La α-test: Rapid cell-free CD4 Enumeration Uso Saliva Whole

Published 5/16/2012
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Medicine

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Summary

Un metodo enumerazione CD4, la α-test, viene descritto che utilizza saliva intera per fornire rapidi e precisi conta di CD4. Le α-test centesimi i costi ed elimina la necessità di una formazione tecnica, reagenti costosi come gli anticorpi monoclonali, strumentazione, refrigerazione, trasporto dei campioni, nonché di raccolta e trattamento del sangue.

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Bristow, C. L., Babayeva, M. A., Modarresi, R., McArthur, C. P., Kumar, S., Awasom, C., et al. The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva. J. Vis. Exp. (63), e3999, doi:10.3791/3999 (2012).

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Abstract

Vi è un urgente bisogno di conteggio CD4 a prezzi accessibili per monitorare la malattia da HIV. Conteggio CD4 è fuori portata nelle regioni a causa del tempo e le limitazioni di temperatura, sofisticazione tecnica, e il costo dei reagenti risorse limitate, in particolare per misurare gli anticorpi monoclonali CD4 sulle cellule del sangue, l'unico metodo attualmente accettabile. Un laboratorio comunemente utilizzati risparmio di costi e risparmio di tempo strategia è quella di calcolare, piuttosto che i valori ematici certa misura. Per esempio, livelli di LDL sono calcolati utilizzando i livelli misurati di colesterolo totale, HDL, e trigliceridi 1. Pertanto, l'identificazione di cellule libere correlati che regolano direttamente il numero di cellule T CD4 + potrebbe fornire un metodo preciso per calcolare CD4 per l'importanza fisiologica dei correlati.

Il numero di cellule staminali che entrano sangue e sono destinate a diventare circolanti cellule CD4 + T è determinata dalla chemiochina uno CXCL12nd suo recettore CXCR4 per la loro influenza sulla locomozione 2. Il processo di locomozione di cellule staminali nel sangue viene ulteriormente regolata dalla cellula umana superficie dei leucociti elastasi (HLE CS) e la CS-reattivo HLE attivo α 1 inibitore della proteinasi (α 1 PI, α 1 antitripsina, SerpinA1) 3. In malattia da HIV-1, α 1 PI è inattivato a causa di processi patologici 4. Nei primi categorie asintomatici di HIV-1 malattia, attiva α 1 PI è risultata inferiore normale in 100% di non trattati pazienti HIV-1 (mediana = 12 pM, e per ottenere livelli normali durante le categorie sintomatici 4, 5. Questo modello è stata attribuita a inattivazione immune, non alla sintesi insufficiente, inattivazione proteolitica, o ossigenazione. Abbiamo osservato che in HIV-1 soggetti con> 220 cellule CD4 / microlitro, CD4 sono stati correlati con i livelli sierici di accesso α 1 PI (r 2 = 0.93, p &lt; 0.0001, n = 26) e gli inattivi α 1 PI (r 2 = 0.91, p <0.0001, n = 26) 5. La somministrazione di α 1 PI per HIV-1 i soggetti infetti e non infetti portato a un drastico incremento nella conta dei CD4 suggeriscono α 1 PI partecipa alla regolazione del numero di cellule T CD4 + nel sangue 3.

Con la stimolazione, la saliva contiene tutto sufficiente essudato sieroso (plasma contenente materiale proteico che passa attraverso le pareti dei vasi sanguigni nella saliva) per consentire la misurazione delle attività α 1 PI e la correlazione di questa misura è la prova che si tratta di un metodo preciso per calcolare il numero di CD4. Brevemente, sialogogues come gomma da masticare o acido citrico stimolare l'essudazione di siero in saliva intera bocca. Dopo stimolando essudazione siero, l'attività di siero α 1 PI in saliva è misurata dalla sua capacità di inibire l'attività elastasi. Suina elastasi pancreatica (PPE)è facilmente disponibile una fonte economica di elastasi. PPE lega α 1 PI formando uno-a-uno complesso che impedisce PPE di scindere i suoi substrati specifici, uno dei quali è il peptide colorimetriche, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Incubazione saliva con una concentrazione di saturazione di PPE per 10 min a temperatura ambiente consente il legame di PPE a tutti attivo α 1 PI nella saliva. L'inibizione di PPE risultante dalla attivo α 1 PI può essere misurata aggiungendo il substrato PPE SA 3 NA. (Figura 1). Sebbene CD4 sono misurate in termini di volume di sangue (cellule CD4 / pl), la concentrazione di α 1 PI nella saliva è correlata alla concentrazione di siero in saliva, non al volume di saliva dal volume può variare notevolmente durante il giorno e persona a persona 6. Tuttavia, quasi tutte le proteine ​​nella saliva è dovuto al contenuto di siero, e il contenuto di proteine ​​della saliva è measurable 7. Così, attivo α 1 PI in saliva viene calcolato come rapporto al contenuto proteico e saliva viene chiamata α 1 Index PI. I risultati qui presentati dimostrano che la α 1 Index PI fornisce un metodo accurato e preciso fisiologico per il calcolo CD4.

