Гидрофобные Солт-модифицированный Nafion для иммобилизации ферментов и стабилизации

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

В этой статье описывается порядок синтеза гидрофобно модифицированные мембраны Nafion иммобилизации ферментов и как для иммобилизации белков и / или ферментов в мембране и проверить их конкретной деятельности.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Meredith, S., Xu, S., Meredith, M. T., Minteer, S. D. Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization. J. Vis. Exp. (65), e3949, doi:10.3791/3949 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

За последние десять лет, произошло множество приложений для иммобилизации ферментов и стабилизировалась в том числе биокатализа, биосенсоров, и биотопливо клеток. 1-3 В большинстве биоэлектрохимические приложений, ферментов или органеллы иммобилизованных на поверхности электрода с использованием определенного типа полимерной матрицы. Этот полимер леса должны иметь стабильную и ферменты позволяют поверхностным диффузии молекул и ионов в и из матрицы. Большинство полимеров, используемых для данного типа иммобилизации на основе полиаминов или многоатомные спирты - полимеры, которые имитируют природную среду ферменты, которые они воплощают и стабилизации ферментов через водород или ионной. Другой метод для стабилизации ферментов связано с использованием мицелл, содержащих гидрофобные области, которые могут инкапсулировать и стабилизации ферментов. 4,5 В частности, группа Minteer разработала мицеллярных полимер на основе коммерчески доступных Nafion. 6,7 NafionСам мицеллярных полимера, что позволяет каналу помощью диффузии протонов и другие мелкие катионы, но мицеллы и каналов крайне малы и полимер является очень кислым из-за сульфокислоты боковых цепей, что неблагоприятно для иммобилизации ферментов. Однако, когда Nafion смешивается с более гидрофобные алкильные соли аммония, такие как тетрабутиламмония бромид (TBAB), четвертичного аммония катионов замене протонов и стать счетчик ионов сульфонатных групп на стороне полимерные цепи (рис. 1). Это приводит к большим мицелл и каналов в полимер, который позволяет для распространения больших подложках и ионов, которые необходимы для ферментативной функции, такие как никотинамидадениндинуклеотида (NAD). Это изменение Nafion полимера был использован для иммобилизации различных типов ферментов, а также митохондрий для использования в биосенсоров и биотопливных элементов. 8-12 Эта статья описывает новую процедуру принятия этого микрофонаellar полимер иммобилизации ферментов мембраны, которая может стабилизировать ферментов. Синтез мицеллярной мембранной иммобилизации фермента, процедура для иммобилизации ферментов в мембране, а анализы для изучения ферментативных удельной активности иммобилизованного фермента приведены ниже.

Protocol

1. Модификация с Nafion соли четвертичного аммония

  1. Встряхните бутылку 5% вес / объем Nafion подвески энергично в течение ок. 30 секунд, чтобы Nafion приостановлена ​​равномерно в растворе.
  2. Пипетировать из 2 мл в настоящее время повторно приостановил Nafion в стеклянный флакон (флакон объемом может содержать от 2,5 мл до 10 мл).
  3. Измерьте 3-кратном молярном избытке (по отношению к сульфокислоты групп на Nafion полимер) алкильных соли бромида (соответствующей массы приведены в таблице 1), и добавить к этому флакон, содержащий 2 мл Nafion.
  4. Vortex флакон на 1500 оборотов в минуту в течение 10-15 минут.
  5. Вылейте вязкий раствор в полиэтиленовый весом лоток, который измеряет ок. 3 х 3 дюйма, а также использование пипетки для передачи остаточного раствора из флакона с весом лоток.
  6. Позвольте растворители испаряются из весить лодку, оставляя желтый / коричневый, прозрачная пленка на нижней весом лоток (Fiрисунке 2). Скорость испарения растворителя должна быть такой, что она занимает более 6 часов для всех растворитель испаряется. Если растворитель испаряется слишком быстро, белый, твердый материал образует вместо прозрачной пленке о том, что мицеллярной структуры полимера был разрушен, и необходимо повторно запустить процедуру. Если испарение растворителя слишком медленно, де-увлажнитель может быть необходимым, потому что слишком медленное испарение обычно приводит к липким, оранжевый гель, и вы должны возобновить процедуры. Типичный диапазон температуры для испарения растворителя на 20 - 37 ° C. Реальные условия для сушки зависят от относительной влажности и температуры в помещении, но важно, что сушка медленная поддерживать мицеллы структуры, но не слишком медленно, чтобы обеспечить образование геля.
  7. Заполните вес лодки с 18M Ωcm деионизированной водой (10-20 мл воды), накрыть крышкой и дать впитаться в течение 12-24 часов, чтобы удалить излишки алкил аммония бромид соли и HBr.
  8. Позвольте весом лоток сидеть обнаружены пока полимер полностью высохнет На данный момент, полимер должен быть четким и несколько хрупкие пленки. Опять же, если воздух очень влажный, де-увлажнитель может быть необходимо для завершения испарения в установленные сроки.
  9. С помощью шпателя тщательно удалить сухой пленки с весом лоток и передать его в чистый флакон стекло.
  10. Добавить 2 мл этанола и 3 керамических смешивания бисером, и вихрь в течение 4 часов или до полимерная пленка полностью повторно приостановлены.

