α-테스트 : 전체 타액을 사용하여 빠른 셀 프리 CD4의 열거

Published 5/16/2012
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Medicine

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Summary

CD4 열거 방법, α-테스트는 신속하고 정확한 CD4 카운트를 제공하기 위해 전체 타액을 사용하는 설명되어 있습니다. α-테스트 비용 동전과 같은 단클론 항체, 계측, 냉동, 샘플 운송뿐만 아니라 수집 및 혈액의 처리와 같은 기술 교육, 값비싼 시약의 필요성을 없애줍니다.

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Bristow, C. L., Babayeva, M. A., Modarresi, R., McArthur, C. P., Kumar, S., Awasom, C., et al. The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva. J. Vis. Exp. (63), e3999, doi:10.3791/3999 (2012).

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Abstract

HIV 질환을 모니터링하기 위해 저렴한 CD4 열거를위한 긴급 필요가있다. CD4 열거는 혈액 세포, 오직 현재 결제 방법에 대한 CD4를 측정하기위한 특정 단클론 항체의 시간 및 온도 제한, 기술 세련미와 시약 비용으로 인해 자원이 제한된 지역에 범위 밖입니다. 일반적으로 사용되는 비용 절감 및 시간 절약 실험실 전략은 오히려 측정 특정 혈액 값보다 계산하는 것입니다. 예를 들어, LDL 수치는 총 콜레스테롤, HDL 및 트리 글리세 리드가 1 측정된 수준을 사용하여 계산됩니다. 따라서 직접 CD4의 개수 + T 세포는 CD4을 계산하는 정확한 방법을 제공할 수를 조절 세포가없는 상호의 신분은 상호의 생리 관련으로 인해 계산됩니다.

혈액을 입력하고 CD4에게 + T 세포를 순환이되도록 운명되는 줄기 세포의 수는 케모카인 CXCL12에 의해 결정됩니다ND는 수용체는 운동 2 자신의 영향력으로 인해 CXCR4. 혈액으로 줄기 세포 운동의 과정은 또한 세포 표면에 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE CS) 및 HLE CS-반응성 활성 α 1 proteinase 억제제 (α PI, α 1 antitrypsin, SerpinA1) 3에 의해 규제됩니다. HIV-1 질환에서 α PI는 질병 프로세스 4 ~ 인해 inactivated있다. HIV-1 질병의 조기 asymptomatic 카테고리에서 활성 α PI는 치료 HIV-1 환자 (평균 = 12 μm의, 그리고 증상 범주 4, 5 중 정상적인 수준을 달성하는 100 % 아래 정상적인 것으로 발견되었다.이 패턴이 아닌 부족한 합성, proteolytic 불활 성화 또는 산소로, 면역 불활 성화에 기인되었습니다. 우리는> 220 CD4 세포 / μl와 HIV-1 과목에서 CD4 카운트가 (R 2 개 활성 α PI의 혈청 수준과 상호 것으로 관찰 = 0.93, P &그건, 0.0001, N = 26) 및 비활성 α PI (R 2 = 0.91, P <0.0001, N = 26) 5. HIV-1 감염과 감염되지 않은 과목에 대한 α 1 PI의 행정은 α PI는 CD4의 수를 규제에 참여 + T 세포가 혈액 3에서 제안 CD4 카운트 극적으로 증가 결과.

자극을 통해 전체 타액 활성 α 사설 탐정이 측정의 상관 관계의 측정 그것이 CD4 카운트를 계산하는 정확한 방법이라는 증거입니다 있도록 충분한 묽은 exudate을 (플라즈마가 타액으로 혈관 벽을 통과 proteinaceous 재료를 포함)가 포함되어 있습니다. 간단히 같은 껌이나 구연산 등의 산성 sialogogues은 전체 입을 타액으로 혈청 스며 나옴을 자극. 혈청 스며 나옴을 자극 후 타액의 혈청 α PI의 활동 엘라스타제 활동을 억제하기위한 능력에 의해 측정됩니다. 돼지의 췌장 엘라스타제 (PPE)엘라스타제의 즉시 사용할 수 저렴한 소스입니다. PPE는 특정 기판, colorimetric 펩타이드입니다 중 하나, succinyl, L 살라-L-살라-L-살라-P-nitroanilide (SA를 cleaving에서 PPE을 방지 일대일 복잡한을 형성 α PI에 바인딩 3 NA). 상온에서 10 분 용 보호구의 포화 농도와 타액을 잠복기 것은 타액에있는 모든 활성 α PI에 PPE의 바인딩이 가능합니다. 활성 α PI에 의해 PPE의 결과 억제는 PPE 기판 SA 3 NA합니다. (그림 1)를 추가하여 측정할 수 있습니다. CD4 카운트는 혈액 부피 (CD4 세포 / μl)의 측면에서 측정하고 있지만, 타액의 α 1 PI의 농도는 볼륨이 날짜와 사람 중에 상당히 달라질 수없는 타액의 볼륨 때문에, 타액의 혈청 농도와 관련되어 사람 6. 그러나, 타액의 거의 모든 단백질은 혈청 컨텐츠로 인해이며, 타액의 단백질 함량은 내 잘못이다7 surable. 따라서 타액에서 활동중인 α PI는 타액 단백질 콘텐츠에 대한 비율로 계산되며, α 1 PI 인덱스 되나있다. 결과는 본 α PI 지수는 CD4 카운트를 계산하기위한 정확하고 정밀한 physiologic 방법을 제공하는 입증 제시.

