A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

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Summary

Quantitative Analyse Fitness (QFA) ist eine ergänzende Reihe von experimentellen und rechnerischen Methoden zur Schätzung der mikrobiellen Kultur Fitnesswerte. QFA schätzt den Effekt genetischer Mutationen, Medikamente oder andere Behandlungen angewandt auf Mikrobenwachstum. Experimente Skalierung von fokussierten Analyse der einzelnen Kulturen zu Tausenden von parallelen Kulturen ausgelegt werden kann.

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Banks, A. P., Lawless, C., Lydall, D. A. A Quantitative Fitness Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (66), e4018, doi:10.3791/4018 (2012).

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Abstract

Quantitative Analyse Fitness (QFA) ist ein experimenteller und rechnerischer Workflow für den Vergleich von Fitness der mikrobiellen Kulturen parallel 1,2,3,4 gewachsen. QFA können fokussierten Beobachtungen der einzelnen Kulturen angewandt werden, sondern ist sehr nützlich für genomweite genetische Interaktion oder Drogen-Bildschirme der Untersuchung bis zu Tausenden von unabhängigen Kulturen. Die zentrale experimentelle Methode ist die Impfung von unabhängigen, verdünnte Flüssigkeit mikrobiellen Kulturen auf festen Agar-Platten, die bebrütet und werden regelmäßig fotografiert. Fotos von jedem Zeit-Punkt analysiert, Erstellung von quantitativen Zelldichte Schätzungen, die verwendet werden, um Wachstumskurven zu konstruieren, so dass quantitative Fitness-Maßnahmen abgeleitet werden. Kultur Fitnesswerte kann im Vergleich zu quantifizieren und zu zählen genetische Interaktion Stärken oder Drogen-Empfindlichkeiten werden. Die Auswirkungen auf die Kultur von den Behandlungen Fitness Hinzugefuegt in Substrat-Agar (z. B. kleine Moleküle, Antibiotika oder Nährstoffe) oder aufgebracht auf externen Plattenly (zB UV-Einstrahlung, Temperatur) kann durch QFA quantifiziert werden.

Die QFA Workflow erzeugt Wachstum schätzt analog zu den durch spektrophotometrische Messung der parallelen flüssigen Kulturen in 96-Well oder 200-Well-Platte Software erhalten. Wichtig ist, daß QFA deutlich höheren Durchsatz im Vergleich mit solchen Methoden. QFA Kulturen wachsen auf einem festen Agar-Oberfläche und werden daher auch während des Wachstums ohne Rühren oder Schütteln belüftet.

QFA Durchsatz ist nicht so hoch wie die einiger synthetischer Genetic Array (SGA) Screening-Verfahren 5,6. Da jedoch QFA Kulturen stark, bevor sie auf Agar geimpft verdünnt werden, können QFA erfassen vollständigere Wachstumskurven, einschließlich Exponential-und Sättigungs-Phasen 3. Zum Beispiel ermöglichen Wachstumskurve Beobachtungen Kultur Verdoppelungszeiten direkt mit hoher Genauigkeit geschätzt werden, wie zuvor diskutiert 1.

Hier präsentieren wir einspezifische QFA-Protokoll angewandt, um Tausende von S. cerevisiae Kulturen, die automatisch durch Roboter sind während der Inokulation, Inkubation und Imaging behandelt. Jeder dieser Schritte kann automatisiert durch ein gleichwertiges, manuelle Verfahren ersetzt werden, mit einer zugehörigen Reduzierung der Durchlaufzeit, und wir präsentieren auch einen geringeren Durchsatz manuelle Protokoll. Die gleichen QFA Software-Tools, um Bilder in entweder Workflow erfasst angewendet werden.

Wir haben umfangreiche Erfahrungen auf die Anwendung QFA Kulturen der Bäckerhefe S. cerevisiae, aber wir erwarten, dass QFA erweisen wird ebenso nützlich für die Prüfung Kulturen der Spalthefe S. pombe und Bakterienkulturen.

