测试:α-细胞快速免费的CD4计数,使用全唾液

Published 5/16/2012
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Medicine

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Summary

被描述的CD4枚举法,α测试,它采用全唾液,以提供快速,准确的CD4细胞计数。 α-测试成本便士和消除技术培训,如昂贵的试剂,单克隆抗体,仪器仪表,制冷,样品运输,以及收集和处理血液的需要。

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Bristow, C. L., Babayeva, M. A., Modarresi, R., McArthur, C. P., Kumar, S., Awasom, C., et al. The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva. J. Vis. Exp. (63), e3999, doi:10.3791/3999 (2012).

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Abstract

有负担得起的CD4枚举监测HIV疾病的迫切需要。的CD4枚举是在资源有限的地区,由于时间和温度的限制,技术复杂,试剂成本,尤其是单克隆抗体的血细胞,目前唯一可以接受的方法来衡量的CD4遥不可及。节约成本和节省时间的一种常用实验室的策略,而不是衡量某些血液值,是计算。例如,低密度脂蛋白水平计算,总胆固醇,高密度脂蛋白(HDL),甘油三酯1使用的测量水平。因此,确定无细胞的相关因素,直接调节的CD4 + T细胞可以提供一个准确的方法,计算CD4计数由于生理意义的相关因素。

进入血液,并注定要成为循环CD4 + T细胞的干细胞数量确定的趋化因子CXCL12的1ND及其受体CXCR4,由于他们对运动2的影响。此外,进入血液干细胞的运动过程调节细胞表面人类白细胞弹性蛋白酶(HLE CS)和HLE CS-反应活性α1蛋白酶抑制剂(α1有价证券,α1抗胰蛋白酶,SerpinA1)3。在HIV-1病毒病,α1 PI灭活由于疾病的进程4。 α1 PI在HIV-1疾病的早期症状类别,积极发现低于100%未经治疗的HIV-1患者(中位数= 12μM,以及达到正常水平,在对症4大类,5正常。格局已被归因于免疫灭活,不足够的合成,蛋白失活,或充氧。我们观察到,在HIV-1> 220的CD4细胞/μl的科目,CD4细胞计数了积极的α1 PI水平呈正相关(R 2 = 0.93,P&LT; 0.0001,N = 26)和无效的α1的PI(R 2 = 0.91,P <0.0001,N = 26)5。 α1的PI HIV-1感染和未感染者的管理,导致在α1 PI参与调节的CD4 + T细胞,血液中的3中的CD4计数显着增加。

与刺激,全唾液中含有足够的浆液性渗出物(血浆含有蛋白质的物质通过血管壁进入唾液传递)允许测量活性α1 PI与此测量的相关性的证据表明,它是一种精确的方法计算CD4细胞计数。简言之,如嚼口香糖或柠檬酸sialogogues刺激到整个口腔唾液,血清渗出。刺激血清渗出后,血清α1 PI唾液中的活性是衡量其能力,抑制弹性蛋白酶的活性。猪胰弹性蛋白酶(PPE)的弹性蛋白酶是一个现成的廉价来源。个人防护装备的α1有价证券结合形成一个到一个复杂的,防止切割其特定的底物,其中之一是的比色法肽,琥珀- L-丙氨酸-L-丙氨酸- L-丙氨酸-P-硝基苯胺(SA的个人防护装备3不适用)。孵化器为在室温下10分钟的个人防护装备的饱和浓度的唾液,允许个人防护装备的所有活动α1 PI唾液中的约束力。可以衡量的PPE抑制活性α1有价证券加入的PPE基板SA的3不适用。(图1)。虽然CD4细胞计数测量血容量(CD4细胞/μL),α1 PI唾液中的浓度与唾液中的血清浓度,唾液量,因为体积可以改变白天和人大大6人。然而,几乎所有的唾液中的蛋白质是由于血清含量,唾液中的蛋白质含量是测量surable 7。因此,活性α1 PI唾液中的唾液蛋白质含量的比率计算,被称为α1 PI指数。结果提出此表明,α1 PI指数提供了一个准确和精确的计算CD4细胞计数的生理方法。

Protocol

1。准备新鲜的工作方案

  1. TBS电视台:0.05 mol的Tris缓冲液,pH值7.8公司(TBS)。准备60毫升TBS /微孔板。
  2. 个人防护装备:猪胰弹性蛋白酶,1型(PPE)的暂停。摇匀,稀释约0.01 U / ml的个人防护装备在TBS。准备6毫升工作液/微孔板)。
  3. SA的3 NA:琥珀- L-丙氨酸-L-丙氨酸- L-丙氨酸-P-硝基苯胺(SA的3,NA)。准备在二甲基亚砜(DMSO)0.1 M的股票SA 3适用的解决方案,并立即使用或储存于-20°C准备6毫升工作方案/微孔板稀释股票SA 3适用的解决方案在TBS的1/100的。
  4. 考马斯蓝:准备一个股票的10%考马斯亮蓝R-250(考马斯蓝)在TBS的解决方案,并使用立即或贮存于-20°C准备6毫升工作的解决方案,通过在TBS稀释原液1/1000。

2。准备唾液

唾液收集:在站立姿势,刺激唾液置于柠檬酸或口嚼口香糖,如sialogogue血清渗出。一个无糖柠檬下降是方便的HIV-1患者频繁缺牙,无法嚼口香糖。燕子为首次3分钟需要,并收集到了接下来的3分钟的雪山杯全口唾沫。这将提供约2毫升的唾液。立即使用或储存于-80°C。
  • 唾液处理:如果冷冻,在37℃,置于冰上解冻标本。新鲜或解冻标本存放在2-4°C间不超过3天。做不涡唾液和避免吸取其中包含无血清渗出的粘液。使用标准处理唾液http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf时的注意事项。
  • 3。微孔板设置

    1. 标本:每个测试,加入终体积为150μL/孔20μL唾液。没有引入气泡移液混合。
    2. 控制:阳性对照包含个人防护装备,但没有唾液。阴性对照组中含有唾液,但没有PPE.To阳性对照,以及添加20μL的TBS电视台。到负的控制,以及添加20μL的唾液。
    3. PPE的孵育:摇个人防护装备工作的解决方案。加入50μL的个人防护装备工作的解决方案,以每口井不包括阴性对照井。阴性对照井,添加50μL的TBS电视台。在23°C孵育10分钟
    4. 底物孵育:3 SA的50μL,无工作的解决方案,以每口井。在23°C孵育45分钟
    5. 考马斯蓝:50μL考马斯蓝工作液添加</ LI>
    6. READ-酶标仪读取吸光度,405纳米检测SA的3无乳沟代表积极α1 PI和一个595 nm的检测考马斯亮蓝蛋白质含量。

    4。计算α1的PI指数

    1. 正常化的平均405 nm 595 nm处 :对于每个一式三份,计算平均值。从样本平均减去负控制平均水平。为了最大限度地减少板对板的变化,规范的平均值除以平均每个标本阳性对照平均如下:

    式(1)

    1. 计算α1有价证券INEX:除以归归一个595纳米405纳米


    5。代表结果

    以确定是否α测试可能适合使用作为保健点的筛选试验,监测CD4细胞计数在地方病,资源有限的地区,刺激唾液收集了20位女性和11位男性的HIV-1受试者参加诊所在喀麦隆的日常护理。与α测试使用唾液收集在纽约市的发展过程中的初步意见是一致的,在喀麦隆与CD4细胞计数(R 2 = 0.91,P <0.0001,N = 31)相关的α1 PI指数在唾液收集。关系的定义是由3个参数的S形曲线,具有剂量-反应关系(图2A)是一致的。 95%的信心和预测区间描绘蓝色和红色的线,分别为(图2B)。