Protocol

1. Preparare freschi soluzioni di lavoro

  1. TBS: 0,05 M Tris Buffered Saline, pH 7.8 (TBS). Preparare 60 ml TBS / micropiastra.
  2. PPE: elastasi pancreatica suina, di tipo 1 (PPE) viene fornito come sospensione. Agitare bene e diluire DPI in TBS a circa 0,01 U / ml. Preparare 6 ml soluzione di lavoro / micropiastra).
  3. SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Preparare 0,1 M magazzino SA 3 soluzione NA in dimetilsolfossido (DMSO) e utilizzare immediatamente o conservare a -20 ° C. Preparare 6 ml di soluzione di lavoro / micropiastra diluendo magazzino SA 3 soluzione NA 1/100 in TBS.
  4. Coomassie Blue: Preparare una soluzione stock del 10% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie Blue) in TBS e utilizzare immediatamente o conservare a -20 ° C. Preparare 6 ml di soluzione di lavoro diluendo la soluzione stock 1/1000 in TBS.

2. Preparare Saliva

Prelievo della saliva: Nella posizione eretta, stimolare essudazione siero in saliva inserendo un sialogogue come acido citrico o gomma da masticare in bocca. A sugar-free goccia di limone è utile per i pazienti HIV-1 che sono spesso edentulo e incapaci di masticare gomma. Ingoiare come necessario per i primi 3 min, e raccogliere la saliva tutta la bocca in una tazza con tappo per il prossimo 3 min. Ciò fornirà circa 2 ml di saliva. Utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C.
  • MANIPOLAZIONE SALIVA: Se congelato, campione scongelare a 37 ° C e il luogo su ghiaccio. Conservare campione fresco o scongelato a 2-4 ° C non più di 3 giorni. Sei la saliva non vortex ed evitare pipettaggio mucina che non contiene essudato siero. Usate Precauzioni standard quando si maneggia saliva http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .
  • 3. Microplate Set-up

    1. CAMPIONI: a ciascun pozzetto, si aggiungono 20 pl saliva per un volume finale di 150 pl / pozzetto. Mescolare pipettando senza introdurre bolle.
    2. CONTROLLI: Il controllo positivo contiene PPE, ma non saliva. Il controllo negativo contiene saliva, ma non PPE.To controllo positivo viene aggiunto 20 pl TBS. Per il controllo negativo si aggiunge saliva 20 pl.
    3. INCUBAZIONE PPE: Agitare la soluzione PPE funziona bene. Aggiungere 50 microlitri soluzione di lavoro DPI ad ogni pozzetto esclusi i pozzetti di controllo negativi. Ai pozzetti di controllo negativo, aggiungere 50 ul TBS. Incubare 10 minuti a 23 ° C.
    4. INCUBAZIONE SUBSTRATO: Aggiungere 50 microlitri SA 3 soluzione NA lavorando per ciascun pozzetto. Incubare 45 minuti a 23 ° C.
    5. Coomassie Blue:. Aggiungere 50 microlitri soluzione di Coomassie Blu di lavoro </ Li>
    6. READ-OUT: Leggere l'assorbanza in lettore di micropiastre, A 405 nm per rivelare SA 3 scissione NA che rappresenta attiva α 1 PI e A 595 nm per rivelare Coomassie blu che rappresenta il contenuto proteico.

    4. Calcolare α 1 Indice PI

    1. NORMALIZE DELLA MEDIA A 405 nm e 595 nm: per ogni triplice copia, calcolare la media. Sottrarre la media di controllo negativo dalla media del campione. Per ridurre al minimo piastra-to-plate variazione, normalizzare le medie dividendo ogni media per la media del campione di controllo positivo come segue:

    Equazione 1

    1. CALCOLA IL α 1 PI INEX: Dividere la normalizzato A 405 nm dai normalizzati A 595 nm:


    5. Risultati rappresentativi

    Per determinare se l'α-test potrebbe essere adatto per l'utilizzo come point-of-care test di screening per monitorare la conta CD4 in endemiche, risorse limitate regioni, saliva stimolata è stato raccolto da 20 femmine e 11 maschi HIV-1 ambulatorio per i soggetti partecipanti trattamento di routine in Camerun. Coerentemente con le osservazioni preliminari durante lo sviluppo del α-test con saliva raccolti in New York City, l'α 1 Indice PI nella saliva raccolti in Camerun correlato con conta dei CD4 (R 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). Il rapporto è stato definito da un 3-parametro curva sigmoidale che è coerente con una relazione dose-risposta (Figura 2A). La fiducia del 95% e intervalli di previsione sono rappresentati con linee blu e rosse, rispettivamente (Figura 2B).

    Inuno studio precedente, abbiamo determinato che cellule T CD4 + mostrano ciclismo sinusoidale con frequenza di 23 ± 3,5 giorni in soggetti HIV-1 e nei soggetti con la versione ereditata della α 1 PI deficit (PIZZ) 3. Qui raffigurato è un esempio rappresentativo di computer-generated analisi della curva sinusoidale di CD4 in bicicletta in un non-HIV-1 di controllo sano espone periodicità 27 giorni (Figura 3A).

    Computer-generated analisi curva sinusoidale delle CD4 + cambiamenti cellule T in 6 soggetti ha prodotto valori di picco-picco di ampiezza e l'asse di oscillazione 3. Come sarebbe previsto, l'asse di oscillazione è stata correlata con ampiezza (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (Figura 3B). Nei pazienti a basso T CD4 + conta cellulare, i cambiamenti ciclici della conta delle cellule T CD4 erano piccoli, e nei pazienti con CD4 + alta conta di cellule T, i cambiamenti ciclici erano grandi.

    Poiché l'linea di regressione illustrato nella figura 2 stima l'asse di oscillazione e l'asse di oscillazione è correlata con ampiezza, ampiezza può essere calcolato per la linea di regressione quindi stimare quanto sopra e sotto le CD4 + linea di regressione cellule T ci si aspetterebbe per variare a causa ciclismo (Figura 3C). Sovrapponendo l'ampiezza calcolato in Figura 3C e l'intervallo di confidenza calcolato nella figura 2B, è stato constatato che ampiezza (linea verde) si trova all'interno del 95% dell'intervallo di confidenza (linea blu) (Figura 3D).

    Figura 1
    Figura 1. Procedura sommaria: acido citrico Luogo in bocca e raccogliere la saliva. Aggiungi saliva diluito nei pozzetti di una micropiastra in triplice copia. Aggiungi PPE a ciascun pozzetto e incubare per 15 min a 23 ° C. Aggiungere il substrato PPE in ogni pozzetto e incubare per 45 min a 23 ° C. Aggiungere Coomassie Blue e letta a 405 nm per rilevare l'attività di PPE e a 595 nm per rivelare proteina.

    Figura 2
    Figura 2. Confronto della α-test con il metodo standard di enumerazione CD4. A) L'α-test è stato eseguito quantificare la α 1 Index PI in stimolato saliva intera bocca. Conta dei CD4 sono stati eseguiti da un laboratorio indipendente medica che utilizza standard di citometria a flusso. Sangue per citometria a flusso e saliva sono stati raccolti durante la visita stessa clinica. Il rapporto tra l'indice α 1 PI e conta dei CD4 è stato definito da una curva a 3 parametri sigmoidale (r 2 = 0.91, p <0.0001, n = 31). B) La fiducia del 95% e intervalli di previsione sono raffigurati in blu e rosso linee, rispettivamente.

    Figura 3
    Figura 3. Precisione di calcolo CD4 counts utilizzando il Index.A α1PI) cellule CD4 + T esposto ciclismo sinusoidale con periodicità 27 giorni in un non-HIV-1 di controllo sano. L'asse di oscillazione è raffigurato (rosso linea tratteggiata). B) calcolatore generati analisi sinusoide di CD4 è stato usato bicicletta cellule T per calcolare il picco-picco di ampiezza e l'asse di oscillazione in 4 soggetti HIV-1, 1 non-HIV -1 Pizz soggetto, e la non-HIV-1 di controllo sano raffigurato nella parte A. Il rapporto tra T CD4 + ampiezza delle cellule e l'asse di oscillazione è stato definito da 3-parametro curva sigmoidale (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) Il rapporto tra ampiezza e sigmoidale asse di oscillazione derivato in parte B) è stato utilizzato per calcolare l'ampiezza atteso (linea verde) di punti lungo la linea di regressione (linea nera) dalla Figura 2. D) L'ampiezza prevista intervallo (linee verdi) è stata significativamente diversa da l'intervallo di confidenza al 95% (linee blu) come determinato dalla somma di Mann-Whitney Rank Test (basato su un confronto tra la differenza mediana tra l'intervallo di confidenza 95% e la linea di regressione (63 cellule / mL) e la differenza tra la linea mediana ampiezza e la linea di regressione (37 cellule / pl); p = 0,001).

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    Discussion

    Non diluito siero contiene mediana 36 uM α 1 PI e 3,6 uM α 2 macroglobulina (α 2 M) una differenza di 10 volte 8. Entrambe le proteine ​​competono per il legame ai DPI. Queste due caratteristiche, concentrazione e PPE affinità, sono stati sfruttati per sviluppare un metodo che sia in grado di misurare specificamente α 1 PI nel siero normale in presenza di competere α 2 M 8. Questo metodo in grado di rilevare un minimo di 50 μ nM 1 PI nello 0,3% di siero. Ad una diluizione del siero del 2,5%, il legame di α 2 M ai DPI diventa inosservabile, e questa diluizione contiene circa 900 nM α 1 PI e 90 nM α 2 M.

    In contrasto con siero che si compone di più di 10 volte α 1 PI di α 2 M, saliva bocca intero contiene un 20-volte differenza 9. Abbiamo trovato in questo studio che non diluito, saliva stimolatacontiene approssimativamente 30 volte meno α 1 PI di siero o circa 1200 nm α 1 PI e ci si aspetterebbe per contenere circa 60 nM α 2 M. La diluizione saliva ottimale per la α-test è risultato essere 13% saliva stimolata, e questa diluizione ci si aspetterebbe per contenere circa 160 nM α 1 PI e 8 nM α 2 M, una concentrazione di α 2 M che è inferiore alla soglia di rilevamento nel protocollo. A causa della bassa concentrazione di α 2 M, è possibile determinare con precisione l'attività specifica di α 1 PI in saliva senza preoccupazione per la concorrenza da α 2 M. Misure di accesso α 1 PI e il contenuto di proteine ​​nella saliva permesso di calcolare l'indice 1 α PI che si correla con il metodo standard per misurare CD4, citometria a flusso. È importante, i risultati delle analisi di regressione (r

    I metodi di enumerazione CD4 non hanno precedentemente preso in considerazione la variazione che è dovuto al ciclismo. In termini pratici, CD4 può variare fino a 200 cellule / pl tra l'apice nadir e con una periodicità di 23-27 giorni, e ciò è vero a prescindere dal metodo di misurazione cellule CD4 + T 3. In questo modo, l'asse onda sinusoidale di oscillazione fornisce una misura più accurata di CD4 veri di un individuo + conta delle cellule T che misura un solo giorno, perché l'asse di oscillazione è ora costante per ora, di settimana in settimana. Mentre non può essere possibile misurare direttamente l'asse di oscillazione per CD4 + di un individuo cellule T, questo può essere valutata utilizzando una media di CD4 + longitudinali conta di cellule T purché variazione CD4 non superi l'ampiezza prevista. Grande variabilitàs nella conta CD4 indicherebbe l'influenza di altre variabili del ciclismo.