Protocol

Manuelle QFA-Protokoll (für S. cerevisiae-Stämmen)

1. Kultivierung von Hefe-Stämme

  1. Bis zu 96 unabhängige Hefestämme werden in 200 ul reichen flüssigen Medien in einer 96-Well-Kulturschale kultiviert. Die Stämme werden bis zur Sättigung in einem temperierten Inkubator gezüchtet.
  2. A 96-polig, 1/8 "Durchmesser manuelle Nachbildung Plater (SIGMA R-2508) wird durch Eintauchen des ersten Replik Plater in 100% Ethanol, flammenden und dann abkühlen lassen sterilisiert.
  3. 200 ul sterilem Wasser wird in einer 96-Well-Kulturplatte angeordnet sind. Die gesättigten Kulturen werden gevortext (Eppendorf MixMate, 30 Sek., 750 min) und verdünnt durch Eintauchen des sterilisierten Pin-Werkzeug in die gesättigte Stämme dreimal dann in die Platte, die das Wasser einmal.
  4. Der Stift-Werkzeug wird nach 1,2 erneut sterilisiert.
  5. Die sterilisierten Pin-Werkzeug dient dazu, die verdünnte Kultur auf Agar-Platten verkauft beschmutzen durch Eintauchen in die Platte mit der verdünnten Kultur dreimal dien Übertragung der Stift-Werkzeug auf einen rechteckigen festen Agar-Platte.
  6. Die Quader-Agar-Platten werden auf einer geeigneten Temperatur, bevor sie abgebildet manuell mit Hilfe eines S & P Robotics spImager inkubiert. Alternative Methoden der Aufnahme von Bildern kann auch wie eine FujiFilm LAS4000, oder eine weniger teure digitale Spiegelreflexkamera verwendet werden, wenn darauf geachtet wird, gleichmäßige Ausleuchtung und konsequente Positionierung der Platte gegenüber der bildgebenden Kamera zu gewährleisten.
  7. Das Verfahren ist an die kleinere Anzahl von parallelen Kulturen, wie etwa 48, die auf jähriger Petrischalen ausgestattet werden, wobei darauf geachtet wird, den gleichen Winkel relativ zu der abbildenden Kamera während jede Aufnahme gewährleistet werden kann.

Vollautomatische QFA-Protokoll (für S. cerevisiae-Stämmen)

2. Kultivierung von Hefe-Stämme

  1. Starten mit einem rechteckigen Array of Independent Hefestämme die auf Agar. In diesem Beispiel die Stämme sind ausgehend von einer Kreuzung zwischen einer TemperaturAbfrage sensibler Mutation mit der Hefe Löschung Collection (YDC) von Synthetic Genetic Array (SGA). Abschließende SGA-Platten sind im Jahre 1536 Format. Dies ist 16 Zeilen mit 24 Spalten von Kolonien / Kulturen repräsentieren vier Wiederholungen von 384 unabhängigen Hefestämme. Siehe Abbildung 1 für die Platte Layouts.
  2. 384 Stämme von 1536 sind Roboter mit Hilfe eines S & P Robotics Inc BM3-SC-Roboter mit einem 96-polig, 1-mm-Durchmesser sterilen pintool in vier 96-Loch-Kultur-Platten mit 200 ul selektiven Medien (Abbildung 1) übertragen. Pintool Sauberkeit und Sterilität wird durch aufeinander folgendes Waschen in sterilem Wasser zweimal (einmal mit einer Walzenbürste, um Trümmer zu entfernen), 70% Ethanol (mit Ultraschall) und schließlich 100% Ethanol gelöst.
  3. Die Kulturen werden angebaut, um eine Sättigung (für drei Tage bei 20 ° C in diesem Beispiel, siehe Abbildung 1).

3. Spotting Hefekulturen

  1. Mit Hilfe eines Beckman Biomek FX, gesättigten Kulturen einerneut durch Vortexen resuspendiert auf einem Variomag TELESHAKE (gegen den Uhrzeigersinn bei 1000rpm für 20 Sekunden) und ca. 1:70 verdünnt durch Pinning in 200 ul sterilem Wasser mit einer sterilen 96 Pin Roboter-Stift-Werkzeug (V & P Scientific Magnetbefestigung pintool, 2 mm-Durchmesser). Pin-Tool Sauberkeit und Sterilität wird durch Waschen in sterilem Wasser erreicht, das Waschen in 70% Ethanol (mit einer Bürste, um Schmutz zu entfernen) und schließlich Eintauchen in 70% Ethanol und anschließendes Trocknen.
  2. Das verwässerte Kulturen werden auf festen Agar-Platten in 384-Format mit dem gleichen Roboter-Stift-Werkzeug (siehe Abbildung 1) nach der Reinigung und Sterilisation gesichtet.
  3. Nach Pinning, werden die Platten auf eine Temperatur gesteuerte Cytomat, befeuchteten Inkubator mit automatischem Karussell und Einstiegsluke übertragen.