    在先前的研究中,我们确定的CD4 + T细胞表现出正弦循环周期23±3.5天在HIV-1科目,并在继承的版本与α1有价证券投资不足(PIZZ)3科目。此处所描述的是一个计算机生成的正弦曲线分析骑自行车在非HIV-1健康展出27天的周期(图3A)控制的CD4代表性的例子。

    计算机生成的正弦曲线分析的CD4 + T细胞的变化,在6个科目取得了峰-峰幅度和振荡3轴的值。正如所预料的,振荡轴与振幅(R 2 = 0.96,P = 0.009,N = 6)( 图3B)。在患者低的CD4 T细胞计数,CD4 + T细胞计数的周期性变化较小,在高CD4 + T细胞计数的患者,周期性变化大。

    因为在图2所示的回归线估计振荡和振荡轴的轴与振幅,振幅可以计算的回归,从而估计多远的上方和下方的回归线CD4 + T细胞,将有望因自行车( 图3C)。叠加图3c图2B计算置信区间的幅度计算,人们发现,在于95%的幅度(绿线)内的置信区间(蓝线)( 图3D)。

    图1
    图1。程序简介:口广场柠檬酸和收集唾液。新增摊薄唾液微孔板一式三份的水井。新增个人防护装备,以每口井,并在23°C孵育15分钟添加PPE基板每口井,并在23°C孵育45分钟。加入考马斯亮蓝和读取在405 nm检测个人防护装备的活动,并在595 nm处检测蛋白。

    图2
    图2。 α测试比较标准的CD4枚举法。一)α测试是由定量刺激的全口唾液中的α1 PI指数。医疗使用标准的流式细胞仪由一个独立的实验室进行CD4细胞计数。流式细胞仪和唾液,血液被收集在同一诊。由三参数S形曲线(R 2 = 0.91,P <0.0001,N = 31),B)95%的信心和预测区间在蓝色和红色描绘的α1 PI指数和CD4细胞计数之间的关系被定义线,分别。

    图3
    图3。精度计算的CD4Ç使用的α1PIIndex.A的ounts)的CD4 + T细胞具有非HIV-1健康控制在27天周期的正弦循环。描绘振荡轴(红色虚线)B)计算机生成的CD4 T细胞循环4 HIV-1的科目是用来计算的峰-峰值的幅度和振荡轴,非HIV-1的正弦波分析-1 PIzz主体,非HIV-1健康对照A部分描述的CD4之间的关系的T +细胞的幅度和振荡轴的定义是由3个参数的S形曲线(R 2 = 0.96,P = 0.009,N = 6),C)B部分)的振荡幅度和轴之间的S形关系被用来计算预期的振幅沿回归线(黑线)从图2点(绿线)D)预期幅度间隔(绿线)从95%置信区间显着差异(蓝线)曼惠特尼秩和检验(中位数95%的置信区间和回归线(63细胞/μL之间的差异比较基础)之间的振幅线,回归线(37细胞中位数差异决定/μL),P = 0.001)。

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    Discussion

    未稀释的血清中含有的中位数为36μM的α1 PI和3.6微米α2巨球蛋白(α2米 ),10倍的差异8。这两种蛋白质的竞争结合个人防护装备。利用这两个特点,浓度和个人防护装备的亲和力,已发展出一种方法,是专门测量在正常血清中存在竞争α2米 8α1有价证券。这种方法可以在0.3%血清检测低至50纳米μ1有价证券。在血清稀释度为2.5%,α2米个人防护装备的结合成为不到,这种稀释包含约900纳米α1 PI和90纳米α2 M。

    相比之下血清组成的10倍以上,α1的PI比α2米 ,整个口腔唾液中含有20倍的差距9。我们在目前的研究发现,稀释,刺激唾液包含约30倍的α1比血清或约1200纳米α1有价证券有价证券,预计将包含约60 nm的α2 M。 α测试的最佳唾液稀释被认为是13%,刺激唾液,稀释预计将包含约160纳米α1 PI和8 nm的α2,2米 α浓度低于阈值在协议的检测。由于低浓度的α2米 ,它是可以准确地确定唾液中的α1有价证券的具体活动不关心从α2研究的竞争活性α1 PI和唾液中蛋白质含量的测量允许的α1 PI指数,该产品被发现关联与CD4细胞计数,流式细胞仪测量的标准方法计算。重要的是,回归分析的结果(R

