एनजाइम स्थिरीकरण और स्थिरीकरण के लिए hydrophobic Nafion नमक संशोधित

Bioengineering

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Meredith, S., Xu, S., Meredith, M. T., Minteer, S. D. Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization. J. Vis. Exp. (65), e3949, doi:10.3791/3949 (2012).

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Abstract

Protocol

1. Nafion की चतुर्धातुक अमोनियम लवण के साथ संशोधन

  1. 5% w / v के लिए लगभग Nafion सख्ती निलंबन की एक बोतल हिला. 30 सेकंड है कि Nafion सुनिश्चित करने के समान समाधान में निलंबित कर दिया है.
  2. एक गिलास शीशी (शीशी मात्रा 2.5 मिलीग्राम से 10 एमएल हो सकता है) में अब फिर से निलंबित Nafion की 2 एमएल विंदुक.
  3. 3 गुना दाढ़ में alkyl अमोनियम ब्रोमाइड नमक (उपयुक्त जनता तालिका 1 में दिखाया जाता है) (Nafion बहुलक पर सल्फोनिक एसिड समूहों के सापेक्ष) अतिरिक्त उपाय और Nafion के 2 एमएल युक्त शीशी के लिए इस जोड़ें.
  4. 10-15 मिनट के लिए 1500 rpm पर शीशी भंवर.
  5. एक प्लास्टिक ट्रे वजन है कि लगभग उपायों में चिपचिपा समाधान डालो. 3 3 अंदर एक्स, और एक विंदुक उपयोग शीशी से वजन ट्रे किसी अवशिष्ट समाधान के हस्तांतरण.
  6. सॉल्वैंट्स नाव वजन का लुप्त हो जाना करने के लिए, वजन ट्रे के नीचे (फाई पर एक पीला / भूरे रंग, पारदर्शी फिल्म छोड़ने की अनुमति दें2 gure). विलायक वाष्पीकरण की दर ऐसी है कि यह सब लुप्त हो जाना करने के लिए विलायक के लिए अधिक से अधिक 6 घंटे लगते होना चाहिए. यदि विलायक evaporates भी तेजी से, एक सफेद, crusty सामग्री बजाय यह दर्शाता है कि बहुलक की micellar संरचना को नष्ट कर दिया गया है एक पारदर्शी फिल्म के रूप है, और आप इस प्रक्रिया को फिर से शुरू करनी चाहिए. यदि विलायक वाष्पीकरण भी धीमी है, एक de-humidifier के लिए आवश्यक हो, क्योंकि वाष्पीकरण की भी धीमी गति से आम तौर पर एक चिपचिपा, नारंगी जेल की ओर जाता है और आप प्रक्रिया फिर से शुरू करना चाहिए हो सकता है. 37 डिग्री सेल्सियस - विलायक वाष्पीकरण के लिए ठेठ तापमान पर्वतमाला 20 हैं सुखाने के लिए वास्तविक स्थिति के रिश्तेदार और कमरे में नमी और तापमान के एक समारोह कर रहे हैं, लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि सुखाने micelle संरचना को बनाए रखने के लिए धीमी गति से किया जा रहा है, लेकिन नहीं भी जेल गठन के लिए अनुमति देने के लिए धीमी गति से.
  7. भरने के 18M Ωcm de-ionized पानी (पानी की 10-20 एमएल), कवर के साथ नाव वजन, और 12-24 घंटे के लिए सोख अतिरिक्त alkyl अमोनियम ब्रोमाइड लवण और HBR को हटाने की अनुमति.
  8. ट्रे वजन करने के लिए खुला बैठ, जब तक बहुलक इस बिंदु पर पूरी तरह से सूखा है की अनुमति दें, बहुलक एक स्पष्ट और कुछ हद तक भंगुर प्लास्टिक की फिल्म होना चाहिए. फिर, अगर हवा बहुत नम है, एक de-humidifier एक समय पर ढंग में वाष्पीकरण को पूरा करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
  9. एक रंग का उपयोग करना, ध्यान वजन ट्रे से सूखे फिल्म को हटाने और यह एक साफ कांच की शीशी में स्थानांतरण.
  10. इथेनॉल के 2 एमएल और 3 चीनी मिट्टी के मिश्रण मोती, और 4 घंटे के लिए भंवर जोड़ें या जब तक बहुलक फिल्म पूरी तरह से फिर से निलंबित कर दिया.