4. Image Capture

  1. Als S & P Robotics automatisiertes Imager immer wieder entfernt die Platten aus dem Inkubator Cytomat, entfernt die Platte Deckel, legt sie genau unter einer beilegend, gleichmäßig ausgeleuchteten Raum unter einer Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR, nimmt ein Bild auf 5184 x 3456 Pixel Auflösung, ersetzt die Platte Deckel, und gibt sie in den Inkubator Karussell. Ein Bild wird sofort nach der ersten Übertragung in den Inkubator, um für einen Zeitpunkt Null Wachstum Messung (im Hintergrund) erlauben eingefangen. Roboter-Handling und Fotografie dauert 2 Minuten pro Platte.
  2. Mit einem vollständig geladenen Karussell, ist die maximal erreichbare Frequenz Platte Bilderfassungsvorrichtung eine Aufnahme alle sechs Stunden. Die Platten werden für bis zu sechs Tage (bis Koloniewachstum Sättigung inkubiert. Abbildung 1 zeigt drei typische Bilder aus einer Zeit-Verlauf bei 20 ° C.
  3. Für Tracking-Zwecke werden die Platten nach Name Inkubator, Temperatur, eindeutige laufende Chargennummer und Position im Inkubator benannt. Bild-Namen sind eine Verkettung von Platte Namen und Zeitstempel und werden automatisch bei der Aufnahme von Bildern konstruiert (zB K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, Dateityp FT1, Tabelle 1).

5. Erfassung von Metadaten Experimentelle

Die Metadaten-Dateien in diesem Abschnitt beschrieben sind durch Tabulatoren getrennter Text-Dateien, die manuell generiert werden (zB mit Tabellenkalkulationsprogramm). Der Experimental-Beschreibungsdatei (FT2, Tabelle 1) ist einzigartig für jedes Experiment, aber die Bibliothek Beschreibung (FT3, Tabelle 1) kann wieder verwendet werden ausgiebig einmal gebaut.

  1. Das Experiment wird in der Beschreibung Experimental-Datei (FT2, Tabelle 1) enthält Spalten für Barcode (oder automatisch generierte Typenschild), Experiment beginnt Zeitstempel-, Platten-Behandlung, die Inhalte von festen Agar-Medium, Chat-Name, die Bibliothek, Teller-Nummer (für Bibliotheken mit beschrieben mehrere Platten) und eine Wiederholung-Quadranten-Nummer (siehe Abbildung 1) für die Verkleinerung von 1536 zu 384 Format-Format.
  2. Der Hefestamm Bibliothek ist mit einer Bibliothek Description-Datei (FT3 beschrieben,
  3. Eine Standard-Gene Namendatei (FT4, Tabelle 1) über den Standard-Gens ein (z. B. RAD9) miteinander systematische ORF y-Nummer (zB YDR217C) Identifizieren Stämme zu screenenden Verbindung vorgesehen sein. Diese Datei enthält zwei Spalten: ORF & Gene Namen.

6. Datenanalyse

Die QFA Computational Workflow erfordert den Zugang zu einem einigermaßen leistungsstarken Multicore-Computer-Arbeitsplatz (zB ein Dell Precision T3500 mit Quad-Core Xeon 2.67 GHz Prozessor und 12GB RAM), auf dem die Colonyzer Bildanalyse-Software-Tool 3,4 und die QFA R-Paket 7 installiert ist , die beide Online dokumentiert, sind frei verfügbar und laufen auf einer Vielzahl von Betriebssystemen.