2. Иммобилизации ферментов в TBAB-Modified Nafion на активность Анализы

  1. Для сухой фермент, отвешивать 1-10 мг фермента в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавьте 1 мл 100 мМ рН 7 фосфатный буфер, чтобы создать 1-10 мг / мл раствора фермента. ФоГ фермент, который находится в растворе, используйте bicinchoninic кислоты (BCA) анализ 13 до определения количества белка и добавить соответствующую сумму в 100 мМ фосфатного буфера довести концентрацию белка до 1-10 мг / мл. 1-10 мг / мл обычно соответствует 1-50 нмоль / мл.
  2. До 120 мкл 1 мг / мл раствора фермента, добавить 60 мкл алкил аммония модифицированный Nafion решение, и вихрь в течение 10 секунд. (Эта смесь может быть расширен для большого количества дубликатов. Держите фермента к раствор полимера соотношение 2:1).
  3. Внесите 60 мкл фермента / полимерный раствор в нижней части 3 отдельных 1 см 2 кювет, и дать высохнуть в течение ночи.

3. Анализ иммобилизованных НАД-зависимые дегидрогеназы ферментов

  1. В кювете, добавить 1,3 мл 50 мМ пирофосфат натрия (рН 8,8), 1,5 мл 15 мМ НАД (свежеприготовленный) и 0,1 мл воды.
  2. Поместите кювету в UV / Vis спектрофотометр (т.е. ThermoScientific Evolutион 260 Био и Thermo Spectronic Genesys 20) установлен в длине волны 340 нм.
  3. Обнулить спектрометр, а затем добавьте 0,1 мл этанола. Смешайте реагенты, осторожно пипеткой решение вверх и вниз в 5 раз. Для пустой, использовать 0,1 мл дополнительной воды вместо 0,1 мл этанола.
  4. Измерить абсорбцию при 340 нм в течение 5 минут после реактивы были добавлены в кювет и через 20 минут после. Сюжет в двух точках данных, чтобы получить наклон, который может быть использован для деятельности расчетов.

4. Анализ иммобилизованных PQQ-зависимых дегидрогеназ

  1. В кювете, добавить 1,5 мл фосфат натрия (рН 7,3) и 200 мкл 600 мкМ ПМС.
  2. Поместите кювету в UV / Vis спектрофотометр настроен на длину волны 600 нм, а затем нулю спектрометра.
  3. Добавить 100 мкл 700 мкл DCIP и 200 мкл субстрата интерес (этанола, ацетальдегида, глицерин, глюкоза, или глицеральдегид), а также смешивать реактивы, осторожно пипеткой Solutионных вверх и вниз в 5 раз. Для пустой, используйте 200 мкл воды вместо подложки интерес.
  4. Измерить абсорбцию при 600 нм в течение 5 минут после реактивы были добавлены в кювет и через 20 минут после.