Protocol

1. 신선한 워킹 솔루션을 준비한다

  1. TBS : 0.05 M 트리스는 식염, 산도에게 7.8 (TBS)을 버퍼. 60 ML TBS / microplate를 준비합니다.
  2. PPE : 돼지의 췌장의 엘라스타제, 유형 1 (PPE) 정학로 제공됩니다. 잘 흔들 약 0.01 U / ML에 TBS에서 PPE를 희석. 6 ML)이 솔루션 / microplate 일을 준비합니다.
  3. SA 3 NA : Succinyl, L 살라-L-살라-L-살라-P-nitroanilide (SA 없음). 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 0.1 M 주식 SA 3 NA 솔루션을 준비하고 -20 ° C. 즉시 사용하거나 저장 주식 SA 3 NA 솔루션 TBS에서 100분의 1을 diluting하여 6ml 작업 솔루션 / microplate를 준비합니다.
  4. COOMASSIE 블루 : TBS에서 10 % Coomassie 브릴리언트 블루 R-250 (Coomassie 파랑)의 주식 솔루션을 준비하고 -20 ° C. 즉시 또는 상점 사용 TBS 주식 솔루션 1천분의 1을 diluting하여 6 ML 작업 솔루션을 준비합니다.

2. 타액을 준비

침이 컬렉션 서있는 위치에서, 같은 입안에 구연산 산성이나 껌 같은 sialogogue을 배치하여 타액으로 혈청 스며 나옴을 자극. 무설탕 레몬 드롭 자주 edentulous와 껌을 씹을 수없는 HIV-1 환자 편리합니다. 처음 3 분 동안 필요에 따라 삼키는하고, 다음 3 분위한 덮힌 컵에 전체 입을 타액을 수집합니다. 이것은 타액의 약 2 ML을 제공합니다. -80시 즉시 사용하거나 저장 ° C.
  • 타액 처리 :면 37 ° C와 얼음 장소에 냉동, 해동의 표본. 2-4에서 신선한 또는 해동 표본을 저장 ° C ~ 삼일 이상 더 이상은 아니야. 와동하지 타액 수행되며 혈청 exudate를 포함하지 mucin을 pipetting하지 마십시오. 침이 취급시주의 사항 표준을 사용 http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf를 .
  • 3. Microplate 설정까지

    1. 표본 : 각 시험에 잘, 150 μl / 우물의 최종 부피 20 μL 타액이 추가됩니다. 거품을 도입하지 않고 pipetting하여 섞는다.
    2. 제어 : 긍정적인 컨트롤 PPE를 포함하지만 아무 타액. 부정적인 컨트롤은 타액을 포함하지만 아무 PPE.To는 긍정적인 컨트롤이 그래요, 20 μL TBS를 추가하지 않습니다. 부정적인 컨트롤 그래요, 20 μL 타액에 추가됩니다.
    3. PPE 보육 : PPE 작업 솔루션을 잘 흔들어. 물론 부정적인 제어 우물 제외한 각 50 μL PPE 작동 솔루션을 추가합니다. 부정적인 제어 우물로, 50 μL TBS를 추가합니다. 23 ° C.에 10 분 알을 품다
    4. 기판 보육 : 각 잘 ~ 50 μL SA 3 NA 작업 솔루션을 추가합니다. 23 ° C.에 45 분 품어
    5. COOMASSIE 블루 :. 50 μL Coomassie 파랑 작업 솔루션을 추가 </ 리>
    6. - 읽기 : microplate 리더의 흡광도, 활성 α PI 및 단백질 함량을 나타내는 Coomassie 파랑을 감지하기 위해 595 nm의를 대표하는 SA 3 NA 절단을 감지하기 위해 405 nm의를 참조하십시오.

    4. α 1 PI 지수를 계산

    1. 평균 405 nm의 595 nm의을 정상화 : 각 세중의 경우, 평균을 계산합니다. 표본 평균에서 제외 제어 평균을 뺍니다. 플레이트 - 투 - 플레이트 편차를 최소화하려면 다음과 같이 긍정적인 제어 평균하여 각 표본 평균을 나누어 평균을 정상화 :

    등식 1

    1. α 1 PI INEX를 계산 : 표준 595 nm의 의한 405 nm의 정규 나누기 :


    5. 대표 결과

    지방병, 리소스 제한된 지역에서 CD4 카운트를 모니터링하는 시점의 케어 선별 검사로 α-테스트 용도 적합 여부를 확인하려면 자극 타액 20 여성에서 수집되었다 11 남성의 HIV-1 과목 참석 클리닉에 대해 카메룬의 일상적인 관리. 뉴욕시에서 수집된 타액을 사용하는 α-시험 개발하는 동안 예비 관찰과 일치, 타액의 α 1 PI 지수는 CD4 카운트 (R 2 = 0.91, P <0.0001. N = 31)와 상호 카메룬에서 수집했습니다. 관계는 선량 - 반응 관계 (그림 2A)과 일치 3 - 매개 변수 sigmoidal 곡선에 의해 정의되었다. 95 %의 신뢰와 예측 간격이 각각 파란색과 빨간색 선, (그림 2B)로 표시됩니다.

    에이전의 연구, 우리는 CD4 + T 세포는 주기성 23 sinusoidal 사이클링 ± HIV-1 과목과 α 1 PI 결핍증 (PIZZ) 3 상속된 버전 과목 3.5 일 전시 사실을 확인했습니다. 묘사 본 27 일간의 주기성 (그림 3A)를 전시가 아닌 HIV-1 건강한 통제 사이클링 CD4의 컴퓨터가 만든 사인 곡선 분석의 대표적인 예입니다.

    CD4의 컴퓨터가 만든 사인 곡선 분석 + 6 과목 T 세포 변화는 진동 3의 피크 - 투 - 피크 진폭 및 축에 대한 가치관이 나왔고. 예상되어지는대로 진동 축이 진폭 (R 2 = 0.96, P = 0.009, N = 6) (그림 3B)와 상호되었습니다. 환자 것입 낮은 CD4 T + 셀 카운트는 CD4 T 세포 카운트의 주기적 변화가 작았, 높은 CD4 + T 세포 카운트 환자에서 주기적 변화가 큰 있었다.

    때문에그림 2에 묘사된 회귀 선 진동과 진동 축 축이 진폭이에 의해 변경할함으로써 회귀 선 CD4 + T 세포가 예상되어지는 얼마만큼 위 아래 추정 회귀 선에 대해 계산할 수, 진폭과 서로 관련되어 추정 사이클링 (그림 3C). 그림 3C와 그림 2B에서 계산된 신뢰 구간 계산 진폭 오버레이, 그것은 진폭이 (녹색 라인) 95% 내에 놓여 것으로 나타났다 신뢰 구간 (파란색 선) (그림 3D).

    그림 1
    1 그림. 절차 요약 : 입안에 장소 구연산 산성과 타액을 수집합니다. 세중의에 microplate의 우물로 희석 타액을 추가합니다. 각도에 PPE를 추가하고 23 ° C.에 15 분 동안 품어 각도에 PPE 기판을 추가하고 23 ° C에서 45 분 동안 품어. Coomassie 블루를 추가하고 PPE 활동을 감지하고 595 nm의에서 단백질을 감지하는 405 nm의에서 읽어보세요.

    그림 2
    그림 2. 표준 CD4 열거 방식으로 α-테스트의 비교. ) α-시험이 자극된 전체 입을 타액에서 α PI 지수를 quantitating에 의해 수행되었다. CD4 카운트는 표준 유동세포계측법를 사용하는 독립 의학 연구소에 의해 수행되었다. 유동세포계측법과 타액을위한 혈액은 같은 병원 방문에서 수집된되었다. α 1 PI 지수와 CD4 카운트 사이의 관계는 3-파라미터 sigmoidal 곡선 (R 2 = 0.91, P <0.0001, N = 31). B) 95 %의 신뢰와 예측 간격은 파란색과 빨간색으로 그려져있다 정의한 각각 선,.