  1. Führen Colonyzer mit jedem der aufgenommenen Bilder als Eingangsdaten Platte, Erzeugen eines Colonyzer Ausgabedatei (FT5 Tabelle 1) für jedes aufgenommene Bild. Colonyzer Output-Dateien angeben, Kultur Dichte Schätzungen, Kulturkreis, Form und Farbe für jede der 384 Stellen auf der belichteten Platte. Ausgabe-Dateinamen wird automatisch aus dem Dateinamen Quellbild kopiert (zB die Platte Foto K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, Tabelle 1) entspricht der Colonyzer Ausgabedatei K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, Tabelle 1)).
  2. Mit der QFA R-Paket, laden experimentellen Metadaten (FT2, Tabelle 1) und Colonyzer Ausgabedateien (FT5 Tabelle 1). Diese Daten werden in R Datenrahmen (die als QFA Raw Data Textdateien (FT6, Tabelle 1) exportiert werden) zur weiteren Analyse zusammengeführt.
  3. Die QFA R-Paket enthält Funktionen, um die Zelldichte Der Zeitverlauf für jede Kultur zu sammeln, zu verallgemeinern lo passensynergistischen Bevölkerung zu Beobachtungen und Modelle zur Handlung sowohl (siehe Abbildungen 2 und 3 für Beispiele). Fitted Parameterwerte werden QFA Logistic Parameterdateien (FT7 Tabelle 1) geschrieben. Siehe QFA R Paket-Dokumentation für weitere Details.
  4. Die QFA R-Paket enthält auch Funktionen für die Qualitätskontrolle: Rand Kolonien werden durch die größere Verfügbarkeit von Nährstoffen an den Plattenkanten und Schwierigkeiten mit der Bildanalyse in der Nähe Platte Wände, Kulturen, die die SGA und Genotypen Anzeigen Verknüpfung mit Bildschirm-spezifischen Markergene nicht verworfen werden von der Analyse abgestreift.
  5. Mehrere quantitative Fitness-Maßnahmen werden aus logistischen Bevölkerung Modellparameter für jede Kultur abgeleitet. Dazu gehören maximale Verdopplung der Population Raten (MDR) und die Anzahl der Divisionen von Impfung bis zur Sättigung (MDP). Für jede Gruppe von replicate Kulturen (von einzigartigen Genotyp zum Beispiel) und für jede Fitness-Definition sind einige zusammenfassende Statistiken von Fitness-Schätzungen computed: Mittelwert und Median Fitness, Fitness Standardabweichung und Anzahl der Wiederholungen beobachtet. Zusammenfassende Statistiken ausgegeben werden, um QFA Fitness Zusammenfassung Dateien (FT8, Tabelle 1) für weitere Analysen, zB Berechnung der genetischen Interaktion Scores (FT9 Tabelle 1).

7. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt eine typische Wachstumskurve von 384 QFA wachsenden Kulturen bei 20 ° C auf festem Agar als durch Colonyzer quantifiziert, mit Zunahme der Zelldichte erstes immer nach ca. 2 Tagen nicht nachweisbar. Diese Verzögerung ist wahrscheinlich eine kombinierte Wirkung einer Kultur-Lag-Phase nach der Inokulation auf festes Medium und einer unteren Nachweisgrenze für Zelldichte. 3 zeigt ähnliche Wachstumskurven 308 aus einer einzelnen Platte erfasst. Abbildung aus 4 zeigt den Vergleich von zwei genomweiten QFA Bildschirme zu folgern, genetischeInteraktion Stärken (in Anlehnung an 1). Die QFA R-Paket 7 enthält außerdem Funktionen zur Abbildung 3 zu produzieren und Ranglisten der untersuchten Genotypen und Schätzungen der genetische Interaktion Stärke (GIS) ausgegeben, zusammen mit einem Q-Wert (False Discovery Rate (FDR) korrigierte p-Wert) für die Bedeutung der beobachteten GIS.

1
Abbildung 1. Schema für Roboter-Impfung der Hefestämme in 384-Spot-Format. Dieses Verfahren beginnt mit 1536 unabhängigen Kulturen pro Platte (links). In diesem typischen Beispiel Kolonien an den Positionen 1,1, 1,2, 2,1 und 2,2 (rot) vier Wiederholungen des gleichen Genotyps his3 :: kanMX Kulturen in gelb, wächst auf dem Rand der Platte. , einen Wachstumsvorteil haben wegen des Mangels an Wettbewerb und werden daher nicht durch QFA untersucht. Eine dieser Wiederholungen (z. B. 1,1) wird in flüssigen Nährmedien in 96-Well-Platte inokuliert s mit einem 96-Pin-Werkzeug, das 96 impft von 1536 Kolonien jeder Zeit. Um eine Wiederholung für jede der 384 Gendeletionen, vier verschiedene "Quadranten" (angegeben als rot, blau, grün und violett) impfen werden in vier verschiedene 96-Loch-Platten mit Nährmedien beimpft. Nach dem Wachstum bis zur Sättigung (zB 3 Tage bei 20 ° C), Kulturen in Wasser verdünnt, dann werden die vier Quadranten von einer Wiederholung in 384-Format auf einer Agar-Platte (rechts) in dem gleichen Muster wie das Original SGA Platte entdeckt (wie durch Farbe angegeben ist). Das Verfahren kann wiederholt werden, um zu testen anderen repliziert werden: 1,2; 2,1 und 2,2. Beispiel Zeitraffer-Bilder auf der rechten Seite wurden 0,5, 2 und 3,5 Tage nach der Impfung erfasst werden. Übernommen aus Ergänzende Abbildung 1 2. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

018/4018fig2.jpg "/>
Abbildung 2. Ein einzelner Roboter-Capture QFA Wachstumskurve. A) QFA Wachstumskurve einer Hefe-Stamm wächst auf Agar mit Galactose bei 20 ° C Die Bilder wurden Roboter etwa alle 2 Stunden festgehalten. Exponentiellen Phase wurde bei dieser Temperatur für ca. 1,5 Tage beobachtet, wobei Kultur Dichtezunahme erste erkennbar wird etwa 2 Tage nach der Inokulation. Eine verallgemeinerte logistische Modell wurde auf den beobachteten Daten (graue Kurve) passen. Modell-Parameter automatisch durch das R-Paket ausgestattet QFA vorgestellt werden: K (Tragkraft (AU)), R (Wachstumsrate (d -1)), g (Inokulumdichte (AU)), v (Wachstums-Symmetrie). B) Wie für Panel A, aufgetragen mit Zelldichte auf einer logarithmischen Skala. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 3
Abbildung 3. Automatisch Gen bewertet Wachstumskurven parallel aus einer 384-Format Platte erfasst. Jedes Feld zeigt Zelldichte Schätzungen (rote Kreuze) und Modellanpassungsmethode (schwarze Kurven) für unabhängige Kulturen durch Gen-Namen oder ORF y-Nummer gezüchtet in einem QFA Verfahren markiert. In diesem Beispiel Platte wurde durch Roboter abgebildet gewachsen und in einem automatisierten Inkubator bei 20 ° C Platte Namen, Platte Behandlung, Agar-Medium und Bibliothek-Kennzeichen: Experimentelle Metadaten werden automatisch in der Abbildung Titel enthalten. Angepasste Modell Parameterwerte werden ebenfalls automatisch auf jedem Feld aufgedruckt (siehe Abbildung 2). Edge-Kulturen wurden aus QFA Analyse abgestreift, so dass die 308 Kulturen in diesem Plot (siehe QFA Protokoll 5.4). Da Kante Kulturen nicht QFA analysiert werden, werden diese Kultur Zielen typischerweise mit neutralen Kontrollstämme (pGAL-HIS3 in diesem Fall) gefüllt. Die ursprüngliche Version dieser Figur, ausgegeben von der QFA R-Paket, in. Pdf-Format und ist somit stufenlos zoombar und durchsuchbaren Text von Abfragen.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Vergleicht man Fitnesswerte aus zwei Bildschirmen, um QFA genetische Interaktion abzuleiten. Dieser Plot zeigt einen Vergleich der Fitness von Bäckerhefe Deletionen (yfgΔ) mit dem neutralen ura3Δ Mutation oder dem temperaturempfindlichen CDC13-1-Mutation kombiniert und gewachsen an der semi-permissiven Temperatur für CDC13- 1 (27 ° C). Fitness wurde als das Produkt der maximalen Verdoppelung und die maximale Potenzial Verdoppelung 1 berechnet. Die Deletion Stämme wachsen, wenn er mit der neutralen ura3Δ Mutation kombiniert, wie erwartet, und eine hohe Fitness, sondern mit Deletionen cdc13-1 kombiniert eine Vielzahl von Eignungen. Die hellblauen Linien kreuzen an the Lage des neutralen his3Δ Mutation ist die durchgezogene Linie eine lineare Regression Modell der genetischen Unabhängigkeit (erwartete Fitness der CDC13-1-Mutanten yfgΔ gegeben Fitness der ura3Δ yfgΔ Mutanten) und die gestrichelte Linie ist die Linie gleicher Eignung. Löschungen grün gefärbt entscheidend zur Steigerung der Fitness-Defekt CDC13-1-Stämme. Löschungen rot gefärbt signifikant unterdrücken den gleichen Defekt. Vertikaler Abstand einer beliebigen Mutation cdc13-1 yfgΔ von der durchgezogenen Linie zeigt die Stärke der Wechselwirkung zwischen genetischen cdc13-1 und yfgΔ unter den Bedingungen Platte. Beachten Sie, dass einige der stärksten Suppressoren von CDC13-1 sind bisher Checkpoint Genen, RAD17, RAD24 und DDC1 und die Nuklease Exo1 in der Nähe der oberen rechten identifiziert. Gene, deren Löschung reduziert Fitness gehören YKU80 (codierend für die DNA-Reparatur und Telomer Capping Protein Yku80) in der Nähe des unten rechts. Beachten Sie auch, dass einige Gruppen von Genen, die zusammen funktionieren, um auf diesem Grundstück in Kollokation untergebracht werden neigen. Drei Beispiel-Cluster sind in blau SPE1, SPE2 und SPE3 hervorgehoben: Spermidin-Synthese-Gene, RAD17, RAD24 und DDC1: Kodierung Komponenten der Checkpoint Schiebeklemme und Checkpoint-Clamp-Loader, MRE11, RAD50 und XRS2: der MRX-Komplex, in DDR und EST1 beteiligt & EST3: Gene, die in Länge der Telomere beteiligt sind. Übernommen aus Ergänzende 1B 1, Rohdaten, aus denen dieses Grundstück wurde erzeugt wird, kann von hier heruntergeladen werden: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

"> Datei-ID Dateityp Manuell konstruiert Aktualisierungshäufigkeit Voraussetzung FT1 Platte Photographie Kein Pro Platte und Zeitpunkt Ja FT2 Experimentelle Beschreibung Ja Pro Experiment Ja FT3 Bibliothek Beschreibung Ja Pro Bibliothek Ja FT4 Standard-Gennamen Ja Pro Bibliothek Kein FT5 Colonyzer Ouput Kein Pro Zeitpunkt pro Platte Ja FT6 QFA Raw Data Kein Pro Experiment - FT7 Kein Pro Experiment - FT8 QFA Fitness Zusammenfassung Kein Pro Experiment - FT9 QFA genetische Interaktion Hitlist Kein Per GIS-Studie (2 expts.) -

Tabelle 1. Elektronische QFA Dateien. Auflistung aller Dateien (mit Ausnahme von FT1) sind durch Tabulatoren getrennten Text-Dateien und kann aufgebaut bzw. gelesen werden mit einem beliebigen Texteditor oder Tabellenkalkulation. Für weitere Details über den Bau QFA Metadaten-Dateien und eine genaue Interpretation der QFA Ausgabe finden Sie in der Dokumentation des Paketes QFA R 7 und die Software-Dokumentation Colonyzer 3.

Tabelle 2
Tabelle 2. Methoden zur Beurteilung der Eignung Kultur. Eine Zusammenfassung der Funktionen und erfordernAnforderungen einer Reihe von Methoden für mikrobielle Kultur Fitness. Eine Rezension von Blomberg 8 enthält detaillierte Vergleich der einige von ihnen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Discussion

