embargo, dependiendo de la condición patológica, hay diferentes subpoblaciones de MDSC con distintos mecanismos y objetivos de supresión 11,12. Por lo tanto, los métodos eficaces para aislar poblaciones viables MDSC son importantes para dilucidar sus diferentes mecanismos moleculares de supresión in vitro e in vivo.

Recientemente, el GHansah grupo ha informado de la expansión de MDSC en un modelo murino de cáncer de páncreas. El portador de tumor MDSC muestran una pérdida de la homeostasis y el aumento de la función supresora en comparación con el ingenuo MDSC 13. MDSC porcentajes son significativamente menores en los compartimentos linfoides de los ratones no tratados frente a un tumor-cojinete. Esta es una advertencia importante, que a menudo dificulta la precisión de estos análisis comparativos MDSC. Por lo tanto, enriquecer la Gr-1 + leucocitos de ratones no tratados previamente antes de la clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) mejora la pureza, la viabilidad y reduce significativamente el tiempo de ordenación. Sin embargo, el enriquecimiento de Gr-1 + leucocitos de ratones portadores de tumores es opcional ya que se encuentran en abundancia para la FACS rápidas de clasificación. Por lo tanto, en este protocolo, se describe un método muy eficaz de inmunofenotipo MDSC y enriquecer Gr-1 + leucocitos del bazo de los ratones no tratados previamente para ordenar MDSC de una manera oportuna. Ratones inmunocompetentes C57BL / 6 se inoculan con murino ce Panc02LLS por vía subcutánea, mientras que los ratones no tratados previamente recibirá 1XPBS. Aproximadamente 30 días después de la inoculación, el bazo se cosechan y se procesan en una sola célula suspensiones utilizando una celda de la disociación tamiz. A continuación se esplenocitos de glóbulos rojos (RBC) se lisaron y una alícuota de estos leucocitos se tiñen con un fluorocromo conjugado con anticuerpos contra la Mac-1 y Gr-1 a los porcentajes MDSC inmunofenotipo por citometría de flujo. En un experimento paralelo, los leucocitos de los ratones no tratados enteros están manchadas con fluorescentes conjugados con 1 gr de anticuerpos, se incubaron con el PE-MicroBeads y seleccionados de manera positiva con un sistema automatizado magnético de células activadas clasificación (autoMACS) Pro Separator. A continuación, una parte alícuota de Gr-1 + leucocitos se tiñen con Mac-1 anticuerpos para identificar el aumento en porcentajes MDSC utilizando citometría de flujo. Ahora bien, estos Gr1 + leucocitos enriquecidos están listos para la clasificación de MDSC FACS para ser utilizados en los análisis comparativos (ingenuo vs tumor cojinete-) in vivo e in vitro

Protocol

Antes de comenzar, preparar las siguientes soluciones:

3% de tinción Media (SM):

-3% Suero bovino fetal (FBS) en 1X tampón fosfato salino (PBS)

MACS búfer (MB):

- 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) en 1XPBS

1. El bazo de los ratones de cosecha

  1. Inyectar por vía subcutánea de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones (Harlan), con 1,5 x 10 5 células murinas Panc02 en 100 l de PBS 1x (portador de tumor, la tuberculosis). Los ratones de control (ingenuo) recibirá 100 1XPBS l.
  2. Aproximadamente 4 semanas después de la inyección, los ratones eutanasia por asfixia de dióxido de carbono.
  3. El bazo de los ratones de la cosecha de disección roma con pinzas y tijeras a continuación, pesar con una balanza. Coloque en el bazo por separado, con la etiqueta 50 tubos cónicos que contienen 1 x PBS.

2. Generar un Suspensio una sola célulan de los leucocitos a partir de bazos

Todos los procedimientos se debe realizar en un ambiente estéril bajo una campana de seguridad biológica y las células y los anticuerpos mantuvieron en hielo.