    그림 3
    그림 3. CD4에게 C를 계산의 정확성α1PI Index.A를 사용 ounts)은 CD4 + T 세포가 아닌 HIV-1 건강 관리 27 일간의 주기성으로 sinusoidal 자전거를 전시. 진동 축이 그려져있다 (빨간 점선). B) T 세포 사이클이 4 HIV-1 과목 진동 피크 - 투 - 피크 진폭과 축을 계산하는 데 사용되었다 CD4, 1 이외의 HIV의 컴퓨터 생성된 사인 웨이브 분석 -1 PIzz 제목과 부품 A에서 CD4 간의 관계를 묘사되지 않은 HIV-1 건강 관리 T + 세포 진폭과 진동 축 3 - 매개 변수 sigmoidal 곡선 (R 2 = 0.96, P = 0.009, N에 의해 정의되었다 = 6). C) 부분 B)에서 파생되는 진동의 진폭과 축 사이의 sigmoidal 관계는 그림 2에서 회귀 선 (검은 선)을 따라 포인트의 예상 진폭 (녹색 라인)을 계산하는 데 사용되었다. D) 예상 진폭 간격 (녹색 라인)는 95 % 신뢰 구간 (에서 크게 달랐다로 맨 휘트니 순위 합 시험과 진폭 선과 회귀 선 (37 세포 사이의 평균 차이 (95 % 신뢰 구간과 회귀 선 (63 셀 / μl 사이의 평균 차이 비교 기준)에 따라 결정 파란색 라인) / μl), P = 0.001).

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    Discussion

    Undiluted 혈청은 평균 36 μm의를 포함 α PI 및 3.6 μm의 α 2 macroglobulin (α 2 M) 10 배 차이 8. 두 단백질은 PPE에 바인딩을 위해 경쟁합니다. 이러한 두 가지 특성, 농도 및 PPE 친화력은 특별히 α 2 M 8을 경쟁의 존재에 정상 혈청에서 α PI를 측정할 수있는 방법을 개발하기 위해 악용되었습니다. 이 방법은 0.3 % 혈청에서와 같은 작은 50 나노미터 μ PI를 검색할 수 있습니다. 2.5 %의 혈청 희석에서 PPE에 대한 α 2 M의 바인딩은 감지되고,이 희석은 약 900 nm의 α 1 PI 및 90 nm의 α 2 M. 포함되어 있습니다

    α 2 M, 전체 입을 타액은 20 배 차이가 9를 포함하고보다 10 배 더 α PI로 구성되어 있습니다 혈청을 달리합니다. 우리는 undiluted하는 현재의 연구에 자극 타액을 발견혈청 또는 약 1,200 nm의 α 1 PI보다 약 30 배 이하 α PI를 포함하고 약 60 nm의 α 2 M.를 포함할 것으로 예상됩니다 α-테스트를위한 최적의 타액 희석은 13% 자극 타액 것을 알았습니다,이 희석은 약 160 nm의를 포함할 것으로 예상됩니다 α PI 8 NM α 2 M, 아래의 임계값입니다 α 2 M의 농도 프로토콜의 감지. α 2 M의 낮은 농도 때문에, 그것은 정확하게 α 2 M. 경쟁에 상관없이 타액의 α 1 PI의 구체적인 활동을 결정하는 것이 가능 타액에서 활동중인 α PI 및 단백질 함량의 측정은 CD4 카운트 유동세포계측법 측정을위한 표준 방법으로 상관 관계를 발견 α PI 지수의 계산을 허용했다. 중요한 것은, 회귀 분석의 결과 (R

    CD4 열거 방법은 이전에 고려 사이클링에 의한 변형을 드렸습니다. 실용적인 관점에서 CD4 카운트는 23~27일의 주기성으로 최하점와 꼭대기 사이만큼 200 세포 / μl에 따라 다를 수 있으며, 이것은 CD4에게 3 + T 세포 측정에 관계없이 메서드의 사실이다. 진동 축은 시간으로, 주 주 일정 시간이기 때문에 따라서 진동의 사인 웨이브 축은 개인의 진정한 CD4의보다 정확한 측정 + 단 하루의 측정보다 T 세포 카운트를 제공합니다. 그것이 바로 개인의 CD4 + T 세포에 대한 진동의 축을 측정 가능하지 않을 수 있지만, 이것은 예상 진폭을 초과하지 않는 CD4 카운트에 세로 CD4의 평균 + 편차만큼이나 긴 T 셀 카운트를 사용하여 추정 할 수 있습니다. 큰 변화CD4 카운트에의 자전거가 아닌 다른 변수의 영향을 나타내는 것입니다.

