α-テスト:全唾液を用いた迅速な無細胞CD4列挙

Published 5/16/2012
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Medicine

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Summary

CD4列挙法、α-テストは、迅速かつ正確なCD4 + Tリンパ球数を提供するために唾液を使用していますが記載されている。 α-テストコストのペニーと技術トレーニングなど、モノクローナル抗体、計測機器、冷凍、サンプルの輸送と同様に、血液の収集と処理などの高価な試薬の必要がなくなります。

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Bristow, C. L., Babayeva, M. A., Modarresi, R., McArthur, C. P., Kumar, S., Awasom, C., et al. The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva. J. Vis. Exp. (63), e3999, doi:10.3791/3999 (2012).

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Abstract

Protocol

1。新鮮なワーキング溶液を調製

  1. TBS:0.05 MトリスpHは7.8(TBS)、緩衝生理食塩水。 60ミリリットルTBS /マイクロプレートを準備します。
  2. PPE:ブタ膵臓エラスターゼ、タイプ1(PPE)は、懸濁液として提供されています。よく振って約0.01 U / mlのTBSでPPEを希釈する。 6ミリリットルワーキング溶液/プレート)を準備します。
  3. SA 3 NA:スクシニル-L-Alaの-L-Alaの-L-Alaの-p-ニトロアニリド(SA 3 NA)。ジメチルスルホキシド(DMSO)に0.1 M株式SA 3 NA溶液を調製し、-20℃で直ちに使用するか、または保存する株式SA 3 NA溶液をTBSで1/100に希釈して6ミリリットルワーキングソリューション/マイクロプレートを準備します。
  4. クーマシーブルー:TBS 10%クーマシーブリリアントブルーR-250(シーブルー)のストック溶液を調製し、-20℃で直ちにまたはストアを使用しTBSに原液1/1000希釈して6ミリリットル作業溶液を調製します。

2。唾液を準備します。

唾液採取:立った姿勢では、このような口の中でクエン酸またはチューインガムとして唾液分泌促進薬を配置することによって、唾液中に血清滲出を刺激する。無糖レモンドロップは頻繁に歯と歯茎をかむことができないHIV-1患者のために便利です。最初の3分間、必要に応じて飲み込むと、次の3分間に覆われたカップに口全体に唾液を収集します。これにより、唾液の約2ミリリットルを提供します。 -80℃で直ちに使用や保管℃、
  • 唾液処理:37℃で凍結、融解試料℃、氷上に置いた場合。 2月4日で新鮮なまたは融解試料を保存°C 3日間を超えない。渦唾液をないし、血清滲出液が含まれていませんムチンピペッティングは避けてください。唾液取り扱う際には標準予防策を使用してhttp://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdfを
  • 3。マイクロプレートのセットアップ

    1. 検体:各テストによく、150μl/ウェルの最終容量20μLの唾液に追加されます。気泡を導入することなく、ピペッティングにより混和する。
    2. コントロール:陽性対照PPEが含まれていません、しかし、唾液。ネガティブコントロールは、唾液が含まれていますが、よくないPPE.To陽性対照は20μLTBSが追加されません。ネガティブコントロールによく20μLの唾液に追加されます。
    3. PPEのインキュベーション:PPEワーキング溶液をよく振ってください。よくネガティブコントロールのウェルを除く各50μLPPEワーキングソリューションを追加します。ネガティブコントロールのウェルに、50μLのTBSを追加します。 23℃で10分間インキュベートする。
    4. 基板のインキュベーション:各ウェルに50μLSA 3 NAワーキングソリューションを追加します。 23℃で45分間インキュベート
    5. クーマシーブルー:50μLクーマシーブルーワーキングソリューションを追加する</ LI>
    6. 読出し:タンパク質含有量を表してクーマシーブルーを検出するためにアクティブなα1 PIおよび595 nmを表すSA 3 NAの切断を検出するためにマイクロプレートリーダー、405 nmで吸光度を測定します。

    4。 α1 PI指数を計算する

    1. 平均 405 nm 595 nmの正規化 :それぞれの三重は、平均を計算します。標本平均値から陰性コントロールの平均値を減算します。プレートからプレートの変動を​​最小限に抑えるために、次のようにポジティブコントロールの平均値によって、各標本の平均値で割って平均値を正規化する。

    式(1)

    1. α1 PI INEXを計算します。正規化された595 nmの正規化405 nmで割ります


    5。代表的な結果

    風土病、資源の限られた地域でのCD4数を監視するためのポイントオブケアのスクリーニングテストとしてα-テストでは、使用に適している可能性があるかどうかを決定するために、刺激唾液は、20の女性から採取されたと11男性のHIV-1の被験者参加診療所のためにカメルーンのルーチンケア。ニューヨーク市で収集した唾液を用いたα-テストの開発時には予備的観察と一致し、唾液中のα1 PI指数は、CD4数(R 2 = 0.91、P <0.0001、N = 31)と相関してカメルーンで収集された。関係は、用量反応関係(図2A)と一致している3パラメータシグモイド曲線によって定義されています。 95%の信頼区間と予測区間は、それぞれ青と赤の線(図2B)に描かれています。