5. Анализ иммобилизованных глюкозооксидазы

  1. В кювете, добавить 2,0 мл раствора, содержащего 0,2 М р-гидроксибензойной кислоты, 0,02% (вес / объем) азида натрия, 128 U пероксидаза, 0,3 мм 4-аминоантипирином, 1 М фосфата калия и 50 ммоль глюкозы. Смешайте раствор пипеткой вверх и вниз в 5 раз.
  2. Поместите кювету в UV / Vis спектрофотометр набор для длины волны 510 нм.
  3. Измерить абсорбцию при 510 нм в течение 5 минут после реактивы были добавлены в кювет и снова на 20 минут позже.

6. Представитель Результаты

Мицеллярной структуры модифицированного полимера Nafion может быть нарушена путем высушивания исходной соли / полимер со-литая пленка слишком ФАСтонн. На рисунке 2 показана соли / полимерной смеси, которая была правильно сушат в результате чего прозрачная, тонкая пленка коричневого цвета. Фильм, который высыхает слишком быстро, может привести к непрозрачные, белые хлопья полимеров в связи с тем, что процесс сушки можно уничтожить мицеллярной структуры.

После того, изменение Nafion полимеров и ферментов были смешаны и совместно бросили на дно кюветы, ферментативная активность анализов могут быть использованы для оценки стабильности ферментов в полимерную пленку. Таблицы 2-4 шоу анализ результатов двух ферментов дегидрогеназ и глюкозооксидазы иммобилизованных в различных фильмах изменение Nafion, соответственно. Обратите внимание, что высокая активность ферментов, иммобилизованных ферментов по сравнению с в буферном растворе, показали, что модифицированные полимеры Nafion действительно может повышать активность некоторых ферментов (называемых повышенная активность). Другие ферменты имеют транспортных ограничений, которые снижают их удельная активность при иммобилизации их в полимере (т.е. целлюлозы и амилазы, которые субстратов достаточно больших макромолекул).

Четвертичные соли аммония, используемый 3 раза превышение
T3A (тетрапропиламмония бромид) 32,37 мг / мл
TBAB (тетрабутиламмония бромид) 39,19 мг / мл
TPAB (tetrapentylammonium бромид) 46,01 мг / мл
TEHA (triethylhexylammonium бромид) 32,37 мг / мл
TMHA (trimethylhexylammonium бромид) 27,25 мг / мл
TMOA (trimethyloctylammonium бромид) 30,66 мг / мл
TMDA (trimethyldecylammonium бромид) 34,07 мг / мл
TMDDA (trimethyldodecylammonium бромид) 37,48 мг / мл
TMTDA (trimethyltetradecylammonium бромид)
TMHDA (trimethylhexadecylammonium бромид) 44,31 мг / мл
TMODA (trimethyloctadecylammonium бромид) 47,71 мг / мл

Таблица 1. Суммы, тетра-алкил соли аммония, используемый для Nafion модификации полимеров.

Тип Nafion Активность ферментов (U / г)
Буфер (без полимера) 16,63 ± 8,11
Nafion (un-mod.) 9,25 ± 2,21
TMTDA 3,23 ± 2,92
TBAB 3,93 ± 3,33
TMDDA 4,19 ± 1,04
TMOA 3,51 ± 1,11
TMDA 8,00 ± 4,53
TMHA 1,68 ± 1,39
TMHDA 4,83 ± 0,99
TMODA 10,45 ± 3,20

Таблица 2 NAD-зависимых дегидрогеназ глюкозы активность иммобилизованных в отдельных изменение Nafion полимеров (примечание: иммобилизованные деятельности является функцией начальной удельной активности фермента)..

Тип Nafion Активность ферментов (мЕд / г)
Буфер (без полимера) 7,18 ± 0,51
Nafion (un-mod.) 70,1 ± 0,5
TMTDA 133 ± 6
TBAB 244 ± 4
TMDDA 221 ± 6
TMOA 1,78 ± 0,63
TMDA 206 ±5
TEHA 40,1 ± 50,6
TMHDA 0
TMODA 1,45 ± 0,06

Таблица 3 PQQ-зависимых дегидрогеназ глюкозы активность иммобилизованных в отдельных изменение Nafion полимеров (примечание: иммобилизованные деятельности является функцией начальной удельной активности фермента)..