  1. Montar la disociación celular tamiz mediante la inserción de la pantalla de malla en la abertura de la copa hacia el fondo. Luego, inserte el anillo de retención en el área de la rosca con el lado ranurado y utilizar el llavero para apretar el anillo de retención, manteniendo así la pantalla en su lugar. Coloque el tamiz montado en una placa de Petri que contiene 10 ml de 1 x PBS.
  2. Con bazos y maja vidrio uso para moler bazos contra la pantalla de malla de la disociación celular tamiz y en la placa de Petri. Repetir para cada grupo de tratamiento de los ratones.
  3. Suspensión de células de filtro en un tubo cónico de 50 ml utilizando un colador 70 micras celular y una pipeta serológica de 5 ml. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 5 ml de una solución amortiguadora de lisis de glóbulos rojos por el bazo x. Pipetear arriba y hacia abajo con fuerza. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Parar la reacción añadiendo 20 ml de 1 x PBS. Pipetear arriba y hacia abajo con fuerza. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 ml de PBS estéril 1 x. Pipetear arriba y hacia abajo con fuerza.
  6. Contar células utilizando azul de tripano y un hemacitómetro y resuspende a una concentración deseada en el 3% SM de modo que 50 l es equivalente a 5x10 5-1x10 6 células (1x10 7 células / ml - 2x10 7 células / ml).

3. La tinción de la superficie celular / Inmunofenotipo de MDSC mediante citometría de flujo

  1. Etiquete los pocillos de una placa de fondo 96-V bien para el control y muestras experimentales y manchas individuales para los controles de compensación (no hay manchas, NS, Mac-1-FITC; Gr-1-APC y DAPI).
  2. Añadir 5x10 5-1x10 6 células equivalentes a 50 l / pocillo de esplenocitos a sus respectivos pozos en el 96-V-así placa inferior. Centrifugarplaca a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  3. Preparar "mezcla maestra" (MM) de ratón BD Fc Bloque (rata anti-ratón CD16/32 anticuerpo monoclonal) diluido en 3% SM, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo. Como punto de partida, utiliza 1 g Bloque Fc en 3% SM para un volumen final de 50 l, por pocillo.
  4. Retirar con cuidado el sobrenadante de cada pocillo de la 96-V-así placa inferior mediante la rápida inversión de la placa sobre y hacia atrás, sobre un contenedor de desechos o sumidero sin interrupción de los sedimentos celulares.
  5. Vortex, brevemente centrifugar MM Fc bloque durante 5 segundos y se añaden 50 l de todos los pellets en el 96-V-así placa inferior. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, dejando muestras en sus pozos. Incubar la placa durante 15 minutos en la oscuridad sobre el hielo. Centrifugar la placa a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  6. Preparar "Master Mix" (MM) de fluorocromo conjugado con anticuerpos diluidos en un 3% SM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo, mientras que las muestras se incuban con el bloque de Fc. Los anticuerpos se debe ajustarpara determinar las diluciones óptimas para la tinción de los procedimientos. Como punto de partida, se combinan una dilución 1:25 de Mac-1-FITC y 1:20 dilución de Gr-1-APC en 3% SM para un volumen final de 50 l, por pocillo de muestra.
  7. Retirar con cuidado el sobrenadante de cada pocillo de la 96-bien con fondo en V como se ha descrito anteriormente.
  8. Vortex, brevemente centrifugar MM de anticuerpos conjugados con tinción fluorescente de 5 segundos y se añaden 50 l para el control y pellets de experimentación. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Para una sola mancha compensaciones, añadir una dilución 1:25 de Mac-1-FITC, 1:20 dilución de Gr-1-APC y 75 ng / ml de DAPI, en 3% SM para un volumen final de 50 l por pocillo a sus respectivos pocillos. Añadir 50 l SM 3% de mancha así (no mancha). Mezclar bien e incubar las células en 96-y-V placa inferior durante 30 minutos en la oscuridad en hielo.
  9. FACS Label tubos (5 ml, 12 mm x 75 mm de poliestireno tubos de fondo redondo) que corresponden a cada pocillo en la placa de 96 pocillos con fondo en V. Añadir 200 l SM 3% a cada uno de FACStubo.
  10. Centrifugar la placa a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min y eliminar sobrenadantes. Lavar gránulos mediante la adición de 100 l SM 3% a cada sedimento y mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar la placa a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. Repita el paso de lavado, una vez más.
  11. Retirar con cuidado el sobrenadante de cada pocillo de la 96-bien con fondo en V como se ha descrito anteriormente. Resuspender cada sedimento en 100 l SM 3% y mezclar bien.
  12. Transferir 100 l precipitado resuspendido de cada pocillo de la 96-bien con fondo en V a su placa de tubo, respectivamente, etiquetados FACS.
  13. Antes de análisis de flujo de la citometría, añadir 75 ng / ml DAPI para el control y muestras experimentales y de control de DAPI sola mancha de compensación.
  14. Realizar la adquisición de citometría de flujo de datos de los porcentajes de MDSC. Lleve a cabo una compensación con el negativo (sin control de mancha) y los controles positivos individuales. Crear un gráfico de puntos que muestra la dispersión frontal (FSC) versus lateral (SSC) en escala logarítmica de forma que las poblaciones de leucocitos deinterés pueden ser identificados. Dibuja una puerta grande en todos los leucocitos, con exclusión de los desechos y grupos con menor avance y la dispersión lateral. Desde esta puerta principal, cree un gráfico de puntos que muestra nueva cooperación Sur-Sur en comparación con DAPI y la puerta de DAPI (en vivo) de las células. Seleccione esta población recién cerrada y crear un gráfico de puntos que muestra Mac-1 en comparación con Gr. 1-y la puerta de su doble positivo (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Enriquecimiento magnética de Gr-1 + leucocitos

  1. Alícuotas 1x10 7 restantes leucocitos teñidas en tubos debidamente etiquetados FACS y centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  2. Preparar MM de Gr-1-PE anticuerpo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para un máximo de 10 7 células, utilizar una dilución 1:10 de Gr-1-PE anticuerpo en 50 MB l, por muestra. Por el número de células mayores, aumentar el volumen en consecuencia. En pocas palabras centrifugar durante 5 segundos, se suman a los leucocitos en los tubos de FACS y se incuba durante 15 min a 4 ° C en la oscuridad. Añadir 2 ml de MB a los tubos de FACS, se centrifuga a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.
  3. Preparar MM de Anti-PE MicroBeads en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para un máximo de 10 7 células, use una dilución 1:4 de anti-PE MicroBeads en 200 MB l, por ejemplo. Por el número de células mayores, aumentar el volumen en consecuencia. En pocas palabras centrifugar durante 5 segundos, se suman a los leucocitos en los tubos de FACS y se incuba durante 15 min a 4 ° C en la oscuridad.
  4. Añadir 2 ml de MB a los tubos de FACS, se centrifuga a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 3 ml de SB. Filtrar a través de un colador 70 micras en un nuevo tubo, con la etiqueta 50 ml cónico.
  5. Preparar y el primer separador MACS Auto Pro. Recarga todas las botellas con las soluciones adecuadas y vaciar la botella de residuos, si es necesario. Encienda el instrumento y examinar el estado de los depósitos de fluidos y de la columna (s) después de la inicialización. Todos los símbolos deben ser de color verde. En el menú, seleccione "separación" de la parte superiorbarra de menú, seguido de "Lavar ahora" en la barra de menú inferior. Seleccione "Rinse" de la opción de pop-up, seguido de "Ejecutar" para iniciar el proceso de cebado. Una vez que el proceso de cebado se completa con éxito, el instrumento mostrará entonces que es "Listo para la Separación" en el menú de estado.
  6. Elija bastidor adecuada del tubo fría para tamaños de tubo y el lugar 50 ml tubo cónico con células marcadas magnéticamente en la fila A, 50 ml tubo cónico para la recogida de fracción negativa en la línea B y 15 ml tubo cónico para la recogida de la fracción positiva en la fila C.
  7. Seleccione la opción "POSSEL_S" programa de separación de células para la selección positiva de las células diana marcadas en el modo de sensibilidad de las muestras. Magnéticamente células diana marcadas son retenidos en la columna de autómatas; células no marcadas se liberan en el tubo de recogida de fracción negativa en B. En la fila retracción automática del imán, las células diana marcadas se libera en el tubo de recogida positivo en la fila C del tubo bastidor.