2. एंजाइमों की TBAB - संशोधित गतिविधि Assays के लिए Nafion में स्थिरीकरण

  1. एक सूखी एंजाइम के लिए, एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में एंजाइम की 1-10 मिलीग्राम वजन, और एक 1-10 मिलीग्राम / एमएल एंजाइम समाधान बनाने के लिए 100 मिमी पीएच 7 फॉस्फेट बफर के 1 एमएल जोड़ने के लिए. के लिएएक एंजाइम है कि समाधान में है आर, bicinchoninic एसिड (बीसीए) 13 परख का उपयोग करने के लिए प्रोटीन की मात्रा का निर्धारण, और 100 मिमी फॉस्फेट बफर का एक उचित मात्रा में जोड़ने के लिए 1-10 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन एकाग्रता लाने. 1-10 मिलीग्राम / एमएल आमतौर पर 1-50 nanomoles / एमएल से मेल खाती है.
  2. 1 मिलीग्राम / एमएल एंजाइम समाधान की 120 μL करने के लिए, 10 सेकंड के लिए alkyl Nafion अमोनियम संशोधित समाधान के 60 μL, और भंवर जोड़ने. (यह मिश्रण प्रतिकृति की बड़ी संख्या के लिए किया जा पहुंचा सकते हैं 2:01 पर एंजाइम को बहुलक समाधान अनुपात रखें.)
  3. विंदुक 3 अलग 1 सेमी 2 cuvettes के तल में समाधान / एंजाइम बहुलक के 60 μL, और रात भर सूखी अनुमति देते हैं.

3. स्थिर NAD पर निर्भर डिहाइड्रोजनेज एनजाइम की परख

  1. क्युवेट करने के लिए, 50 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट (8.8 पीएच) के 1.3 एमएल, 15 मिमी NAD (नया) तैयार की 1.5 एमएल, और 0.1 एमएल पानी जोड़ें.
  2. यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (यानी ThermoScientific Evolut में क्युवेट प्लेसआयन 260 जैव और थर्मो SPECTRONIC 20 Genesys) 340 एनएम के तरंग दैर्ध्य के लिए निर्धारित किया है.
  3. स्पेक्ट्रोमीटर शून्य, और फिर 0.1 एमएल इथेनॉल जोड़ें. धीरे समाधान pipetting ऊपर और नीचे 5 बार अभिकर्मकों मिश्रण. एक रिक्त के लिए, अतिरिक्त पानी की 0.1 एमएल बजाय इथेनॉल के 0.1 एमएल का उपयोग करें.
  4. 5 मिनट पर 340 एनएम absorbance के रिकार्ड के बाद अभिकर्मकों क्युवेट और 20 मिनट के बाद जोड़ा गया था. प्लॉट दो डेटा बिंदुओं के लिए एक ढाल है कि गतिविधि गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

4. स्थिर PQQ निर्भर Dehydrogenases की परख

  1. क्युवेट करने के लिए, सोडियम फॉस्फेट की 1.5 एमएल (7.3 पीएच) और 600 माइक्रोन पीएमएस के 200 μL जोड़ें.
  2. एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 600 एनएम के तरंग दैर्ध्य के लिए सेट में क्युवेट प्लेस और फिर शून्य स्पेक्ट्रोमीटर.
  3. 700 μL DCIP 100 μL और ब्याज की सब्सट्रेट (इथेनॉल, एसीटैल्डिहाइड, ग्लिसरॉल, ग्लूकोज, या glyceraldehyde) 200 μL जोड़ें, और मिश्रण धीरे solut pipetting द्वारा अभिकर्मकोंआयन और 5 बार नीचे. एक रिक्त के लिए, पानी के 200 μL के बजाय हित के सब्सट्रेट का उपयोग करें.
  4. 5 मिनट में 600 एनएम absorbance के रिकार्ड के बाद अभिकर्मकों क्युवेट और 20 मिनट के बाद जोड़ा गया था.