Тип Nafion Активность ферментов (U / г)
Буфер (без полимера) 103,61 ± 3,15
Nafion (un-mod.) 19,93 ± 10,10
TMTDA 247,25 ± 12,49
TBAB 152,27 ± 5,29
TMDDA 262,05 ± 6,26
TMOA 129,18 ± 2,31 TMDA 141,23 ± 1,97
TMHA 131,75 ± 2,89
TMHDA 132,50 ± 1,18
TMODA 136,50 ± 0,96

. Таблица 4 представителя глюкозооксидазы удельной активности иммобилизованных в отдельных изменение Nafion полимеров (примечание: иммобилизованные деятельности является функцией начальной удельной активности фермента).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема включения TBAB в Nafion полимера и последующего использования в иммобилизации ферментов.

Рисунок 2
Рисунок 2. Оптическая фотография начального со-литой пленки Nafion и TBAB. Медленная сушка дает прозрачный, светло-коричневая пленка охватывающих боttom из весом лоток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В описанной процедуре, тетра-алкил соли аммония используются для изменения коммерческой Nafion создать мицеллярных полимеров, которые могут быть использованы для иммобилизации и стабилизации ферментов. Анализы описанных в порядке, показывают, что полимер может быть использован для иммобилизации различных ферментов с высокой сохранение активности. Если фермент интерес имеет очень низкую активность или нечистым, более высокие концентрации могут потребоваться, и не должны влиять на процесс иммобилизации, если иммобилизации ферментов в концентрации более 10 мг / мл. Простота процедуры отделяет его от других методов иммобилизации ферментов в том, что нет синтетических шагов (например, синтеза полимеров или сшивки) обязательны для заполнения. Кроме того, эти шаги часто синтетических денатурации белков или резко снижают их активность. Концентрация белка в 1mg/mL просто предложил концентрации фермента высокой нагрузки. Более низкие концентрации фермента всегда может быть использован,но приведет к менее объемный каталитической активности. В теории, более высокие концентрации фермента, могут быть использованы до тех пор, как фермент растворяет.

Поскольку полимеры растворимы в низших алифатических спиртов, таких как метанол, этанол, пропанол и высокий процент алкоголя, должны присутствовать при смешении полимеров подвеска с ферментом. Во многих случаях это не является проблемой до тех пор, как этиловый спирт испаряется своевременно раз фермент-инкапсулированные фильма бросил. Однако, ограничение этого иммобилизация может произойти, если фермент вовсе не алкоголь, терпимыми и денатурации или выделений при добавлении изменение Nafion подвески. В редких случаях, ферменты осадок или денатурируют при смешивании с модифицированной подвеской Nafion, как правило, о том, что фермент стал денатурированным и не будет работать. Это позволило уменьшить содержание алкоголя в приостановлении ресуспендированием полимеров в спирт / вода смесей, Но ниже, алифатическими спиртами требуются значительные концентрации (> 25%) в ресуспендирования решение, так что этот метод иммобилизации не работает ферментов / фермент решения, которые не могут терпеть эти концентрации алкоголя.

Ферментативных тестов для каждого из полимеров с каждой из трех ферментов, показывают, что тенденции в относительной удельной активности по сравнению с ферментом в растворе функцию ферментной системы. Ожидается, что, поскольку каждый из ферментов разного размера, разных ИП, различные оптимальные рН, а также тот факт, что PQQ-зависимых дегидрогеназ глюкозы является мембранный белок связан и, следовательно, нуждается в очень различных химических микросреды, что цитозольного белков. Таким образом, гидрофобно модифицированных мицеллярных Nafion дает более мембраны хотел экологической стабилизации активного PQQ-зависимых дегидрогеназ глюкозы, чем буфера и показывает повышенную активность, которая редко встречается в иммобилизованных ферментов.ругой вопрос, чтобы рассмотреть, что полимерные мембраны сократить транспортные больших молекул, и, хотя глюкозы (субстрата для всех трех испытаний показано здесь) мала, коэнзима NAD необходимо распространять в и из мембраны для NAD-зависимых дегидрогеназ и при этом уменьшается наблюдается активность ферментов. В целом, важно отметить, что точная полимеров, необходимых для каждого фермента должен быть оптимизирован, из-за различия в размерах, заряд, оптимальный рН и транспорт субстрата / кофакторами для каждого из ферментных систем.