QFA ist in vielerlei Hinsicht ein direkter Nachkomme von drei etablierten Labormaßstab mikrobiologischen Techniken: Kultur Verdünnungsreihe Stichproben 9, Wachstumskurve Bestimmung in belüfteten Flüssigkulturen 9 und 13 Replica-Plating. Diese drei Methoden werden zusammengefasst und verglichen mit QFA und andere High-Throughput-Techniken, die in Tabelle 2. Während Verdünnungsreihe Stichproben definieren, einem Stamm der Fitness als seine Fähigkeit, Kolonien in einer Reihe von Kulturen aus einer Reihe von Verdünnungen Inokulum gewachsen zu bilden, um QFA Maßnahmen Belastung Fitness durch wiederholte Beobachtungen einer einzigen Kultur konstruieren eine Wachstumskurve. Die Quantifizierung der Fitness von einzelnen Kulturen ermöglicht viele weitere Stämme gleichzeitig untersucht werden, unter identischen Bedingungen. Replizieren von Arrays der Kulturen ermöglicht wiederholtes Testen von Stammsammlungen, am sinnvollsten bei der Prüfung für Kultur Fitness Unterschiede in verschiedenen Umgebungen oder genetischen Hintergründen. Die QFA Protokoll vorgestellthier verwendet teure Roboter-Anlagen zu replizieren, beimpfen, inkubieren und Bild-Agar-Platten, geeignet für die Beobachtung Wachstum von Tausenden von unabhängigen Kulturen (Roboter QFA, Tabelle 2). Da jedoch QFA auf etablierten, traditionellen Labor-Techniken basiert, kann es auch viel billiger werden durch das Ersetzen Roboter mit Hilfe manueller Schritte (manuelle QFA, Tabelle 2) durchgeführt. Manuelle QFA beinhaltet Replikation und Inokulation der Kulturen auf Agarplatten mit einem manuellen Stiftwerkzeug und der manuellen Übertragung von Platten zu und von einem Inkubator für Fotografie. Das gleiche rechnerische Analyse Workflow angewendet werden, um Wachstumskurven von beiden experimentellen Design zu generieren.

QFA Fitness Schätzungen zu sein scheinen vergleichsweise präzise. In Abbildung 4 sind die mittlere Fitness der vier Beispiel-Cluster von funktionell verwandten Gen-Deletionen hervorgehoben. Die räumliche Nähe der Mitglieder jeder funktionell verwandten Gen-Klasse in zwei unabhängigeHNO genetischen Hintergründen (ura3Δ und CDC13-1) zeigt die Reproduzierbarkeit der QFA Fitness-Schätzungen. Zum Beispiel, trennen nur 3 Gendeletionen (von möglichen 4300) die drei Mitglieder der konservierten MRX-Komplex.

High-Throughput-Alternativen zu QFA zum Testen Wachstumseigenschaften mikrobielle Stämme umfassen SGA 5,6, Wettbewerb Bildschirme in Strichcode-Bibliotheken 11,12 und Bildschirme aufnehmenden optischen Dichte Kinetik spektrophotometrische Plattenleser 10, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind, und an anderer Stelle ausführlicher beschrieben 8 . QFA und SGA-Platten, wo Kulturen wachsen auf Agar-Oberflächen (Agar-basierten Methoden, Tabelle 2) können schnell und einfach per Roboter behandelt werden. Solide Agaroberfläche Kulturen sind gut belüftet und das Wachstum im gesamten Zellen können in festen Kulturen wachsen, so gesellig Mikroben in einer Gemeinschaft zu 14 wachsen. Intakt gelassen, mikrobieller Gemeinschaften einUSWIRKUNG eigenen Mikroumgebung, sezernierenden Toxine, wie Ethanol, und möglicherweise Signalisierung zwischen Zellen. Allerdings kontinuierliches Mischen von flüssigen Kulturen, notwendig, um ausreichende Belüftung zu erreichen, künstlich stört mikrobieller Gemeinschaften und deren Mikro-Umgebungen, die ihre Funktionsweise Wachstum beeinträchtigen können. Cross-Kontamination ist weniger ein Problem in festen Agar-Methoden, da es weniger Gelegenheit für Flüssigkeitsspritzern tragenden Zellen zwischen den Kulturen. Wenn Kontamination durch fremde luftgetragenen Mikroben in festen Agar-Assays, kann es oft durch visuelle Inspektion von festen Agar-Platten erkannt werden und machten oder entfernt werden.