5. स्थिर ग्लूकोज oxidase की परख

  1. क्युवेट करने के लिए, एक 0.2 एम एसिड पी hydroxybenzoic, 0.02% (w / v) सोडियम azide, 128 यू peroxidase, 0.3 4 - aminoantipyrine मिमी एम 1, पोटेशियम फॉस्फेट, और 50 मिमी ग्लूकोज युक्त समाधान के 2.0 एमएल जोड़ें. Pipetting और नीचे 5 बार से समाधान का मिश्रण.
  2. यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 510 एनएम के तरंग दैर्ध्य के लिए सेट में क्युवेट रखें.
  3. 5 मिनट पर 510 एनएम absorbance के रिकार्ड के बाद अभिकर्मकों और 20 मिनट के बाद फिर से क्युवेट करने के लिए जोड़ा गया था.

6. प्रतिनिधि परिणाम

संशोधित Nafion बहुलक का micellar संरचना मूल नमक / बहुलक फिल्म के सह से casted भी एफएएस सुखाने के द्वारा बाधित किया जा सकता हैटी 2. चित्रा एक मिश्रण / नमक बहुलक है कि सही ढंग से एक पारदर्शी, हल्के भूरे रंग फिल्म में जिसके परिणामस्वरूप में सूख गया है दिखाता है. एक फिल्म है कि dries बहुलक की अपारदर्शी, सफेद गुच्छे तथ्य यह है कि सुखाने की प्रक्रिया micellar संरचना को नष्ट कर सकते हैं के कारण में भी तेजी से परिणाम कर सकते हैं.

एक बार संशोधित Nafion बहुलक और एंजाइम मिलाया गया है और एक क्युवेट के तल पर सह डाली, enzymatic गतिविधि assays बहुलक फिल्म के भीतर एंजाइम की स्थिरता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तालिकाएँ दो डिहाइड्रोजनेज एंजाइमों के 2-4 शो परख परिणाम और ग्लूकोज oxidase विभिन्न संशोधित Nafion फिल्मों में immobilized, क्रमशः. नोट एंजाइमों कि बफर समाधान में एंजाइमों बनाम स्थिर उच्च गतिविधि दिखा रहा है कि संशोधित Nafion पॉलिमर वास्तव कुछ एंजाइमों (बुलाया superactivity) के गतिविधि में वृद्धि कर सकते हैं. अन्य एंजाइमों परिवहन सीमाओं कि उनके विशिष्ट गतिविधि में कमी जब उन्हें बहुलक में स्थिर है (यानी cellulases और amylases के, जिसका substrates के काफी बड़े बड़े अणुओं हैं).

चतुर्धातुक अमोनियम नमक का इस्तेमाल किया 3 गुना अधिक
T3A (tetrapropylammonium ब्रोमाइड) 32.37 मिलीग्राम / एमएल
TBAB (tetrabutylammonium ब्रोमाइड) 39.19 मिलीग्राम / एमएल
TPAB (tetrapentylammonium ब्रोमाइड) 46.01 मिलीग्राम / एमएल
TEHA (triethylhexylammonium ब्रोमाइड) 32.37 मिलीग्राम / एमएल
TMHA (trimethylhexylammonium ब्रोमाइड) 27.25 मिलीग्राम / एमएल
TMOA (trimethyloctylammonium ब्रोमाइड) 30.66 मिलीग्राम / एमएल
TMDA (trimethyldecylammonium ब्रोमाइड) 34.07 मिलीग्राम / एमएल
TMDDA (trimethyldodecylammonium ब्रोमाइड) 37.48 मिलीग्राम / एमएल
TMTDA (trimethyltetradecylammonium ब्रोमाइड)
TMHDA (trimethylhexadecylammonium ब्रोमाइड) 44.31 मिलीग्राम / एमएल
TMODA (trimethyloctadecylammonium ब्रोमाइड) 47.71 मिलीग्राम / एमएल

तालिका 1 है टेट्रा-alkyl अमोनियम लवण की मात्रा को Nafion बहुलक संशोधन के लिए उपयोग करने के लिए.