    그림 2에 묘사된 회귀 선 진동 축의 추정치이다. 회귀 선 위에서 아래 예상 진폭의 계산은 진폭이 95 %의 신뢰 구간 내에 자리잡고 것으로 나타났다. 95 % 신뢰 구간과 회귀 선 사이의 평균 차이는 63 CD4 세포 / μl이며, 진폭 및 회귀 선 사이의 평균 차이 37 CD4 세포 / μl입니다. 이것은 CD4의 95 %가 이러한 차이의 약 58%는 CD4 사이클에 의한 것입니다 약 63 CD4 세포 / 실제 CD4 카운트에서 μl 내에 그 것입니다 α 테스트 측정으로부터 계산 여러가지 의미로 해석될 수 있습니다. 따라서 α-시험의 정밀도는 신뢰 구간 약 26 CD4 세포 / μl입니다 진폭 사이의 거리이며, α-테스트의 정확도는 상관 coefficie입니다0.95 또는 95 %의 회귀 선의 NT.

    가 여기에 설명된대로 α-테스트에 몇 가지 한계가 있지만 해결책은 쉽게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 비록이 설명하는 α-테스트 microplate 형식을 사용, 하나의 타액 희석을 사용하여 α-테스트를​​ 수행할 수있는 능력은 α-테스트 정신차려 기술, 악기없이, 기술적으로 간단한 시스템으로 사용할 수 있습니다. 카메룬에서 수집한 타액 샘플 중 약 2 %는 조작이 너무 점성 였는데, 이것은 뉴욕시에서 수집된 타액과 일치합니다. 이러한 샘플에 DNase의 응용 프로그램은이를 측정 10 허용 점도를 개량하다하는 데 사용할 수 있습니다. 추가로 솔루션은 특별히되므로 물 타액을 생산 parasympathetic 대 공감 경로를 통해 타액 분비를 자극 pharmacologic sialagogues를 사용할 수도 있습니다. 그 중 하나가 sialagogue는 pilocarpine 11. 마지막으로, α-시험은 없다T는 아직 확인, 이것은 성능 CD4 카운트 12 위험 수준에 대한 충분한 차별이 있는지 여부를 확인할 필요가되었습니다.

    CD4 카운트의 위험 수준이 값은 선형 알고리즘에 의해 계산되는 허용 sigmoidal 회귀 곡선의 선형 영역에 있습니다. 이 인구에서 값을 선형 회귀 <860 CD4 세포 / μl (R 2 = 0.86, N = 30, P <2x10 -7)가 sigmoidal 회귀 (R 2만큼 좋았 = 0.88, N = 30, P < 0.0001). 약 350 CD4 세포 / μl (R 2 = 0.88, N = 15, P = 0.002)가 sigmoidal 회귀 (R 2 = 0.89, n은 = 15만큼 좋았 해당하는 67 위의 α PI 지수에 대한 선형 회귀 P <0.0001). 그러나 상관 관계는 <350 CD4에게 통신을 67 아래 α PI 지수에 상당한 아니었다 세포 / μl (R 2 = 0.17, P = 0.54, N = 15). 이것은 승 이후 중요한 가치입니다호 지침은 CD4 개수 <350 CD4 세포 / antiretroviral 치료 13 액세스 한정 μl을 권장합니다. 더 α 테스트의 성능을 확인하고 낮은 값에서 감도를 개선하기 위해 추가로 800 타액 샘플은 4 그룹에서 카메룬으로 수집하고 있습니다 : 신생아-2 세, 3-5 세와 6-15 세 및 16 세 세 이상.

    결론적으로 α-검사는 혈액에서 CD4 세포의 개수에 대한 생리학 관련이 아직이를 전혀 계기로 발병 지역에서 CD4 카운트를 감시하기위한 비침 투 정확하고 정밀한 포인트의 케어 방법을 제공하는 타액을 사용하여 수행할 수 있습니다 달러 미만인 당 비용 테스트합니다.

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    Disclosures

    관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

    Acknowledgements

    연구는 해리 윈스턴 학술 진흥 재단에 의해 지원되었다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sialogogue, 0.05M citric acid Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free Lemon dropS
    Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
    Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Tissue culture-treated, 96 well microplates Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

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    References

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