    で以前の研究で、我々は、CD4 + T細胞は周期23の正弦波サイクリング±HIV-1患者におけるα1 PIの欠乏(PIZZ 3)の継承したバージョンの被験者で3.5日を示すことが判明しました。描かれた本書は、27日周期(図3A)を示す非HIV-1健康なコントロールでサイクリングCD4のコンピュータで生成された正弦曲線分析の代表例である。

    CD4 + 6科目のT細胞の変化をコンピュータで生成された正弦曲線の分析は、ピーク·ツー·ピーク振幅と振動の3軸の値が得られた。期待されるように、振動の軸は振幅と相関した(r 2 = 0.96、P = 0.009、n = 6)は( 図3B)。患者のする低CD4 T +細胞数は、CD4 T細胞数の周期的変化は小さかった、高いCD4 + T細胞数の患者では、周期的な変化が大きかった。

    から図2に示した回帰直線は、振動と振動の軸の軸は振幅がために変化することにより、回帰直線のCD4 + T細胞が予想されるどのくらいの上下に推定する回帰直線を計算することができ、振幅と相関していると推定サイクリング( 図3C)。図3C及び図2Bに計算された信頼区間で計算された振幅重ね合わせ、その振幅は(緑線)95%以内であることが判明した信頼区間(青線)( 図3D)。

    図1
    図1。手順の概要:口の中に置き、クエン酸と唾液を収集します。三重のマイクロプレートのウェルに希釈した唾液を追加します。各ウェルにPPEを追加し、23℃で15分間インキュベート各ウェルにPPE基板を追加し、23℃で45分間インキュベート。クマシーブルーを追加して、PPEのアクティビティを検出し、595 nmでタンパク質を検出するために405nmで読み取る。

    図2
    図2。標準的なCD4列挙法によるα-テストの比較。 A)α-テスト刺激全体の口の唾液中にα1 PI指数を定量することにより行った。 CD4数は、標準的なフローサイトメトリーを用いて独立した医療研究室で行った。フローサイトメトリーと唾液の血液は、同じ診療所の訪問で集めた。 B)95%信頼区間と予測区間は、青と赤で描かれているα1 PI指数とCD4数が3パラメータシグモイド曲線(R 2 = 0.91、P <0.0001、N = 31)で定義されています。との関係それぞれの行、。

    図3
    図3。計算CD4の精度は、Cα1PIIndex.Aを使用してounts)は、CD4 + T細胞は、非HIV-1健常対照の27日周期の正弦波サイクリングを示した。振動の軸が描かれている(赤い点線)。B)T細胞の循環が4 HIV-1の被験者において振動のピーク·ツー·ピーク振幅と軸を計算するために使用されたCD4、1非感染のコンピュータ生成された正弦波の解析-1 PIzzの件名、および部品AにCD4との関係を示した非HIV-1健常対照T +細胞の振幅と振動の軸は3つのパラメータシグモイド曲線(R 2 = 0.96、P = 0.009、nで定義されています= 6)。C)パートB)で得られた振動の振幅と軸の間にS字型の関係は図2の回帰直線(黒線)に沿った点の予想される振幅(緑線)を計算するために使用されていました。D)予想される振幅間隔(緑線)は95%信頼区間(から有意に異なっていたとしてマンホイットニー順位和検定と振幅線と回帰直線(37セル間の中央値の差(95%信頼区間と回帰直線(63個/μLの間の中央値の差の比較に基づく)によって決定された青線) /μl)を、P = 0.001)。

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    Discussion

    原液血清は、中央値36μMを含むα1 PIおよび3.6μMα2マクログロブリン(α2 M)の10倍の差が8。両方のタンパク質は、PPEへの結合について競合します。これら二つの特性、濃度、PPE親和性は、特にM 8α2、競合の存在下で正常な血清中のα1 PIを測定することができる方法を開発するために利用されています。このメソッドは、0.3%の血清中ではわずか50 nMのμ1 PIを検出することができます。 2.5%の血清希釈で、PPEへのα2 Mの結合は検出されなくなり、この希釈は、約900nmのα1 PIと90 nmのα2 Mを含まれています

    α2 Mより10倍以上のα1 PIで構成されている血清とは対照的に、全体の口の唾液は、20倍の差が9を含んでいます。我々は、刺激唾液、原液ことが、本研究で見いだされた血清または約1200nmのα1 PIよりも約30倍未満のα1 PIが含まれており、約60 nMのα2 Mを含むことが期待されるαテストに最適な唾液の希釈は13%刺激唾液であることが判明したし、この希釈は、約160 nmを含むことが期待されるα1 PIと8 nmのα2 M、閾値以下であるα2 Mの濃度プロトコルの検出。 α2 Mの低濃度のために、それは正確にα2 Mから競争を気にせず、唾液中のα1 PIの特定のアクティビティを決定することが可能です。唾液中のアクティブなα1 PIとタンパク質含有量の測定は、CD4数、フローサイトメトリーを測定するための標準的な方法と相関することが発見されたα1 PI指数の計算を可能にした。重要なのは、回帰分析の結果(R