QFA Durchsatz erheblich höher als die der Flüssigkeit parallel Verfahren auf zwei Arten. Zunächst auf QFA (und SGA)-Platten, inokuliert Kulturen zusammen dichter gepackt, so dass mehrere unabhängige Kulturen pro Platte. In QFA gibt es typischerweise 308 Kulturen, nicht mitgerechnet nicht-experimentellen Rand Kulturen (Abbildung 1) comVergleich zu flüssigen Kulturen mit 96 oder 100 Kulturen pro Platte parallel. Zweitens kann QFA Versuche zu einer viel größeren Anzahl von Platten skaliert werden. Während die Anzahl der Platten in einem einzigen Experiment analysiert QFA nur durch den verfügbaren Raum in einem Inkubator oder warmen Raum, der minimal zulässige Bilderfassungsvorrichtung Frequenz und der maximal erreichbaren Capture Frequenz beschränkt ist, ist die Anzahl von Platten in einem flüssigen Wachstumsmedium Experiment stark eingeschränkt durch die Kapazität der Platten-Lesegerät (typischerweise ein oder zwei Platten) oder der Ablage an der Platten-Lesegerät (typischer Wert von 25-50 Platten). Wir haben vor kurzem eine vollautomatische QFA Experiment auf 123 Platten mit je 308 experimentellen Kulturen durchgeführt, so dass 37.884 gleichzeitigen Kulturen. Wir schätzen, dass die maximal erreichbare Anzahl von unabhängigen Kulturen wachsen in flüssiger 96 (Kulturen / Platte) ist x 50 (Platten / Stapler) = 4800, die um das Zehnfache kleiner als unsere QFA Durchsatz ist. Eine Alternative für flüssige Kultur-Bildschirme ist für viele automatisierte gro nutzenwth Geräte parallel (Tabelle 1 aus der Bewertung von Blomberg 8), jede mit einer Kapazität von einem oder zwei Platten. Temperaturregelung in jedem Gerät ist unabhängig, und so Bedingungen sind nicht identisch, aber davon aus, dass sie sind, würde dies Workflow benötigen mindestens 190 solcher Geräte zu QFA Durchsatz (unter der Annahme 200 Flüssigkulturen pro Gerät) entsprechen.

Zusammenfassend ist QFA eine hochwertige Workflow, sinnvoll angewendet werden kann, um quantitatives Wachstum Phänotypen in beiden Kleinen fokussiert Experimente und High-Throughput-Screens sammeln. Es ist flexibel genug, um effektiv mit unterschiedlichen Anforderungen an die Roboter-Anlagen angewendet werden. Die rechnerische Komponente der QFA Workflow basiert auf frei verfügbarer Open-Source-Code basiert.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken allen Mitgliedern unseres Labors und dem Zentrum für Integrierte System-Biologie des Alterns und Ernährung (CISBAN) für die Unterstützung und hilfreiche Diskussionen. Diese Studie wurde vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) und des Wellcome Trust (075294, 093088) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replica Plater Sigma R-2508 96 pin manual pintool with 1/8 " diameter pins
Mix Mate Eppendorf 5353 000.014
Biomek FX Beckman A31842
Teleshake Thermo Scientific 50095890 Installed on Biomek FX
BM3-SC S&P Robotics Inc BM3-SC 192 shelf rotating carousel
spImager S&P Robotics Inc spImager High resolution manual imaging
spImager with Cytomat S&P Robotics Inc Custom Temperature controlled automated high resolution imaging
Cytomat 6001 with heat exchanger Thermo Scientific 51022222 Attached to spImager
Ecoline RE207 Lauda RE207 Attached to Cytomat
spImager with carousel S&P Robotics Inc Custom Automated high resolution imaging
Robot pin tool fixture for FP12pins V&P Scientific AFIX96FP12 N/A
96 x FP12 pins V&P Scientific FP12 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length
Docking Station for Pin Tool V&P Scientific VP425 Docking station base removed to allow fan drying of pins
Pin Cleaning Brush V&P Scientific VP425 N/A
Replica Plater Sigma R-2508 Manual pin tool
Nunc OmniTray with Lid Nunc 734-0490 N/A
96 well sterile polystyrene plates Greiner BioOne 655161 N/A
96 well sterile polystyrene lids Greiner BioOne 656171 N/A

Table 3. Specific reagents and equipment.

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References

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