La determinación de helmintos transmitidos por el suelo el estado de infección y estado físico de los niños en edad escolar

Published 8/22/2012
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Immunology and Infection

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Summary

La infección crónica por helmintos transmitidos por el suelo (STHS) provoca malabsorción, retraso del crecimiento y la emaciación en el niño en crecimiento. Por lo tanto, es plausible que estas infecciones también reducen la aptitud física de los niños. A continuación, visualizamos dos técnicas para el diagnóstico de STHS y la prueba de lanzadera de 20 metros de largo para la evaluación de la aptitud física de los niños.

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Yap, P., Fürst, T., Müller, I., Kriemler, S., Utzinger, J., Steinmann, P. Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children. J. Vis. Exp. (66), e3966, doi:10.3791/3966 (2012).

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Abstract

Helmintos transmitidos por el suelo (STH), las infecciones son comunes. De hecho, más de 1 mil millones de personas se ven afectadas, principalmente en el mundo en desarrollo, donde predomina la pobreza y los hábitos de higiene, abastecimiento de agua y el saneamiento son a menudo deficientes 1,2. Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, y las dos especies de anquilostomas, Ancylostoma duodenale y Necator americanus, son los más prevalentes STHS 3. La carga global estimada por anquilostomiasis, ascariasis, tricuriasis y es de 22,1, 10,5 y 6,4 millones ajustados por discapacidad años de vida (DALY), respectivamente 4. Por otra parte, se estima que 30 hasta 100 millones de personas están infectadas con Strongyloides stercoralis, la especie STH más desatendidas de importancia mundial que podría decirse que también causa un impacto considerable de salud pública 5,6. Múltiples especies infecciones (por ejemplo, STHS diferentes albergaron en un solo individuo) son comunes, y las infecciones han sido lin ked a la productividad baja y las perspectivas tanto económica de los países en desarrollo 1,3.

Para el diagnóstico de STHS comunes, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda la técnica de Kato-Katz 7,8, que es un método relativamente sencillo para determinar la prevalencia y la intensidad de estas infecciones. Se facilita la detección de huevos de parásitos que sujetos infectados pasan en sus heces.

Con respecto al diagnóstico de S.stercoralis, actualmente no hay disponible herramienta simple y precisa. La técnica de Baermann es el método más utilizado para el diagnóstico. El principio detrás de la técnica de Baermann es que activa las larvas migran S.stercoralis de un sistema de iluminación de la muestra fecal fresca como las larvas son fototácticas 9. Requiere materiales de laboratorio menos sofisticados y menos tiempo que los métodos de cultivo e inmunológicas 5.

t "> Las morbilidades asociadas con infecciones STH gama de síntomas agudos, pero comunes, como dolor abdominal, diarrea y prurito, síntomas crónicos, como la anemia, la desnutrición y la malnutrición y deterioro cognitivo 10. Dado que los síntomas suelen ser inespecíficos y sutil, que a menudo pasan desapercibidos, son considerados como una condición normal de los individuos afectados, o son tratados como síntomas de otras enfermedades que podrían ser más comunes en un entorno determinado. Por lo tanto, es concebible que la carga real de infecciones STH es subestimada por la evaluación herramientas de confiar en los autoproclamados signos y síntomas como suele ser el caso en las encuestas de población.

A finales de 1980 y principios de 1990, Stephenson y sus colegas destacaron la posibilidad de infecciones STH bajar la condición física de los niños de 6-12 años 11,12. Esta línea de investigación científico adquirido un nuevo impulso recientemente 13,14,15. El 20-metros (m) PCN se desarrolló und validado por Léger et al. 16 y se utiliza en todo el mundo para medir la capacidad aeróbica de los niños 17. La prueba es fácil de estandarizar y se puede realizar siempre que sea un curso de 20 metros de longitud, largo y plano y una fuente de audio están disponibles, lo que hace atractivo su uso en entornos con recursos limitados 13. Para facilitar y estandarizar los intentos de evaluar si las infecciones STH tiene un efecto sobre la condición física de los niños en edad escolar, se presentan metodologías para diagnosticar infecciones STH o aptitud física medida que son fáciles de ejecutar y, sin embargo, proporcionan resultados exactos y reproducibles. Esto ayudará a generar nuevas evidencias sobre el impacto en la salud de las infecciones STH.

Protocol

1. Kato-Katz Técnica

  1. Coloque un nivel de Kato-Katz plantilla con un agujero para la celebración de 41,7 miligramos (mg) de materia fecal en un portaobjetos de microscopio.
  2. Scoop 2-3 gramos (g) de una muestra fecal fresca sobre un trozo de papel de periódico o papel de aluminio, y presiona un trozo de alambre o malla de plástico en la parte superior a lo tamiz.
  3. Usando una espátula de plástico pequeño, raspe el material tamizado fuera de la malla y llenar completamente el orificio de la plantilla de Kato-Katz con él. Para eliminar el exceso de material fecal, nivelar el contenido del agujero con la espátula.
  4. Verticalmente eliminar la plantilla sin alterar el material fecal ahora adherirse al portaobjetos. La plantilla y la espátula se pueden lavar en agua con detergente, y volver a utilizar.
  5. Colocar un trozo de celofán, pre-empapados en solución verde malaquita glicerina durante al menos 24 horas (h), sobre la muestra fecal en el portaobjetos de microscopio.
  6. Para difundir el material fecal en una gota gruesa, presione suavemente un paño limpio microdiapositiva alcance contra el portaobjetos de la muestra, la distribución uniforme del material dentro de un círculo de un diámetro ligeramente menor que la anchura del portaobjetos de microscopio.
  7. Permitir la diapositiva para borrar por 30-60 minutos (min), durante los cuales las diapositivas deben mantenerse lejos de la luz solar directa. A continuación, examinar sistemáticamente la gota gruesa con un microscopio óptico (40-100x aumentos). Cuente el número de huevos STH y estratificar ellos por especie (es decir, A. lumbricoides, T.trichiura y anquilostoma). De nota, los huevos de helmintos otros (por ejemplo, Schistosoma mansoni) también pueden ser detectados por este método y se cuentan y se registran por separado.
  8. Para obtener una estimación normalizada de la intensidad de la infección, expresada convencionalmente como número de huevos por gramo de heces (EPG), multiplicar el recuento de huevos por 24 (24 x 41,7 mg ≈ 1 g).

2. Técnica de Baermann

  1. Establecer un soporte que puede sostener un vaso embudo y coloque un tubo de goma, cerró el ingenioclip de ha, a la parte inferior del embudo.
  2. Coloque un tamiz o una pieza de malla de alambre en forma de cono, en el embudo y la capa con un trozo de gasa médica.
  3. Llenar el embudo con agua del grifo y asegurarse de que la forma de organización no se escape.
  4. Scoop 20-30 g de heces frescas en el medio de la gasa médica y asegurarse de que está totalmente sumergida en agua. Añadir más agua si es necesario. Doble la gasa médica sobre la muestra.
  5. Desde abajo, brilla la luz artificial en el embudo durante 2 horas.
  6. Escurrir 50 mililitros (ml) de la parte inferior del agua en el embudo en un tubo de centrífuga por liberando suavemente la pinza en el tubo de goma.
  7. Centrifugar el agua recogida a 600 xg (fuerza centrífuga relativa) durante 5 min y verter cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Conserve las últimas gotas en el tubo.
  8. Se resuspende el sedimento y la pipeta de 2 gotas de la solución sobre un portaobjetos de microscopio y examinar la diapositivabajo un microscopio óptico (aumento de 40x para la detección y amplificación 100-400x para confirmación de especie). Primera etapa de larvas (L1) de S. stercoralis están vivos y se mueven activamente en el microscopio.

3. 20-m de traslado Test Run

  1. Medir un curso de 20 metros de longitud, plano y recto con la marca de conos.
  2. Ayude al participante en la prueba usar un monitor de ritmo cardíaco en la muñeca y el correspondiente transmisor en el pecho 18. Este equipo permite que el ritmo cardíaco del participante para ser medidos antes y después de la prueba y por lo tanto controla si el participante ha ejercido un esfuerzo máximo.
  3. Instruya a los participantes a ir y venir en el curso, siguiendo el ritmo de las señales de sonido pre-grabados que delimitan 20-m vueltas. A partir de una velocidad de funcionamiento de 8,5 kilómetros por hora (km / h), la frecuencia de las señales que indican 20-m aumenta los intervalos de un equivalente de 0,5 km / h cada min.
  4. Asegúrese de then el participante inicia un nuevo intervalo de 20-m cada vez que se hace sonar una señal y termina antes de que la señal llegue el siguiente.
  5. Detenga el participante si él / ella no puede seguir el ritmo de dos períodos consecutivos de 20-m intervalos.
  6. Registrar la más alta velocidad de funcionamiento indicado para el último intervalo el cual el participante completado totalmente, junto con la edad y el sexo del participante.
  7. Compruebe que la frecuencia cardíaca obtenidos al final de la prueba es la tasa de niño cardíaca máxima 19. Si la frecuencia cardíaca no se alcanza, el niño podría no haber ejercido un esfuerzo máximo, y por lo tanto la prueba debe repetirse.
  8. Estimar la capacidad aeróbica máxima (VO 2 máx) del participante, mediante una ecuación planteada por Léger y compañeros de trabajo: VO 2 max = 31.025 + 3.238 * Velocidad (km / h) - 3,248 * edad (en años) + 0,1536 * Velocidad (km / hr) * Edad (en años).

4. Los resultados representativos

En términos deDiagnóstico STH con la técnica de Kato-Katz, características únicas de los huevos de helmintos diferentes permiten la identificación de la mayoría de las especies 20. Los huevos de A. lumbricoides (aproximadamente 45-75 micrómetros (micras) de largo y 35-50 micras, Figura 1) tienen paredes más gruesas de concha que los huevos de T.trichiura (Figura 2) y anquilostomas (Figura 3). Un óvulo fertilizado de A. lumbricoides (Figura 1) tiene una capa externa albuminosa, que hace que se vea marrón dorado, mientras que un huevo no fertilizado carece de esta capa externa y es ligeramente alargado y grande en general. Los huevos de T.trichiura (aproximadamente 50 micras de largo y de ancho 22 m, Figura 2) son alargados y tienen distintos tapones polares. Anquilostomiasis huevos (aproximadamente 64-76 micras de largo y de ancho 36-40 micras, Figura 3), por otra parte, tienen una pared muy delgada, seguido por un claro anillo alrededor de un grupo denso de célulasen el centro del huevo.

S.stercoralis L 1 larvas (Figura 4) son de aproximadamente 180-380 micras de largo y tienen una cavidad bucal muy corto. Un primordio genital diferenciado (resaltado con una flecha azul en la Figura 4) puede ser observado y la cola de las larvas (resaltado con una flecha roja en la Figura 4) tiene un extremo afilado.

Como el verdadero impacto de las infecciones STH sobre la aptitud física de los niños es aún objeto de debate 13,14,15, no hay un resultado representativo de su impacto en este punto. Interpretación de 20-m resultados de la prueba de enlace que van puede realizarse de varias maneras. La condición física de los niños pueden ser comparados entre los sujetos infectados y no infectados, que son similares en cuanto a edad y sexo, otros problemas de salud potencialmente relevantes, nivel socioeconómico y hábitos culturales. Esto se puede hacer en un estudio transversal 13,14,15 donde laEstado de infección por geohelmintos y la aptitud física de los niños infectados y no infectados son evaluados en un momento particular. La fuerza de las pruebas será mayor cuando se sigue un diseño de ensayo controlado aleatorio en el que se evaluó la condición física de los niños en edad escolar antes y después del tratamiento antihelmíntico / placebo, lo que permite la evaluación tanto a corto como a largo plazo. Uno puede además tratar de identificar una posible relación dosis-respuesta entre la intensidad de las infecciones por geohelmintos y la aptitud física y comparar diferentes niveles de multiparasitismo con un buen estado físico. En el trabajo presentado por Yap y compañeros de trabajo-15, buen estado físico, según lo representado por el VO 2 máx, se encontró que se redujo significativamente en los niños infectados con T.trichiura comparación con los niños que no estaban infectadas con T.trichiura (Figura 5) .

Figura 1
Figu re 1. Imágenes microscópicas de los huevos de A. lumbricoides: fecundado (A) y no fertilizados (B) con aumento 500x. Barra de escala = 50 micras.

Figura 2
Figura 2. Imagen microscópica de un huevo T.trichiura bajo un aumento de 500x. Barra de escala = 50 m.

Figura 3
Figura 3. Imagen microscópica de un huevo de anquilostoma bajo un aumento de 500x. Barra de escala = 50 micras.

Figura 4
Figura 4. Imagen microscópica de un S.stercoralis L 1 larva bajo un aumento de 250x. Las flechas indican la cola (rojo) y el primordio genital (azul). Barra de escala = 100 micras.

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Figura 5. Gráfico que muestra el nivel de aptitud física de los niños infectados con T.trichiura en comparación con el nivel de aptitud física de los niños no infectados con T. trichiura.

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Discussion

Los tres protocolos descritos en este documento han sido probados y se ejecuta en la parte sur-occidental de la provincia de Yunnan, República Popular de China entre los miembros de la minoría étnica Bulang 21 y en diferentes partes de África 6,13,14.