Кроме иммобилизованных анализов ферментов, основного приложения, которые были изучены с этого фермента метод иммобилизации является изготовление ферментативных биосенсоров и биотопливных элементов. Когда модифицированных полимеров Nafion содержащие инкапсулированных окислительно-восстановительных ферментов отлиты на поверхности электродов, bioelectrocatalytic процессы могут происходить в присутствии соответствующих субстратов и кофакторов, производя электрический ток соответственноonse. Bioanodes изготовлены с изменение Nafion были использованы в производстве биотоплива клетки, которые используют этанол, метанол, пирувата и глицерина, как описано во введении.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы признают, Управление военно-морских исследований, Соединенные сои совета и Национального научного фонда для финансирования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nafion Sigma-Aldrich 70160
Tetra alkylammonium bromide salts Sigma-Aldrich n/a
Alcohol dehydrogenase Sigma-Aldrich A3263
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) Simga-Aldrich N7004
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich P8010
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625
2,6-Dichloroindophenol (DCIP) Sigma-Aldrich D1878
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141
4-Hydroxybenzoic acid Sigma-Aldrich 240141
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Peroxidase Sigma-Aldrich P8375
4-aminoantipyrine Sigma-Aldrich 06800
UV/Vis Spectrophotometer Thermo Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20
Vortex Genie
Analytical balance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
  2. Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrolysis. Chem. Rev. 108, 2439-2461 (2008).
  3. Minteer, S. D., Liaw, B. Y., Cooney, M. J. Enzyme-Based Biofuel Cells. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 228-234 (2007).
  4. Callahan, J. W., Kosicki, G. W. The Effect of Lipid Micelles on Mitochondrial Malate Dehydrogenase. Canadian Journal of Biochemistry. 45, 839-851 (1967).
  5. Martinek, K. Modeling of the Membrane Environment of Enzymes: Superactivity of Laccase Entrapped into Surfactant Reversed Micelles in Organic Solvents. Biokhimiya. 53, 1013-1016 (1988).
  6. Moore, C. M., Akers, N. L., Hill, A. D., Johnson, Z. C., Minteer, S. D. Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides. Biomacromolecules. 5, 1241-1247 (2004).
  7. Schrenk, M. J., Villigram, R. E., Torrence, N. J., Brancato, S. J., Minteer, S. D. Effects of Mixture Casting Nafion with Quaternary Ammonium Bromide Salts on the Ion-Exchange Capacity and Mass Transport in the Membranes. J. Membr. Sci. 205, 3-10 (2002).
  8. Akers, N. L., Moore, C. M., Minteer, S. D. Development of Alcohol/O2 Biofuel Cells Using Salt-Extracted Tetrabutylammonium Bromide/Nafion Membranes to Immobilize Dehydrogenase Enzymes. Electrochim. Acta. 50, 2521-2525 (2005).
  9. Sokic-Lazic, D., Minteer, S. D. Citric Acid Cycle Biomimic on a Carbon Electrode. Biosens. Bioelectron. 24, 939-944 (2008).
  10. Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Complete Oxidation of Glycerol in an Enzymatic Biofuel Cell. Fuel Cells. 9, 63-69 (2009).
  11. Germain, M., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Nitroaromatic Actuation of Mitochondrial Bioelectrocatalysis for Self-Powered Explosive Sensors. J. Am. Chem. Soc. 130, 15272-15273 (2008).
  12. Addo, P. K., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Evaluating Enzyme Cascades for Methanol/Air Biofuel Cells Based On NAD+-Dependent Enzymes. Electroanalysis. 22, 807-812 (2010).
  13. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).

Comments

1 Comment

  1. Hi, Xu.
    Would you like to provide me a copy of this video.
    I promise that the video will only be used by myself, and no share on Internet.
    Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Hudan C.
    June 3, 2013 - 4:16 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics