टी lymphocytes की ओर प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की निर्देशित भेदभाव

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Immunology and Infection

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Summary

प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) से टी lymphocytes की पीढ़ी टी immunotherapy सेल आधारित के लिए भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करने का एक वैकल्पिक दृष्टिकोण देता है. विधि से पता चलता है कि या तो द्वारा का उपयोग

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Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

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Abstract

Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. / 7 SNL76 विकिरणित (/ 7 irSNL76) संस्कृति के लिए फीडर कोशिकाओं की तैयारी.
    SNL76 / 7 कोशिकाओं आम तौर पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मीडिया में रखा जाता है.
    1. तरल नाइट्रोजन से SNL76 / 7 कोशिकाओं को ठीक करने से पहले 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर, एक संस्कृति डिश या कुप्पी 0.1% 37 में जेलाटीन समाधान डिग्री सेल्सियस के साथ लेपित किया जाएगा.
    2. जब / 7 SNL76 कोशिकाओं confluency तक पहुँचते हैं, कोशिकाओं से trypsinized जाएगा, 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर centrifuged और ताजा मीडिया में resuspended.
    3. Resuspended / 7 SNL76 कोशिकाओं 5000 rads की एक खुराक के साथ एक 60 सह irradiator में विकिरणित किया जाएगा.
      वैकल्पिक दृष्टिकोण, माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEF) और mitomycin निष्क्रियता SNL76 / 7 कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है विकिरण की जगह ले सकता है.
    4. विकिरण के बाद, कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर centrifuged जाएगा और में 10% डाइमिथाइल (DMSO) sulfoxide FBS ठंड बफर, अशेष भाजक में resuspendedcryovials और भविष्य में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में संरक्षित.
  2. इन विट्रो में भेदभाव के लिए OP9 DL1 कोशिकाओं की तैयारी.
    OP9-DL1 कोशिकाओं आम तौर पर 20% FBS α न्यूनतम आवश्यक मध्यम (α-सदस्य) मीडिया में बनाए रखा जाएगा. एक 1:05 कमजोर पड़ने में जब वे confluency कोशिकाओं तक पहुँचने के लिए विभाजित किया जाएगा.
  3. E.G7 thymoma कोशिकाओं की तैयारी.
    E.G7 thymoma कोशिकाओं आम तौर पर 10% FBS Roswell पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) मध्यम -1640 मीडिया में बनाए रखा जाएगा. जब वे confluency तक पहुँचने के लिए, कोशिकाओं एक 1:10 कमजोर पड़ने में विभाजित किया जाएगा.
  4. आईपीएस और TCR-transduced आईपीएस कोशिकाओं के सामान्य रखरखाव.
    1. एक संस्कृति डिश में 0.1% जेलाटीन समाधान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस irSNL76 / 7 फीडर कोशिकाओं वसूली या आईपीएस कोशिकाओं के विभाजन के एक दिन आगे बोने से पहले 30 मिनट के लिए लेपित जाएगा.
    2. आईपीएस कोशिकाओं के विभाजन के लिए, कोशिकाओं से trypsinized जाएगा, 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर centrifuged और 15% FBS DMEM मीडिया में resuspended.
    3. Trypsinized आईपीएसकोशिकाओं को 30 मिनट के लिए एक ताजा संस्कृति डिश पर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में incubated ताजा irSNL76 / 7 फीडर सेल प्रीकोटेड विभेदित कोशिकाओं और अवशेषों फीडर कोशिकाओं को अलग पकवान पर बोने से पहले.
    4. ऊष्मायन के बाद, 4 × 10 6 कोशिकाओं एक 100mm संस्कृति डिश में वरीयता प्राप्त किया जाएगा.

2 इन विट्रो प्रोग्रामिंग

  1. इन विट्रो coculture प्रणाली में.
    1. 0 दिवस पर 5x10 4 आईपीएस कोशिकाओं एक 100mm संस्कृति पकवान 20% FBS α सदस्य मीडिया में संगामी सेल OP9 DL1 monolayer युक्त पर वरीयता प्राप्त किया जाएगा.
    2. 3 दिन में, संस्कृति मीडिया ताजा लोगों के साथ बदल जाएगा.
      1. 5 दिन, कोशिकाओं से trypsinized जाएगा और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए एक ताजा 100mm संस्कृति डिश पर incubating से पहले 5 मिनट के लिए 400 ग्राम centrifuged.
      2. अस्थायी कोशिकाओं और एकत्र किया जा गिना जाएगा, 5x10 5 कोशिकाओं को एक ताजा संस्कृति को हस्तांतरित किया जाएगा20% FBS α सदस्य मीडिया में संगामी सेल OP9 DL1 monolayer युक्त पकवान. Cytokine mFlt-3L (अंतिम एकाग्रता: 5 एनजी / एमएल) संस्कृति में जोड़ दिया जाएगा.
      1. दिवस 8, शिथिल संलग्न कोशिकाओं धीरे नीचे विंदुक जाएगा.
      2. 10 एमएल पीबीएस एक और आंशिक रूप से विभेदित आईपीएस कोशिकाओं की अधिक से अधिक वसूली को प्राप्त करने के लिए समय के साथ खिला OP9 DL1 परत से धो लें.
      3. Coculture से कोशिकाओं कटाई के बाद, कोशिकाओं के 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर centrifuged जाएगा और resuspended में 20% FBS α सदस्य मीडिया (5 एनजी / एमएल) mFlt 3L और मिल - 7 (1 एनजी / एमएल) के साथ पूरक.
      4. सेल संस्कृति 6 अच्छी तरह से मिला हुआ OP9 DL1 कोशिकाओं के साथ लेपित प्लेट में स्थानांतरित कर दिया जाएगा. आमतौर पर एक 100 मिमी संस्कृति डिश से बरामद आईपीएस कोशिकाओं 6-अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से एक में स्थानांतरित किया जाएगा.
      1. 10 दिन से, संस्कृति मीडिया हर दूसरे दिन में बदल जाएगा (20% FBS α सदस्य मीडिया supplementeसाथ (5 एनजी / एमएल) mFlt-3L और मिल 7 (1 एनजी / एमएल)).
      2. संस्कृति प्लेटों फीडर के साथ लेपित OP9-DL1 कोशिकाओं फीडर कोशिकाओं के विकास पर निर्भर करता है 4-6 दिनों में बदल जाएगा.
  2. आंशिक रूप से विभेदित आईपीएस कोशिकाओं के vivo परिपक्वता.
    1. Coculture के 22 दिन में, आईपीएस कोशिकाओं बंद trypsinized जाएगा, 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर centrifuged और एक ताजा संस्कृति डिश पर incubated 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस.
    2. अस्थायी कोशिकाओं, एकत्र किया जाएगा 70 सुक्ष्ममापी नायलॉन झरनी के माध्यम से पारित करने के लिए सेल clumps जो चूहों को फेफड़े के दिल का आवेश के कारण हो सकता है बाहर और ठंड पीबीएस में तीन बार धोया.
    3. सेल 1.5x10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के साथ पीबीएस में resuspended जाएगा.
    4. कोशिकाओं के इंजेक्शन से पहले बर्फ पर रखा जाएगा.
    5. पूंछ नस के माध्यम से चतुर्थ इंजेक्शन से पहले, चूहों एक अवरक्त प्रकाश अपनी पूंछ नस चौड़ा करना के तहत रखा जाएगा.
    6. नस घ के बादilatation, μl 200 सेल निलंबन या 3x10 6 कोशिकाओं adoptively अपनी पूंछ नस के माध्यम से 4 पुराने B6.129S7 - Rag1 tm1Mom / जम्मू माउस सप्ताह में हस्तांतरित किया जाएगा. आंशिक रूप से विभेदित आईपीएस कोशिकाओं के vivo परिपक्वता में तीन सप्ताह के लिए अनुमति दी जाती है.
  3. मूल्यांकन.
    1. विभेदित कोशिकाओं और सेल वसूली की दरों के morphological परिवर्तन चित्रा 1.
      1. OP9 DL1 कोशिकाओं के साथ coculture के विभिन्न दिनों में, जीवित कोशिका चित्रों पारंपरिक खुर्दबीन के नीचे ले जाया जाएगा.
      2. सेल वसूली दर कोशिकाओं कि संस्कृति से काटा के संख्या के आधार पर गणना की जाएगी.
    2. प्रवाह सतह मार्कर परिवर्तन के cytometric विश्लेषण चित्रा 2a.
      1. Coculture के अलग अलग दिनों पर कोशिकाओं trypsinization द्वारा संस्कृति से हटा दिया जाएगा और सेल सतह धुंधला आगे बढ़ने से पहले ठंड पीबीएस के साथ धोया.
      2. बुद्धि धुंधला से पहलेघंटे अलग fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी, कोशिकाओं में से 4 डिग्री सेल्सियस एफसी अवरोधक 24G2 द्वारा किया जाएगा 20 मिनट के लिए बंद है.
      3. 20 मिनट के बाद 4 में धुंधला डिग्री सेल्सियस, कोशिकाओं ठंड पीबीएस में तीन बार किया जाएगा प्रवाह cytometric परीक्षा से पहले धोया.
    3. इन विट्रो विभेदित आईपीएस कोशिकाओं में चित्रा. 2b के सक्रियकरण.
      1. सक्रियण परख, विरोधी CD3 (अंतिम एकाग्रता: पीबीएस में 4 ग्राम / एमएल) के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली PRECOAT 4 डिग्री सेल्सियस पर रात से अधिक एक दिन पहले.
      2. Coculture के 22 दिन, आईपीएस कोशिकाओं व्युत्पन्न टी कोशिकाओं संस्कृति से काटा जाएगा और पहले थाली लेपित विरोधी CD3 और घुलनशील विरोधी CD28 एंटीबॉडी (अंतिम एकाग्रता: 4 ग्राम / एमएल) के साथ उत्तेजक ठंड पीबीएस के साथ धोया.
      3. ऊष्मायन 37 में किया जाएगा डिग्री सेल्सियस, 40 घंटे के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर और फिर Befeldin एक और 4 घंटे के लिए संस्कृति में जोड़ दिया जाएगा.
      4. Coculture के अंत में, कोशिकाओं हर होगानिहित धोया, और एफसी अवरोधक द्वारा अवरुद्ध ऊपर वर्णित के रूप में. अवरुद्ध कोशिकाओं fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके CD8 और TCR Vβ श्रृंखला के रूप में सतह मार्कर के लिए दाग जाएगा.
      5. कोशिका की सतह धुंधला हो जाना के बाद, कोशिकाओं 4% formaldehyde का उपयोग करके तय किया जाएगा और Biolegend Permeabilizing किट का उपयोग करके permeabilized.
      6. Permeabilization बाद, IL-2 और IFN-γ जैसे intracellular अणुओं fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग जाएगा.
      7. अंतिम प्रवाह cytometric परीक्षा से पहले, कोशिकाओं ठंड पीबीएस में तीन बार धोया जा अत्यधिक एंटीबॉडी को बाहर.
    4. चूहों चीर / परिपक्वता.
      1. Vivo विकास में, चीर / के तीन सप्ताह के बाद - चूहों बलिदान किया जाएगा, तिल्ली, और लिम्फ नोड्स चूहों से हटा दिया जाएगा.
      2. एकल कक्षों यांत्रिक टूटने के माध्यम से कार्रवाई की जाएगी. लाल रक्त कोशिकाओं ACK lysis बफर और का उपयोग करके lysed जाएगाmononucleocytes और एकत्र किया जाएगा ठंड पीबीएस में दो बार धोया.
      3. धोने के बाद, कोशिकाओं में से 4 डिग्री सेल्सियस एफसी अवरोधक 24G2 साथ अवरुद्ध हो जाएगा और 20 मिनट के लिए अवरुद्ध के अंत में, कोशिकाओं को अलग fluorochrome संयुग्मित विरोधी CD3, विरोधी CD4, विरोधी CD8 और विरोधी TCRβ एंटीबॉडी के साथ दाग जाएगा 4 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए.
      4. धुंधला हो जाना के अंत में, कोशिकाओं ठंड पीबीएस में तीन बार किया जाएगा प्रवाह cytometric परीक्षा से पहले धोया.

3 vivo प्रोग्रामिंग

  1. रेट्रोवायरल निर्माण के जनरेशन.
    1. MSCV - IRES DsRED वेक्टर (MiDR) MSCV IRES - GFP वेक्टर पर आधारित DsRED जीन के साथ GFP जीन प्रतिस्थापन द्वारा निर्मित है.
    2. OT-मैं टी सेल रिसेप्टर जीन बनाने के लिए MiDR OT-I/MiDR का निर्माण वेक्टर में subcloned है.
  2. रेट्रोवायरल transduction और सेल छँटाई.
    1. बेनी-E पैकेजिंग कोशिकाओं की गिरफ्तारीई के लिए pseudovirus उत्पन्न है जो निम्न पारगमन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
      1. 3x10 6 बेनी-E कोशिकाओं एक 100 मिमी संस्कृति डिश अभिकर्मक के लिए एक दिन पहले वरीयता प्राप्त कर रहे हैं.
    2. 0 दिन, बेनी-E कोशिकाओं के साथ ट्रांसफ़ेक्ट जाएगा OT-मैं GeneJamma अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके प्लाज्मिड MiDR.
    3. 1 दिन, 1x10 6 आईपीएस कोशिकाओं की अच्छी तरह से एक 0.1% जेलाटीन प्रीकोटेड 24-अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त किया जाएगा.
      1. 2 दिन, pseudovirus बेनी-E संस्कृति से सतह पर तैरनेवाला युक्त और एकत्र किया जाएगा एक 0.4 सुक्ष्ममापी संभावित contaminants को निकालने के लिए फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया.
      2. Transduction 32 ° C अपकेंद्रित्र की शर्त के तहत 1400 rpm पर प्रदर्शन किया जाएगा 1 घंटे के लिए 5 ग्राम / मिलीलीटर polybrene की उपस्थिति में.
      3. अपकेंद्रित्र आधारित पारगमन के बाद, कोशिकाओं को 32 डिग्री सेल्सियस, रात से अधिक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखा जाएगा.
    4. 3 दिन, दिन 2 टीआरए दोहराने केnsduction प्रक्रिया के रूप में ऊपर वर्णित है. भविष्य में उपयोग के लिए / 7 irSNL76 फीडर कोशिकाओं के साथ एक 6-अच्छी तरह से थाली Precoated जाएगा.
    5. 4 दिन transduced, आईपीएस कोशिकाओं से trypsinized जाएगा, 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर centrifuged और प्रीकोटेड irSNL76 / 7 फीडर कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त है.
    6. Confluency, कोशिकाओं से trypsinized जाएगा, 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर centrifuged और सेल छँटाई के लिए कार्रवाई की. GFP और DsRED डबल सकारात्मक कोशिकाओं MoFlo सेल सॉर्टर द्वारा हल किया जाएगा. के आधार पर छाँटे गए कोशिकाओं भविष्य में उपयोग के लिए / 7 irSNL76 फीडर कोशिकाओं पर संवर्धित किया जाएगा.
  3. दत्तक हस्तांतरण और ट्यूमर चुनौती.
    OT-I TCR transduced आईपीएस कोशिकाओं (OT-I/iPS) आम तौर पर irSNL76 / 7 फीडर कोशिकाओं पर बनाए रखा जाता है के रूप में ऊपर वर्णित है.
    1. दत्तक हस्तांतरण के दिन, OT-I/iPS कोशिकाओं trypsinized कर रहे हैं, 5 मिनट के लिए 400 ग्राम centrifuged और ताजा मीडिया में resuspended.
    2. 30 मिनट पर 37 में एक ताजा संस्कृति डिश ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर विभेदित सेल को खत्म करने के लिए आवश्यक हैऔर शेष फीडर कोशिकाओं.
    3. ऊष्मायन के अंत में, अस्थायी कोशिकाओं और एकत्र किया जाएगा centrifuged 400 ग्राम में 5 मिनट के लिए.
    4. सेल गोली ठंड पीबीएस में तीन बार धोया जा जाएगा, और कोशिकाओं को दो washes के बीच में एक 70 सुक्ष्ममापी नायलॉन झरनी सेल clumps (2X निस्पंदन) को बाहर के माध्यम से पारित हो जाएगा.
    5. धोने के बाद, कोशिकाओं और गिना जाएगा 1.5x10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में ठंड पीबीएस में resuspended.
    6. कोशिकाओं के इंजेक्शन से पहले बर्फ पर रखा जाएगा.
    7. दत्तक हस्तांतरण के लिए 4-6 सप्ताह पुराने महिला C57BL/6J चूहों का इस्तेमाल किया जाएगा. पूंछ नस के माध्यम से चतुर्थ इंजेक्शन से पहले, चूहों उनके नसों पूंछ को फैलाने के लिए एक अवरक्त प्रकाश के तहत रखा जाएगा.
    8. नस फैलने के बाद, 200 μl सेल निलंबन या 3x10 6 कोशिकाओं adoptively पूंछ नस के माध्यम से स्थानांतरित किया जाएगा. छह हफ्ते लिए OT-मैं TCR की vivo परिपक्वता में आईपीएस कोशिकाओं transduced अनुमति दी जाएगी.
      1. चतुर्थ इंजेक्शन के छह सप्ताह के बाद, 4x10 6 E.G7 thymoma कोशिकाओं intraperitoneally inoculated किया जाएगा.
      2. E.G7 thymoma कोशिकाओं संस्कृति से काटा जाएगा और पीबीएस में तीन बार धोया.
      3. धोने के अंत में, कोशिकाओं 8x10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में ठंड पीबीएस में निलंबित कर दिया जाएगा.
      4. 50 μl सेल निलंबन या 6 कोशिकाओं 4x10 peritoneal गुहा में अंतःक्षिप्त किया जाएगा.
  4. मूल्यांकन.
    1. इन विट्रो में TCR OT-I के लक्षण वर्णन आईपीएस कोशिकाओं transduced.
      1. DsRED की प्रतिदीप्त अन्वीक्षण, GFP डबल सकारात्मक कोशिकाओं unfixed जीवित कोशिकाओं के साथ पारंपरिक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत प्रदर्शन किया जाएगा.
      2. जीन एकीकरण और अभिव्यक्ति दोनों पीसीआर और RT-पीसीआर विश्लेषण करती है विश्लेषण किया जाएगा.
        1. सेलुलर डीएनए या शाही सेना के नमूने से अलग Qiagen डीएनए या का उपयोग कर से अलगशाही सेना अलगाव किट.
        2. पीसीआर और RT-पीसीआर प्राइमरों है कि विशेष रूप से recombined VDJ क्षेत्र TCR Vβ5 श्रृंखला की पहचान का उपयोग करके प्रदर्शन किया जाएगा.
    2. टी सेल विकास और परिपक्वता चित्रा 3a.
      1. 2 सप्ताह, 4 और 6 के बाद सेल हस्तांतरण पशु, और बलिदान हो जाएगा तिल्ली लिम्फ नोड्स जानवर से निकाल दिया जाएगा.
      2. एकल कक्ष निलंबन यांत्रिक टूटने के माध्यम से किया जाएगा. लाल रक्त कोशिकाओं ACK lysis बफर और mononucleocytes का उपयोग कर एकत्र किया जाएगा और ठंड पीबीएस में दो बार धोया द्वारा lysed जाएगा.
      3. धोने के बाद, कोशिकाओं में से 4 डिग्री सेल्सियस एफसी अवरोधक 24G2 साथ अवरुद्ध हो जाएगा और 20 मिनट के लिए अवरुद्ध के अंत में, कोशिकाओं और aliquotted जाएगा दाग 4 में अलग fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी डिग्री सेल्सियस के साथ 20 मिनट के लिए.
      4. धुंधला हो जाना के अंत में, कोशिकाओं ठंड पीबीएस में तीन बार किया जाएगा प्रवाह cytometer पर लोड करने से पहले धोया.
    3. पेप्टाइड उत्तेजना चित्रा 3b.
      1. ट्यूमर चुनौती से निपटने के लिए 50 दिन, जानवरों और बलिदान किया जाएगा तिल्ली लिम्फ नोड्स जानवरों से निकाल दिया जाएगा.
      2. एकल कक्ष निलंबन यांत्रिक टूटने के माध्यम से किया जाएगा. लाल रक्त कोशिकाओं ACK lysis बफर और mononucleocytes का उपयोग कर एकत्र किया जाएगा और ठंड पीबीएस में दो बार धोया द्वारा lysed जाएगा.
      3. CD8 + टी कोशिकाओं Miltenyi बायोटेक + CD8 टी सेल अलगाव किट का उपयोग कर से अलग हो जाएगा. पृथक CD8 + टी कोशिकाओं विकिरणित 1:10 के अनुपात में भोले C57BL/6J चूहों से अलग है और 0.5 μmol / एमएल OVA 40 घंटे के लिए 257-264 पेप्टाइड साथ स्पंदित splenocytes के साथ मिलाया जाएगा. इसके बाद, एक Brefeldin संस्कृति में एक और 4 घंटे के लिए जोड़ा जाएगा.
      4. Coculture के अंत में, कोशिकाओं, काटा जाएगा धोया और एफसी अवरोधक द्वारा अवरुद्ध ऊपर वर्णित के रूप में.
      5. अवरुद्ध कोशिकाओं की सतह के निशान के लिए दाग जाएगाCD8 और TCR Vβ5 श्रृंखला के रूप में fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके नेताओं.
      6. कोशिका की सतह धुंधला हो जाना के बाद, कोशिकाओं 4% formaldehyde का उपयोग करके तय किया जाएगा और सेल permeabilization किट का उपयोग कर permeabilized.
      7. Permeabilization बाद, IL-2 और IFN-γ जैसे intracellular अणुओं fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग जाएगा.
      8. अंतिम प्रवाह cytometric परीक्षा से पहले, कोशिकाओं ठंड पीबीएस में तीन बार धोया जा अत्यधिक एंटीबॉडी को बाहर.
    4. Vivo में परख की हत्या चित्रा 3C.
      1. भोले C57BL/6J चूहों से Splenocytes और अलग हो जाएगा लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ लेबल.
      2. कोशिकाओं के साथ लेबल μmol 5 मिलीग्राम / CFSE (CFSE हाय कोशिकाओं) 10 ग्राम / मिलीलीटर OVA 257-264 पेप्टाइड और 0.5 μmol / एमएल (CFSE लो कोशिकाओं) CFSE स्पंदित नहीं किया जाएगा साथ लेबल की कोशिकाओं के साथ स्पंदित जाएगा. 2.5x10 6 CFSE हाय कोशिकाओं प्लस 2.5x10 6 CFSE लो कोशिकाओं का एक मिश्रण adoptively संकेत प्राप्तकर्ता में चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा स्थानांतरित कर दिया.
      3. 16 घंटे के बाद उन चूहों से splenocytes और पृथक किया जाएगा CFSE + कोशिकाओं प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया जाएगा.
    5. Intraperitoneal ट्यूमर कोशिका गिनती चित्रा 4.
      ट्यूमर चुनौती से निपटने के लिए 20 दिन में, चूहों और बलिदान किया peritoneal गुहा lavage ठंड पीबीएस का उपयोग करके प्रदर्शन किया जाएगा. पेरिटोनियल lavage बरामद ट्यूमर कोशिकाओं गिना जाएगा.
    6. ट्यूमर टी कोशिकाओं घुसपैठ पहचान चित्रा 5.
      1. ट्यूमर चुनौती से निपटने के लिए देर से मंच पर, चूहों और बलिदान किया जाएगा ट्यूमर विभिन्न समूहों से peritoneal गुहा से निकाल दिया जाएगा.
      2. ट्यूमर टुकड़ों में कटौती की जाएगी, एक टुकड़ा एक cryovial में डाल दिया जाएगा और तुरंत सूखी बर्फ पर रखा, दूसरे आधे में तय हो जाएगाmaldehyde और एक तीसरा टुकड़ा भविष्य के उपयोग के लिए वातानुकूलित RPMI 1640 मीडिया में संरक्षित किया जाएगा.
      3. एच एंड ई धुंधला हो formaldehyde निश्चित और पैराफिन लिपटे के नमूने से सामान्य प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाएगा.
      4. Immunofluorescent धुंधला हो cryopreserved नमूनों पर प्रदर्शन किया जाएगा.
        1. ऊतक sectioned और संरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस में उपयोग करने से पहले हो जाएगा.
        2. ऊतक वर्गों होगा हवा में 15 मिनट से 15 मिनट ठंड एसीटोन निर्धारण से पहले सूख गया.
        3. निर्धारण के बाद, वर्गों पीबीएस धोने से पहले 5 मिनट और 15 मिनट के लिए सूख हवा हो जाएगा.
        4. धोने, एक नम कक्ष में जगह स्लाइड के बाद और गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक में 30 मिनट के लिए पीबीएस में 30 μl 3% BSA के साथ ऊतक अनुभाग को कवर.
        5. अवरुद्ध के अंत में बंद दाग बफर अवरुद्ध और एक पीई विरोधी TCR Vα2 एंटीबॉडी और FITC विरोधी OVA एंटीबॉडी 3% BSA में पतला के 50 μl मिश्रण के साथ ऊतक वर्गों को कवरपीबीएस में.
        6. 2 घंटे के लिए एक नम कक्ष में सेते और ऊष्मायन अंत में, स्लाइड ठंड पीबीएस में तीन बार धोया जाएगा और फ्लोरोसेंट सूक्ष्म परीक्षा से पहले एक पानी आधारित बढ़ते मीडिया के साथ रखा.
      5. प्रवाह टी कोशिकाओं घुसपैठ ट्यूमर के cytometric विश्लेषण.
        1. ट्यूमर एकल कक्ष निलंबन और लाल रक्त कोशिकाओं ACK lysis बफर द्वारा lysed जाएगा में कुचल होगा.
        2. धोने और अवरुद्ध करने के बाद, कोशिकाओं को अलग fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी है कि विशेष रूप से CD8, TCR Vα2 TCR वी β5 अणुओं है कि कोशिका की सतह पर व्यक्त की पहचान के साथ चिह्नित किया जाएगा.
    7. माउस अस्तित्व चित्रा 6.
      ट्यूमर चुनौती के बाद, माउस अस्तित्व सावधानी से नजर रखी जाएगी.

4. प्रतिनिधि परिणाम

CD3 और TCRβ टी के मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता हैकोशिकाओं. निर्धारित करें कि क्या पायदान ligand DL1 साथ आईपीएस कोशिकाओं की उत्तेजना टी सेल भेदभाव के लिए योगदान कर सकता है, हम CD3 के आईपीएस कोशिका व्युत्पन्न कोशिकाओं पर अभिव्यक्ति और TCRβ + मूल्यांकन, और आगे विश्लेषण CD4 और CD8 अभिव्यक्ति, CD3 पर gating + और ​​TCRβ + जनसंख्या. CD8 + एक सकारात्मक (सपा) टी कोशिकाओं इन विट्रो में आईपीएस कोशिकाओं से उत्पन्न किया गया - यहाँ के रूप में 22 दिन, CD3 + TCRβ CD4 + पर दिखाया गया है. इसके अलावा, आईपीएस सेल व्युत्पन्न सपा कोशिकाओं IL-2 और उत्पादन करने में सक्षम थे IFN-γ जब इन विट्रो में थाली लेपित विरोधी CD3 और घुलनशील विरोधी CD28 एंटीबॉडी (2 छवि) द्वारा प्रेरित, सुझाव आईपीएस सेल व्युत्पन्न टी कोशिकाओं कार्य कर रहे हैं.

प्राप्तकर्ता चूहों में दत्तक हस्तांतरण के बाद, TCR के बहुमत जीन transduced आईपीएस कोशिकाओं CD8 में भेदभाव लिया + CTLs, जो इन विट्रो में से पेप्टाइड उत्तेजना को जवाबIL-2 और IFN-γ (3 छवि). creting सबसे महत्वपूर्ण बात, के दत्तक हस्तांतरण TCR transduced आईपीएस कोशिकाओं ट्यूमर ऊतकों और ट्यूमर चुनौती छवि (5-6) से संरक्षित जानवरों में OVA प्रतिक्रियाशील CTLs की घुसपैठ शुरू हो. इस प्रकार, TCR जीन transduced आईपीएस कोशिकाओं vivo में कार्यात्मक प्रतिजन विशेष CTLs में अंतर कर सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 आईपीएस सेल भेदभाव की आकृति विज्ञान. विभिन्न दिनों में, माउस आईपीएस कोशिकाओं α सदस्य 20% FCS और 2.2 ग्राम / एल 5 एनजी / एमएल mFlt3L और 1 एनजी / एमएल लाख 7 की उपस्थिति में सोडियम बिकारबोनिट के साथ पूरक मध्यम में सह OP9-DL1 कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत .

चित्रा 2
चित्रा आईपीएस कोशिकाओं से 2 टी सेल भेदभाव. माउस आईपीएस कोशिकाओं OP9 DL1 चित्रा 1 में वर्णित कोशिकाओं के साथ सह सुसंस्कृत. घ पर22 प्र, आईपीएस सेल व्युत्पन्न कोशिकाओं और अलग विश्लेषण किया गया. ए) + CD8 CD4 - या CD4 - CD3 + और ​​TCRβ + आबादी पर CD8 + gating के बाद कोशिकाओं. बी) सेल प्लेट लेपित विरोधी CD3 और घुलनशील 5 घंटे के लिए विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% पर सीओ 2 प्रेरित थे. दो आईएल और IFN-γ intracellular धुंधला हो जाना द्वारा विश्लेषण किया गया बाद रहते हैं CD4 पर gating, CD8 + टी कोशिकाओं.

चित्रा 3
चित्रा 3 vivo में आईपीएस कोशिकाओं से एंटीजन - विशिष्ट CD8 + टी सेल विकास. OT-I TCR जीन transduced आईपीएस कोशिकाओं iv C57BL / 6 चूहों में इंजेक्शन थे. छह से दस सप्ताह के बाद, OVA विशिष्ट CD8 Vβ5 + + टी सेल के विकास के लिए निर्धारित किया गया था. एक CD8) + + जमा LNS और तिल्ली से टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया गया सी पर gating के बाद, Vβ5D8 + आबादी. बी) IL-2 और IFN-γ उत्पादन (अंधेरे लाइनों, छायांकित क्षेत्रों निर्धारण नियंत्रण संकेत मिलता है) intracellular cytokine धुंधला हो जाना द्वारा निर्धारित किया गया है, CD8 Vβ5 + + आबादी पर gating के बाद. सी) vivo परख / प्रसार cytotoxicity में. OVA 257-264 पेप्टाइड और नियंत्रण के साथ CFSE (सही चोटियों) हाय और CFSE (बाएं चोटियों) लो लक्ष्य कोशिकाओं स्पंदित गया है, क्रमशः, और दस सप्ताह आईपीएस कोशिका या OT-मैं सीटीएल स्थानांतरण के बाद एक दिन के स्थानांतरण के बाद चूहों में इंजेक्शन थे.

चित्रा 4
चित्रा 4 TCR OT-I के दत्तक हस्तांतरण जीन transduced आईपीएस कोशिकाओं ट्यूमर के विकास को दबा. C57BL / 6 चूहों में adoptively OT-I TCR जीन transduced आईपीएस कोशिकाओं को स्थानांतरित कर दिया गया. चूहों के एक समूह OVA प्रतिक्रियाशील + CD8 टी कोशिकाओं के साथ OT-मैं टीसी से इंजेक्ट किया गया थाआर ट्रांसजेनिक चूहों और चूहों के एक समूह को कोई सेल हस्तांतरण था. या तो छह सप्ताह के बाद या सेल हस्तांतरण के बाद अगले दिन, चूहों ई. G7 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ चुनौती अधीन थे. 20 दिन, peritoneal गुहा में ट्यूमर कोशिकाओं enumerated थे.

चित्रा 5
चित्रा 5 आईपीएस सेल व्युत्पन्न प्रतिजन विशेष CTLs ट्यूमर ऊतकों में घुसपैठ. ट्यूमर चुनौती के बाद 30 से 35 दिन, ट्यूमर ऊतकों ट्यूमर प्रतिक्रियाशील टी सेल घुसपैठ के लिए जांच की गई. ए) एच एंड ई धुंधला हो जाना. भड़काऊ कोशिकाओं ट्यूमर ऊतकों (↓) में घुसपैठ की. बी) Immunohistological धुंधला हो जाना. OVA विशिष्ट Vα2 + CTLs (लाल) OVA व्यक्त ट्यूमर ऊतकों (हरा) में घुसपैठ की. सी) ट्यूमर ऊतकों से एकल कक्ष निलंबन Vα2 की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया + + प्रवाह cytometry, सीडी 8 + जनसंख्या पर gating के बाद Vβ5.

चित्रा 6 TCR OT-I के दत्तक हस्तांतरण जीन आईपीएस कोशिकाओं transduced माउस अस्तित्व बनाए. OVA TCR जीन transduced आईपीएस कोशिकाओं adoptively C57BL / 6 चूहों कि ई. G7 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ चुनौती के अधीन किया गया के रूप में छवि में वर्णित में स्थानांतरित कर दिया गया. 4. 50 दिन पर माउस अस्तित्व Kaplan-Meier अस्तित्व घटता (n 6 =) द्वारा दिखाया गया था.

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Discussion

अधिनियम आधारित चिकित्सा के लिए, पुनः जलसेक vivo में अत्यधिक प्रतिक्रियाशील एजी विशेष टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या की इन विट्रो पीढ़ी में एक इष्टतम दृष्टिकोण है. हालांकि हमारे विधि में इन विट्रो आईपीएस कोशिकाओं, आईपीएस सेल व्युत्पन्न कोशिकाओं को चार हफ्तों में, विशेष रूप से चौथे सप्ताह में मरने की बड़ी संख्या से कार्यात्मक टी कोशिकाओं की वृद्धि देता है. हम निष्कर्ष है कि पायदान से बचने के संकेत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से DL1 आईएल 7 FLt3L और आईपीएस सेल व्युत्पन्न पूर्वज टी कोशिकाओं के अस्तित्व को बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं हैं मध्यस्थता संकेत, अन्य अस्तित्व कारकों सहकारी इन सेल परिपक्वता को विनियमित करने के लिए हो सकता है. TCR जीन पारगमन और बड़े पैमाने पर प्रत्यक्ष टी सेल भेदभाव पायदान ligand के साथ इन विट्रो उत्तेजना में आईपीएस कोशिकाओं से, तथापि, आईपीएस सेल व्युत्पन्न प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को अभी भी अस्तित्व, नहीं अब जो आईपीएस सेल व्युत्पन्न उपयुक्त संख्या प्राप्त रोकता प्रतिजन एसीटी आधारित immunotherapy के लिए विशेष टी कोशिकाओं.

"ve_content> thymus में टी lymphocytes के विकास के एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया है अपरिपक्व thymocytes CD4 की अभिव्यक्ति और CD8 कमी के रूप में डबल नकारात्मक कोशिकाओं (DN) करने के लिए भेजा जाता है. डी.एन. व्यापारियों CD44 की अभिव्यक्ति के आधार पर कर रहे हैं विकास सबसेट में विभाजित CD25:. DN1 (CD44 + CD25 -), DN2 (CD44 + CD25 +) DN3 (CD44 - CD25 +) और DN4 CD44 - CD25 - DN3 केवल कोशिकाओं है कि एक कार्यात्मक TCRβ श्रृंखला उत्पन्न किया है, जिसके साथ जोड़े अपरिवर्तनीय पूर्व Tα और CD3 चेन एक पूर्व TCR बनाने के लिए और आगे भेदभाव के लिए चयन कर रहे हैं इस घटना, β चयन करार दिया, टी सेल के विकास के दौरान पहले जांच की चौकी पूर्व TCR गठन संकेतों प्रसार, TCRβ बिन्दुपथ पुनर्व्यवस्था की समाप्ति का प्रतिनिधित्व करता है. , और डी.एन. thymocytes की CD4 भेदभाव CD8 + + डबल सकारात्मक (डीपी) 17 चरण में इन विट्रो उत्तेजना w हमारीith पायदान ligand DL1 आईपीएस कोशिकाओं ड्राइव करने के लिए 2 सप्ताह में β चयन के माध्यम से जांच की चौकी के पास, और पूर्व टी कोशिकाओं बनने (CD3 TCRβ; CD25 - CD44 -; CD4 - CD8 -). अतिरिक्त उत्तेजना 2 सप्ताह परिपक्व CD8 + टी कोशिकाओं (; -; CD62L + CCR7 + CD27 CD127 + + CD8 CD4 + CD3 + TCRβ +) में पारगमन के लिए पूर्व टी कोशिकाओं की अनुमति देता है परिपक्व सपा टी कोशिकाओं TCR और CD3 जटिल और उत्तेजना के अभाव में मर जाएगा.