Hay varias plantillas disponibles para la técnica de Kato-Katz. Cada agujero de tamaño distinto entregará una cantidad distinta de la materia fecal. Para el cálculo de las EPG, por lo que es necesario conocer la unidad de la plantilla, a fin de multiplicar el número contado de los huevos con el factor correcto para llegar a la estimación EPG. Además, cuando anquilostomiasis está presente en la comunidad bajo investigación, es esencial para leer los portaobjetos poco después de la preparación (después de un tiempo de compensación de 30 min, pero dentro de un tiempo de compensación máximo de 60 min). La razón principal es que a altas temperaturas, huevecillos se desintegran rápidamente 22. El tiempo entre la producción fecal por la igualdad estudioparticipante y el examen de las muestras también es importante como un intervalo de 3 horas o más pueden conducir a una disminución del 50% en la sensibilidad de la técnica de Kato-Katz para el diagnóstico anquilostomiasis 23. Por último, para mejorar la sensibilidad diagnóstica de la técnica de Kato-Katz, especialmente en áreas con infecciones STH baja intensidad, múltiples muestras de heces deben ser obtenidos de un participante y dobles o triples, Kato-Katz frotis gruesos deben ser preparados de cada muestra de materia fecal 7,24.

En cuanto a la técnica de Baermann, se debe tener cuidado al realizar el experimento en forma de larvas infectivas pueden estar presentes y, por tanto, los guantes deben ser usados. Aunque la técnica de Baermann muestra una sensibilidad mucho mayor que otras técnicas de concentración y es menos laborioso que los métodos de cultivo, hay lagunas importantes. Por ejemplo, una gran cantidad de material fecal fresco se requiere, que es un problema cuando los pacientes presenten pequeñas muestras fecales.Por otro lado, una muestra fecal grande, puede aumentar las posibilidades de detección de larvas en las infecciones de baja intensidad 9. Además, existe el riesgo de que las larvas de los nematodos, tales como el anquilostoma o Trichostrongylus spp., Podría estar presente, el examen microscópico por lo tanto exige una cuidadosa.

Hay formas directas e indirectas de medir el VO 2 máx para las evaluaciones de aptitud aeróbica. Protocolos directos requieren cintas de correr, cicloergómetro y otros equipos especializados y de gran volumen, que pueden medir las concentraciones volumétricas y gas del aire exhalado. Este enfoque no es factible en un entorno con recursos limitados rural en el mundo en desarrollo. En tales contextos, formas indirectas, como la prueba de lanzadera 20-m largo, son los métodos preferidos. Aunque los métodos indirectos no son tan precisos como los métodos directos, la prueba de lanzadera 20-m carrera establecido por Léger y compañeros de trabajo han demostrado una alta reproducibilidad (r = 0,89) y validity contra el consumo máximo de oxígeno en una cinta 16. Además, la relación investigador y el participante puede ser menor y varios participantes puede realizar la prueba, al mismo tiempo, el ahorro de recursos humanos y tiempo. Monitores del ritmo cardíaco no se utilizan normalmente en estos ensayos 13,16. Sin embargo, su uso permite al investigador para obtener información adicional sobre si el participante ha ejercido un esfuerzo máximo en la prueba. Por último, es aconsejable que los participantes hacer un ensayo de los intervalos de los primeros para que puedan familiarizarse con la velocidad de carrera y curso.

En conclusión, creemos que la combinación de los métodos antes mencionados, siguiendo protocolos estándar, permite la evaluación de la prevalencia e intensidad de las infecciones por geohelmintos y la aptitud física de los niños en edad escolar en una sólida base científica, sin embargo manera manejable y asequible.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Los autores agradecen a las comunidades de la provincia de Yunnan, República Popular de China y Agboville, Côte d'Ivoire, por su participación en los estudios descritos anteriormente. Estamos en deuda con los equipos de campo locales que colaboraron en las pruebas y la ejecución de los protocolos. Estamos especialmente agradecidos a los siguientes colegas de la Swiss Tropical y Salud Pública Instituto: Yvette Endriss para proporcionar las imágenes microscópicas, Hanspeter Martí y su equipo de apoyo de laboratorio y Krauth Stefanie por su ayuda durante la filmación de video. Por último, agradecemos a los dos árbitros anónimos por una serie de observaciones útiles.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Note: Materials in this list are generic and can be obtained from different sources.

Kato-Katz kit
[400 plastic templates with a hole of 6 millimeter (mm) (diameter) in a 1.5 mm thick template; 400 plastic spatula; a 20-m role of nylon screen of 80 mesh size; a 20-m role of hydrophilic cellophane, 34 μm thick.]
Vestergaard Frandsen Please note that the glycerin-malachite green solution is not included in this kit but can be bought from any chemical supplier.
Glass funnel [about 8 centimeter (cm) wide and 6 cm deep] The glass funnel for the Baermann technique should be able to hold about 60 mL of water. The size of the rubber hose and gauze is dependent on the type of glass funnel used.
Biological microscope Olympus CX21LED/CX21
Centrifuge Shanghai Medical Instruments Group 80 - 2T
Pre-recorded signals Bitworks Design Team Bleep Test Version 1.3.1 iPhone application
Heart rate monitor POLAR FT1 Watch and transmitter

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