+ leucocitos enriquecidos

  1. Recuento de Gr-1 + y Gr-1 - Fracciones con azul de tripano y un hemacitómetro. Resuspender las células en la concentración deseada en el medio de la tinción de 3% en lo que el 50 l es equivalente a 5x10 5-1x10 6 células (1x10 7 células / ml - 2x10 7 células / ml) y transferir 50 l de tubos etiquetados correspondientemente FACS.
  2. Preparar un MM de Mac-1 solamente, a una dilución 1:25 en 3% SM para un volumen final de 50 l por muestra. Teñir las células individuales y preparar las compensaciones mancha de Gr-PE, Mac-1 FITC y DAPI para el análisis de citometría de flujo. Añadir 200 l 3% SM y colorante DAPI viabilidad como se ha descrito anteriormente.
  3. Realizar la adquisición de citometría de flujo de datos para determinar Gr-1 + y Gr-1 - porcentajes y también para comparar porcentajes MDSC enriquecimiento de pre-y post-autoMACS.

6. Los resultados representativos

Aquí se muestra r epresentante resultados para el enriquecimiento autoMACS de Gr-1 + leucocitos de agrupados, el bazo ingenuos para FACS posteriores de clasificación de la MDSC (Figura 1). 1x10 6 leucocitos ingenuos fueron teñidas con Mac-1-FITC y anticuerpos Gr-1-APC para identificar los porcentajes MDSC utilizando un instrumento BD LSRII, antes de la clasificación autoMACS. 1x10 7 leucocitos ingenuos fueron teñidas con anti-Gr-1-PE anticuerpos y de educación física de microesferas para el enriquecimiento de Gr-1 + leucocitos mediante un separador de autoMACS Pro. Post-autoMACS enriquecimiento, Gr-1 los porcentajes de Gr-1 + y Gr-1 - fracciones recogidas fueron evaluadas mediante citometría de flujo. 1x10 6 Gr-1 + leucocitos fueron removidos y se tiñeron con Mac-1-FITC para analizar y comparar los porcentajes de MDSC de enriquecimiento, se agruparon los leucocitos ingenuos que no enriquecido, se reunieron con tumores leucocitos por citometría de flujo.

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Figura 1. AutoMACS enriquecimiento de Naïve Gr-1 + leucocitos para FACS MDSC Clasificación. Los bazos se recogerá a partir de los ratones portadores de tumores de páncreas e ingenuo y se transforma en una sola célula suspensiones. El análisis de citometría de flujo de la superficie de los leucocitos ingenuo tiñeron con Mac-1 y Gr-1 anticuerpos fluorescentes conjugados, antes de enriquecimiento autoMACS (A). Análisis de flujo de la citometría de Gr-1 + (B) y Gr-1 - (C) las fracciones de post-autoMACS enriquecimiento de Gr-1 + en las células de los agrupados leuckocytes ingenuos manchadas de Gr-1-PE anticuerpos y microesferas de anti-PE. Análisis de flujo de la citometría de MDSC y Gr-1 + porcentajes post-autoMACS enriquecimiento de Gr-1 + en las células de leucocitos agrupados ingenuos (D) en comparación con los no enriquecidos leucocitos agrupados de ratones portadores de tumores (E) (los ratones no tratados previamente, n = 5 ; ratones portadores de tumores, n = 3). MDSC y los porcentajes de Gr-1 es cerrada en las parcelas representativas de contorno y los histogramas.

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Discussion

Este es un método detallado para el procesamiento y immunophentyping poblaciones MDSC que es aplicable a diferentes tejidos linfoides de varios modelos animales. En particular, el enriquecimiento autoMACS puede ser utilizado para el aislamiento de varias poblaciones de leucocitos, incluyendo Gr-1 agotamiento de esplenocitos 4, la purificación de subconjuntos mieloides de esplenocitos y ganglios linfáticos 5, el aislamiento de los neutrófilos de médula ósea 14 y purificación de células T CD8 + de bazo y ganglios linfáticos 15. Independientemente de la población de células de interés, generando una sola célula de suspensiones de leucocitos de los tejidos linfoides deseados se requiere para la tinción de superficie óptima, el análisis de citometría de flujo, el enriquecimiento autoMACS y clasificación FACS. En este protocolo, se utilizó la disociación mecánica para crear una única suspensión celular de los leucocitos. Sin embargo, utilizando digestión enzimática tales como la colagenasa D también es una alternativa adecuada a este protocolo para aumentarel rendimiento de los leucocitos de bazos u otros órganos linfoides 5.