    CD4列挙メソッドは、以前に考慮サイクリングによるものである変動を受けていない。具体的には、CD4数が23から27日間の周期で天底と頂点の間に限り200細胞/μlによって異なる場合がありますが、これは関係なく、CD4 + T細胞3を測定する方法にも当てはまります。振動の軸は、時間に週に週一定時間であるため、このように、振動の正弦波の軸は、個々の真のCD4のより正確な測定値+ 1日の測定値より、T細胞の数を提供します。それが直接、個々のCD4 + T細胞のための振動の軸を測定することが可能でないかもしれませんが、これは予想される振幅を超えないCD4数で縦CD4の平均値+変動限り、T細胞の数を用いて推定することができます。大変動sはCD4数でサイクリング以外の変数の影響を示すことになる。

    図2に示した回帰直線は、振動の軸の推定値です。回帰直線の上下に予想される振幅の計算は、振幅が95%の信頼区間内にあることを示した。 95%の信頼区間と回帰直線との間の中央値の差は63 CD4細胞/μlであり、振幅と回帰直線との間の中央値の差は37 CD4細胞/μlです。これは、実際のCD4 + Tリンパ球数から、この差の約58%がCD4サイクルに起因するだろうその約63 CD4細胞/μl以内になりCD4の95%がαテストの測定値から計算されたカウントことを意味すると解釈することができます。したがって、αテストの精度は約26 CD4細胞/μlである信頼区間と振幅の間の距離であり、αテストの精度は、相関coefficieです。0.95または95%であり、回帰直線のNT。

    そこに本明細書に記載されるようαテストにはいくつかの制限がありますが、解決策は容易に入手可能である。たとえば、説明したα-テストでは、マイクロフォーマットを使用していても、単一の唾液の希釈を用いてα-テストを実行する能力は、ディップ技術、楽器フリー、技術的にシンプルなシステムで使用されるα-テストすることができます。カメルーンで収集した唾液サンプルの約2%が操作するにはあまりにも粘性であったが、これはニューヨーク市で収集した唾液と一貫性があります。このようなサンプルにDNaseのアプリケーションは、測定10を許可することにより、粘度を改善するために使用することができます。追加のソリューションは、特にそれによって水の唾液を生産する副交感神経に対する交感神経経路を介して唾液の分泌を刺激する薬理学的sialagoguesを使用するかもしれません。そのような唾液分泌促進薬はピロカルピン11です。最後に、α-テストはありませんtはまだ検証され、このパフォーマンスはCD4数12の重要なレベルの十分に差別的であるかどうかを判断する必要がありますされた。

    CD4 + Tリンパ球数の重要なレベルは、これらの値は線形アルゴリズムで計算することが許可されてS字状の回帰曲線の線形領域である。この集団では、値の線形回帰<860 CD4細胞/μl(R 2 = 0.86、N = 30、p <2×10 -7)はシグモイド回帰(R 2と同様に良好であった= 0.88、N = 30、P < 0.0001)であった。約350 CD4細胞/μl(R 2 = 0.88、N = 15、P = 0.002)はシグモイド回帰(R 2 = 0.89、N = 15、と同様に良好であったに相当する67上記α1 PI指数のための線形回帰p <0.0001)であった。しかし、相関関係が<350のCD4細胞/μl(R 2 = 0.17、P = 0.54、N = 15)に相当する67以下のα1 PI指数では有意ではなかった。これはW以来、重要な値です。HOのガイドラインは、CD4数<350のCD4細胞/抗レトロウイルス療法13へのアクセスのために修飾するために添加することをお勧めします。優れたα-テストのパフォーマンスを決定すると低い値での感度を改善するために、追加の800唾液のサンプルは、4つのグループからカメルーンで収集されています:新生児2歳、3〜5歳と6から15歳と16歳と古い。

    結論としては、αテストは、血液中のCD4細胞数に生理学的に関連しているまだそれによって全くインストルメンテーションで流行地域におけるCD4 + Tリンパ球数を監視するための非侵襲的、正確かつ精密なポイントオブケアの方法を提供する唾液を用いて行うことができます。ドル未満のコストあたりのテスト。

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    Disclosures

    利害の衝突が宣言されません。

    Acknowledgements

    研究では、ハリーウィンストン研究財団によってサポートされていました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sialogogue, 0.05M citric acid Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free Lemon dropS
    Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
    Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Tissue culture-treated, 96 well microplates Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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