Nafion के प्रकार एंजाइम गतिविधि (यू / छ)
बफर (नहीं बहुलक) 16.63 ± 8.11
Nafion (un-mod.) 9.25 ± 2.21
TMTDA 3.23 ± 2.92
TBAB 3.93 ± 3.33
TMDDA 4.19 ± 1.04
TMOA 3.51 ± 1.11
TMDA 8.00 ± 4.53
TMHA 1.68 ± 1.39
TMHDA 4.83 ± 0.99
TMODA 10.45 ± 3.20

टेबल 2 NAD निर्भर ग्लूकोज डिहाइड्रोजनेज गतिविधि चयनित संशोधित Nafion पॉलिमर (ध्यान दें: स्थिर गतिविधि एंजाइम की प्रारंभिक विशिष्ट गतिविधि के एक समारोह है) में स्थिर.

Nafion के प्रकार एंजाइम गतिविधि (MU / छ)
बफर (नहीं बहुलक) 7.18 ± 0.51
Nafion (un-mod.) 70.1 ± 0.5
TMTDA 133 ± 6
TBAB 244 ± 4
TMDDA 221 ± 6
TMOA 1.78 ± 0.63
TMDA 206 ±5
TEHA 40.1 ± 50.6
TMHDA 0
TMODA 1.45 ± 0.06

टेबल 3 PQQ निर्भर ग्लूकोज डिहाइड्रोजनेज गतिविधि चयनित संशोधित Nafion पॉलिमर (ध्यान दें: स्थिर गतिविधि एंजाइम की प्रारंभिक विशिष्ट गतिविधि के एक समारोह है) में स्थिर.

Nafion के प्रकार एंजाइम गतिविधि (यू / छ)
बफर (नहीं बहुलक) 103.61 ± 3.15
Nafion (un-mod.) 19.93 ± 10.10
TMTDA 247.25 ± 12.49
TBAB 152.27 ± 5.29
TMDDA 262.05 ± 6.26
TMOA 129.18 ± 2.31 TMDA 141.23 ± 1.97
TMHA 131.75 ± 2.89
TMHDA 132.50 ± 1.18
TMODA 136.50 ± 0.96

. 4 टेबल प्रतिनिधि ग्लूकोज oxidase विशिष्ट गतिविधि चयनित संशोधित Nafion पॉलिमर (स्थिर गतिविधि एंजाइम की प्रारंभिक विशिष्ट गतिविधि के एक समारोह है ध्यान दें) में स्थिर है.

चित्रा 1
चित्रा 1 TBAB निगमन के Nafion बहुलक और एंजाइम स्थिरीकरण में बाद में उपयोग में योजनाबद्ध.

चित्रा 2
चित्रा 2 Nafion और TBAB की प्रारंभिक फिल्मों के सह - कलाकारों ऑप्टिकल तस्वीर. पैदावार एक पारदर्शी, हल्के भूरे बो कवर फिल्म सुखाने धीमावजन ट्रे की ttom.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nafion Sigma-Aldrich 70160
Tetra alkylammonium bromide salts Sigma-Aldrich n/a
Alcohol dehydrogenase Sigma-Aldrich A3263
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) Simga-Aldrich N7004
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich P8010
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625
2,6-Dichloroindophenol (DCIP) Sigma-Aldrich D1878
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141
4-Hydroxybenzoic acid Sigma-Aldrich 240141
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Peroxidase Sigma-Aldrich P8375
4-aminoantipyrine Sigma-Aldrich 06800
UV/Vis Spectrophotometer Thermo Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20
Vortex Genie
Analytical balance

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References

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Comments

1 Comment

  1. Hi, Xu.
    Would you like to provide me a copy of this video.
    I promise that the video will only be used by myself, and no share on Internet.
    Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Hudan C.
    June 3, 2013 - 4:16 AM

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