La citometría de flujo es una técnica importante para los leucocitos inmunofenotipo. Por lo tanto, una preparación adecuada para la citometría de flujo y el enriquecimiento también requiere el uso de tampones apropiados para la suspensión celular y la dilución de los reactivos de anticuerpos. Muchos protocolos se alternan entre FBS y la BSA para la preparación de los medios de comunicación y el tampón de tinción MACS. Sin embargo, estos reactivos son también disponible en el mercado de empresas como eBioscience Pharmingen, BD y Miltenyi Biotec. Como se explica por Miltenyi Biotec y eBioscience, tanto de BSA y FBS prevenir la unión no específica cuando tinción leucocitos con fluorocromo-anticuerpos conjugados. Más importante aún, bajos porcentajes de estas proteínas del suero de los animales mantener la viabilidad y evitar la aglutinación de los leucocitos 16. Sin embargo, desde nuestra experiencia, la BSA trabaja mejor para la tinción óptima y una mejor resolución para el enriquecimiento autoMACS de SFB y se recoincrustada en el protocolo descrito.

En este protocolo, que se caracteriza MDSC murino utilizando CD11b-FITC y Gr-1-APC anticuerpos fluorescentes conjugados y citometría de flujo. Es imprescindible para valorar estos anticuerpos antes de su uso para reducir la coloración de alta fluorescencia de fondo para evitar que no óptimos resultados. Además, la hora de elegir anticuerpos para el análisis de citometría de flujo multicolor, posibles superposición espectral de los fluorocromos también es otro factor crítico para ser considerado 17,18. Por lo tanto, controla la compensación en forma de manchas de color único para cada anticuerpo conjugado con fluorochome de perlas de interés o la compensación, se puede corregir por cuestiones de superposición espectral 18. Otra consideración importante para obtener resultados precisos de citometría de flujo es el uso de colorantes de viabilidad. Las células muertas pueden no se unen específicamente a los anticuerpos, creando así resultados falsos positivos 19. En este protocolo, se utiliza el ácido nucleico mancha, como un tinte DAPI la viabilidad deexcluir las células muertas de nuestro análisis, ya que se complemente mejor con el panel de anticuerpos conjugados con fluorocromos utilizados con un mínimo de superposición espectral. Sin embargo, otros colorantes viabilidad tales como 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) y yoduro de propidio (PI) se pueden utilizar con los métodos de tinción descritos en función del panel de anticuerpos utilizados. Actualmente, también hay un número de fixable manchas de células muertas disponibles que permiten a las células teñidas que se fije y se permeabilizaron sin perder la capacidad de discriminar la viabilidad (Invitrogen). En general, las técnicas de tinción otros también son importantes para un análisis preciso citometría de flujo. Por ejemplo, en este protocolo, el uso de 96-y-V placas de fondo permite volúmenes pequeños, concentradas de las células y los reactivos para ser utilizados para el análisis de los porcentajes MDSC y leucocitos utilizando citometría de flujo. El uso de la mezcla maestra (MM) enfoque es también una técnica importante para el etiquetado igual inmunofluorescencia de leucocitos en pequeños volúmenes utilizando 96-bien con fondo en V plAtes o tubos FACS. Estas técnicas reducen el riesgo de contaminación cruzada de las muestras, mantener anticuerpos estériles y reducir la cantidad de reactivos y anticuerpos utilizados.