आईपीएस से प्रतिजन विशेष CTLs के vivo प्रोग्रामिंग में कोशिकाओं की कमी को दूर करने के लिए अधिनियम आधारित चिकित्सा के लिए टी कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या प्राप्त कर सकते हैं. ट्यूमर के विकास की मनाया नियंत्रण के बावजूद, हम TCR जीन transduced आईपीएस कोशिकाओं के साथ अधिनियम के कुछ सीमाओं की पहचान की. सबसे पहले, vivo विकास में कम से कम छह सप्ताह पहले टी सेल टी से व्युत्पन्न भेदभाव के लिए आवश्यक हैआईपीएस कोशिकाओं ransferred. दूसरा, हम फर हानि, चूहों कि TCR transduced आईपीएस कोशिकाओं के रूप में टी सेल आधारित कैंसर immunotherapy administrating कुछ नैदानिक ​​परीक्षणों में मनाया. प्राप्त ऑस्टियोपोरोसिस और अन्य छोटे autoimmune अभिव्यक्तियों देखा इन प्रभावों को हस्तांतरित आईपीएस कोशिकाओं से अन्य प्रतिरक्षा सेल प्रकार के उत्पादन की वजह से हो सकता है. हालांकि, इन कोशिकाओं vivo में उत्पन्न कर रहे हैं कि कैसे अनजान बनी हुई है. तीसरा, TCR जीन transduced आईपीएस कोशिकाओं की दत्तक हस्तांतरण इसके स्टेम phenotype की वजह teratoma पैदा करने का जोखिम है. / - लेकिन अब तक हमारे अध्ययन में, हम केवल एक Rag1 में extrathymic जन की पहचान माउस और पारंपरिक C57BL / 6 चूहों में मनाया असामान्यता नहीं है. इसलिए, हम सुझाव देते हैं, के लिए अधिक से अधिक दक्षता हासिल करने के लिए, यह बेहतर है vivo आईपीएस में भेदभाव के लिए आनुवंशिक पृष्ठभूमि मैच मिल.

ESCs के डेरिवेटिव के विपरीत, कुछ आईपीएस कोशिकाओं से विभेदित कोशिकाओं में असामान्य जीन की अभिव्यक्ति की क्षमता हैटी सेल निर्भर syngeneic 18 प्राप्तकर्ताओं में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए एल. इसलिए, रोगी विशेष के आईपीएस कोशिकाओं से ली गई कोशिकाओं की प्रतिरक्षाजनकता से पहले इन ऑटोलॉगस कोशिकाओं के किसी भी नैदानिक ​​आवेदन पर विचार किया गया है मूल्यांकन किया जाना चाहिए. आईपीएस सेल व्युत्पन्न कोशिकाओं के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण करके, यह दिखाया गया है है कि 9 जीनों के एक समूह (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, Spt1, Lce3a, Chi3L4, Olr1, Retn) असामान्य रूप से उच्च स्तर पर व्यक्त किया गया . इसके अलावा, इन जीनों के ES कोशिकाओं में तीन (Zg16 Hormad1, और Cyp3a11) उत्प्रेरण अभिव्यक्ति काफी आनुवंशिक मिलान 18 प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपण पर प्रतिरक्षाजनकता में वृद्धि हुई है. इस प्रकार, नौ प्रोटीन का समूह संभावित दत्तक हस्तांतरण के बाद आईपीएस सेल व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रतिरक्षा अस्वीकृति का कारण बन गया है, और immunogenic मार्कर का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. फिर भी, सेल के संभावित प्रतिरक्षाजनकता डे आईपीएसrived टी lymphocytes निर्धारित नहीं किया गया है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम प्रदान करने के लिए डॉ. Shinya Yamanaka (क्योटो विश्वविद्यालय) धन्यवाद आईपीएस MEF एनजी 20D-17 सेल लाइन का समर्थन करने के लिए OT1-2A डॉ. Dario Vignali (सेंट जूदास बच्चों अनुसंधान अस्पताल) • pMig द्वितीय का निर्माण, डा. जुआन कार्लोस Zuniga सेल OP9 DL1 लाइन का समर्थन करने के लिए (इम्यूनोलॉजी विभाग, टोरंटो विश्वविद्यालय के) - Pflucker, और इस अध्ययन के डिजाइन की मदद करने के लिए डॉ. केंट ई Vrana (औषधि विभाग, पेन स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन के). इस परियोजना, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, Barsumian ट्रस्ट और मेलेनोमा रिसर्च फाउंडेशन (जे सांग) से अनुदान K18CA151798 संख्या के साथ अनुदान के तहत वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD Biosciences 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD Biosciences 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS Hyclone SH3007.01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B7651
Polybrene Sigma-Aldrich 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza Inc. 10-548E
mFlt-3L PeproTech Inc 250-31L
mIL-7 PeproTech Inc 217-17
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma-Aldrich A7906
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
0.4 μm filter EMD Millipore
Moflo Cell Sorter Dako
Calibur Flow Cytometer BD Biosciences
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences
Mouse restrainer Braintree Scientific, Inc.

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References

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Comments

2 Comments

  1. I enjoyed reading and watching your article. I would like to ask you if we can obtain OP9-DL1 from you.

    Reply
    Posted by: Byoung K.
    May 14, 2013 - 8:35 PM
  2. thanks

    Reply
    Posted by: Rashad A.
    February 26, 2014 - 10:06 AM

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