    CD4枚举方法以前没有考虑到的变化,是由于循环。在实际应用中,CD4细胞计数可以由多达200个细胞/μL的最低点和顶点之间的23-27天的周期变化,这是正确的方法测量CD4 + T细胞3。因此,正弦波振荡轴提供了一个更准确的测量一个人的真正的CD4 + T细胞计数比单一天的措施,因为振荡轴是不变小时小时,每个星期。虽然它可能是不可行的直接衡量一个人的CD4 + T细胞的振荡轴,这可以在CD4细胞计数平均纵向CD4 + T细胞计数作为变化只要不超过预期的幅度估计。大变化在CD4细胞计数的s就表示比骑自行车以外的其他变量的影响。

    回归线图2所示是一个振荡轴的估计。回归直线的上方和下方的预期幅度的计算结果表明,幅度在95%置信区间。中位数95%的置信区间和回归线之间的区别是63 CD4细胞/μL,幅度和回归线之间的区别是中位数37 CD4细胞/微升。这可以解释为,95%的CD4计数从α测试测量计算,将在约63实际的CD4计数CD4细胞/微升,而这种差异约58%是由于向CD4循环。因此,α测试精度的置信区间和幅度​​,这是约26 CD4细胞/μL之间的距离,α测试的准确性是相关coefficieNT是0.95或95%的回归线。

    本文所述的α测试有许多限制,但都是现成的解决方案。例如,即使α-试验使用的微孔板格式,能够执行的α测试,使用单一的唾液稀释允许使用α测试试纸技术,仪器,技术简单的系统。约2%,在喀麦隆收集唾液样本操作过于粘稠,唾液收集在纽约市,这是一致的。这些样本的DNase的应用可用于改善粘度,从而允许测量10。另外一个解决方案可能是使用药物的sialagogues,特别是通过副交感神经与交感神经通路,从而产生水汪汪的唾液刺激唾液分泌。这样一个催涎剂是罗卡11。最后,α测试有没有ţ尚未得到证实,这是必要的,以确定性能是否有足够的歧视性的CD4细胞计数的临界水平12。

    CD4细胞计数的临界水平,在允许这些值计算线性算法的S型回归曲线的线性区域。在这一人群中,线性回归值小于860的CD4细胞/μL(R 2 = 0.86,N = 30,P <2X10 -7)S形回归(R 2 = 0.88,N = 30,P < 0.0001)。线性回归,为α1的PI指数高于67,这 ​​相当于约350 CD4细胞/μL(R 2 = 0.88,N = 15,P = 0.002)的S形回归(R 2 = 0.89,N = 15的好P <0.0001)。然而,相关α1有价证券指数低于67,这 ​​相当于<350的CD4明显的细胞/μL(R 2 = 0.17,P = 0.54,N = 15)。这是因为W的临界值何指引建议CD4细胞计数<350 CD4细胞/μL资格获得抗逆转录病毒治疗13。为了更好地确定α测试的性能,并改善在较低值的敏感性,一个额外的800唾液样本正在收集4组喀麦隆:新生儿的2岁,3-5岁和6-15岁和16岁以上。

    α测试的结论,是生理有关的血液中的CD4细胞数量,还可以使用唾液,从而提供了一种无创,准确和精确的点保健监测CD4细胞计数在流行地区,在没有仪器的方法成本每不到一美元的测试。

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    Disclosures

    没有利益冲突的声明。

    Acknowledgements

    研究是由哈利·温斯顿研究基金会的支持。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sialogogue, 0.05M citric acid Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free Lemon dropS
    Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
    Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Tissue culture-treated, 96 well microplates Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

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    References

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