    La linea di regressione illustrato nella figura 2 è una stima dell'asse di oscillazione. Calcolo della ampiezza prevista sopra e sotto la linea di regressione ha mostrato che l'ampiezza trova all'interno dell'intervallo di confidenza 95%. La differenza media tra l'intervallo di confidenza al 95% e la retta di regressione è di 63 CD4 cellule / microlitro, e la differenza media tra l'ampiezza e la retta di regressione è di 37 CD4 cellule / microlitro. Questo può essere interpretato nel senso che il 95% dei CD4 calcolato in base alle misurazioni di α-test sarà in circa 63 CD4 cellule / microlitro dai conti effettivi CD4 e che circa il 58% di questa differenza sarà dovuta al ciclismo CD4. Pertanto, la precisione del α-test è la distanza tra l'intervallo di confidenza e ampiezza che è di circa 26 cellule CD4 / microlitro, e l'accuratezza del α-test è la correlazione Coeffnt della linea di regressione che è 0,95 o 95%.

    Esistono numerose limitazioni alla α-test come qui descritto, ma le soluzioni sono facilmente disponibili. Ad esempio, anche se la α-test descritto utilizza un formato micropiastra, la capacità di eseguire la α-test utilizzando una singola diluizione saliva permette la α-test per essere utilizzato con la tecnologia asta di livello, uno strumento-free, sistema tecnologicamente semplice. Circa il 2% dei campioni di saliva raccolti in Camerun era troppo viscoso per manipolare, e questo è coerente con la saliva raccolti in New York City. L'applicazione di DNasi di tali campioni può essere usato per migliorare la viscosità permettendo di misura 10. Una soluzione aggiuntiva potrebbe essere quella di utilizzare sialagogues farmacologiche che stimolano la secrezione di saliva in particolare attraverso la via parasimpatica rispetto simpatico producendo così saliva acquosa. Una tale sialagogue è pilocarpina 11. Infine, l'α-prova non hat ancora stato convalidato, e questo è necessario per determinare se le prestazioni sono sufficientemente discriminatorio per i livelli critici di conta dei CD4 12.

    I livelli critici di CD4 sono nella regione lineare della curva di regressione sigmoidale che ha permesso questi valori calcolati da un algoritmo lineare. In questa popolazione, la regressione lineare per i valori di CD4 <860 cellule / microlitro (r 2 = 0.86, n = 30, p <2x10 -7) era buono come la regressione sigmoidale (r 2 = 0.88, n = 30, p < 0,0001). La regressione lineare per alfa 1 PI Indici sopra 67 che corrisponde a circa 350 CD4 cellule / microlitro (R 2 = 0.88, n = 15, p = 0.002) era buono come la regressione sigmoidale (r 2 = 0.89, n = 15, p <0,0001). Tuttavia, la correlazione non è stata significativa a alfa 1 PI Indici sotto 67 che corrispondevano a CD4 <350 cellule / microlitro (r 2 = 0.17, p = 0.54, n = 15). Questo è un valore critico poiché WHO linee guida raccomanda una conta CD4 <350 cellule CD4 / pl per qualificarsi per l'accesso alla terapia antiretrovirale 13. Per determinare meglio le prestazioni del α-test e migliorare la sensibilità su valori inferiori, oltre 800 campioni di saliva sono stati raccolti in Camerun da 4 gruppi: i neonati-2 anni, 3-5 anni e 6-15 anni e 16 anni e gli anziani.

    In conclusione, l'α-test è fisiologicamente rilevante per il numero di cellule CD4 nel sangue ancora può essere eseguita utilizzando saliva fornendo così un non invasiva, accurata e precisa point-of-care metodo per monitorare CD4 in regioni endemiche senza strumentazione a costo per test che è meno di un dollaro.

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    Disclosures

    Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

    Acknowledgements

    La ricerca è stata sostenuta dal Harry Winston Research Foundation.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sialogogue, 0.05M citric acid Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free Lemon dropS
    Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
    Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Tissue culture-treated, 96 well microplates Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

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    References

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