El separador de autoMACS Pro permite el aislamiento eficiente y automatizada de las poblaciones celulares de varias muestras, con cualquier especie. En este protocolo, el etiquetado indirecta magnético de leucocitos mediante Gr-1-PE anticuerpos y microesferas magnéticas PE se utiliza para el enriquecimiento autoMACS de Gr-1 + leucocitos. Este procedimiento puede ser modificado para la separación autoMACS utilizando MicroBeads a otros anticuerpos primarios fluorocromo-conjugado, y no conjugada con biotina para el enriquecimiento de diversas poblaciones de células 20. Sin embargo, en este procedimiento, le recomendamos utilizar PE-conjugado con anticuerpos anti-PE y microesferas, en contraposición a FITC por ejemplo, como la molécula de PE se dice que tiene múltiples sitios de unión, lo que resulta en el etiquetado más fuerte y mejor magnética (Miltenyi Biotec ). Otro pmodificación osibles a este protocolo es el uso de etiquetado magnético directo, ya que hay una amplia variedad de microperlas MACS para el aislamiento de humanos, de ratón y rata leucocitos (Miltenyi Biotec). Sin embargo, el etiquetado indirecta magnética usando un anticuerpo primario conjugado con fluorocromo permite la evaluación de citometría de flujo de fracciones enriquecidas o empobrecido de leucocitos sin la necesidad de tinción adicional. Hay también una variedad de separadores MACS disponibles, pero el sistema autoMACS Pro separador es ventajosa ya que permite una alta velocidad, la clasificación automática de hasta seis muestras para la selección suave de leucocitos altamente viables, en comparación con manuales separadores MACS. Sin embargo, los separadores manuales MACS son alternativas adecuadas para el separador de autoMACS Pro, si está disponible. Para enriquecer aún más ingenuos Gr-1 + leucocitos, una modificación potencial de este protocolo sería volver a ejecutar la fracción positiva recolectados a través de una nueva columna en el separador de autoMACS autoMACS Pro. Enriquecimientode Gr-1 + portadores de tumores leucocitos utilizando el separador autoMACS Pro no se recomienda en el presente Protocolo ya esto se traduce en una reducción significativa en la recuperación del GR-1 fracciones ya que estas células tienden a aferrarse a las columnas durante el enriquecimiento en comparación con los leucocitos no tratados previamente . Por lo tanto, este protocolo recomienda la agrupación de portadores de tumores de leucocitos FACS posteriores de clasificación de la MDSC viable.

Pre-enriquecido, agruparon leucocitos no tratados previamente y se agruparon portadores de tumores leucocitos puede utilizarse para aplicaciones futuras, tales como baja velocidad FACS de clasificación para el aislamiento de las poblaciones MDSC. Este protocolo está diseñado específicamente para eludir FACS tediosas y oportuna clasificación de MDSC de ratones no tratados previamente, lo cual es debido a porcentajes significativamente más bajos de MDSC. Enriquecimiento AutoMACS de Gr-1 + leucocitos de ratones no tratados a continuación permite FACS rápidas, conveniente y eficiente de clasificación de MDSC viable y funcional para su uso en in vivo eexperimentos in vitro. Clasificación directa de los humildes poblaciones de células expresadas como MDSC ingenuo es un proceso muy ineficiente con tiempos largos de ordenación, los altos costos y la recuperación celular y la viabilidad reducida. Preparación y enriquecimiento autoMACS de Gr-1 + leucocitos de ratones no tratados previamente toma aproximadamente 45 minutos y el aumento de porcentajes de MDSC de más de 4 veces (Figura 1). Este enriquecimiento se reduce el tiempo de la FACS clasificación de aproximadamente 12 horas para que no enriquecidos leucocitos de aproximadamente 20-30 minutos para el aislamiento de al menos 1x10 6 viables MDSC, enriquecida tras combinar los leucocitos no tratados previamente. Leucocitos Sin embargo, FACS clasificación de MDSC viables de los no-enriquecido, agrupados de ratones portadores de tumores requiere de menos tiempo debido a una mayor abundancia de los porcentajes de MDSC en respuesta a la carga tumoral. Es importante señalar que los leucocitos ordenados MDSC y otras se pueden utilizar en ambos ensayos funcionales, tales como reacciones de leucocitos mixtos (MLR) 21 in vivo experimentos de transferencia adoptiva, así como en la no-funcionales ensayos incluyendo QRT-PCR 22, 23 y Western Blot citospina / análisis de microscopía 14. En general, este protocolo puede ser modificado para inmunofenotipificación y el enriquecimiento de los leucocitos inmunosupresores y otro de los tejidos linfoides o sangre periférica de ratones, ratas y seres humanos para ser utilizados en una plétora de in vivo e in vitro.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Reconocemos el flujo de USF Citometría Core Facility. Nos gustaría agradecer a la Dra. Denise Cooper para compartir recursos. También nos gustaría dar las gracias a Maya Cohen, Laura Pendleton y Latour de Diana por su ayuda en la creación y la filmación de este video. NN con el apoyo de la NSF FG-LSAMP puente hacia el desarrollo de recursos humanos de Becas de Doctorado # 0929435. Este trabajo fue financiado por la Sociedad Americana del Cáncer Institucional de Becas de Investigación # Centro del Cáncer 93-032-13/Moffitt otorgado a TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

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References

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Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

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