En kvantitativ fitnessanalyse Workflow

* These authors contributed equally
Biology
 

Summary

Kvantitativ fitnessanalyse (QFA) er en komplementær serie eksperimentelle og beregningsmetoder for estimering av mikrobielle kultur fitnesses. QFA anslår effekten av genetiske mutasjoner, narkotika eller andre gjaldt behandlinger på mikrobe vekst. Eksperimenter skalering fra fokusert analyse av single kulturer til tusenvis av parallelle kulturer kan utformes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banks, A. P., Lawless, C., Lydall, D. A. A Quantitative Fitness Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (66), e4018, doi:10.3791/4018 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kvantitativ fitnessanalyse (QFA) er en eksperimentell og beregningsorientert arbeidsflyt for å sammenligne fitnesses av mikrobielle kulturer dyrket parallelt 1,2,3,4. QFA kan brukes fokuserte observasjoner av single kulturer, men er mest nyttig for genom-wide genetisk interaksjon eller narkotika-skjermer undersøke opptil tusenvis av uavhengige kulturer. Den sentrale eksperimentelle metoden er den inokulering av uavhengige, fortynnede væske mikrobielle kulturer inn på solide agar plater som ruges og regelmessig fotografert. Fotografier fra hver gang-punkt blir analysert, produserer kvantitative celletetthet estimater, som brukes til å konstruere vekstkurver, slik at kvantitative fitness tiltak for å bli utledet. Kultur fitnesses kan sammenlignes å kvantifisere og rangere genetisk interaksjon styrker eller narkotika overfølsomhet. Effekten på kultur egnethet av eventuelle behandlinger lagt inn substrat agar (f.eks små molekyler, antibiotika eller næringsstoffer) eller påføres plater utvendigly (f.eks UV bestråling, temperatur) kan kvantifiseres ved QFA.

Den QFA arbeidsflyten produserer vekst anslår analogt til de som er fremstilt ved spektrofotometrisk måling av parallelle flytende kulturer i 96-brønn eller 200-brønnen plate lesere. Viktigere, har QFA betydelig høyere gjennomstrømning sammenlignet med slike metoder. QFA kulturer vokse på en solid agaroverflaten og er derfor godt luftet under vekst uten behov for å røre eller riste.

QFA gjennomstrømning er ikke så høy som i noen Syntetisk Genetisk Array (SGA) screening metoder 5,6. Men siden QFA kulturer er sterkt fortynnet før de inokulert på agar, kan QFA fange mer komplette vekstkurver, inkludert eksponential og metning faser tre. For eksempel, vekstkurve observasjoner tillate kultur dobling ganger til estimeres direkte med høy presisjon, som omtalt tidligere en.

Her presenterer vi enspesifikk QFA protokollen brukt tusenvis av S. cerevisiae kulturer som håndteres automatisk av roboter under inokulasjon, inkubasjon og bildebehandling. Alle disse automatiserte tiltak kan erstattes av en tilsvarende, manuell prosedyre, med en tilhørende reduksjon i gjennomstrømning, og vi også presentere en lavere gjennomstrømming manuell protokoll. De samme QFA programvare verktøy kan brukes til bilder tatt i enten arbeidsflyt.

Vi har lang erfaring søker QFA til kulturer i spirende gjær S. cerevisiae men vi forventer at QFA vil være like nyttig for å undersøke kulturer av fisjon gjær S. pombe og bakteriekulturer.

Protocol

Manuell QFA Protocol (for S. cerevisiae stammer)

1. Dyrkning Gjær Stammer

  1. Opp til 96 uavhengige gjær stammer dyrkes i 200 mL av rike flytende medier i en 96-brønns kultur parabolen. De stammer dyrkes til metning i en temperatur kontrollert inkubator.
  2. En 96 pin, 1/8 "diameter manuell replica plater (SIGMA R-2508) er sterilisert ved først å dyppe den replikaen plater i 100% etanol, flammende og deretter forlate avkjøles.
  3. 200 mL sterilt vann er kledd i en 96-brønns kultur plate. De mettede kulturer vortexed (Eppendorf MixMate, 30 sek, 750 rpm) og fortynnes ved å dyppe den sterilisert pin verktøyet inn i mettet stammer tre ganger så inn platen som inneholder vann en gang.
  4. Stiften Verktøyet er re-steriliseres som per 1.2.
  5. Den steriliserte pin verktøyet brukes til å oppdage den fortynnede kulturen på selges agar plater ved å dyppe inn platen som inneholder den fortynnede kulturen tre gangern overføre pin verktøyet til en rektangulær solid agar plate.
  6. De rektangulære solide agar plater inkubert ved en passende temperatur før de blir fotografert manuelt med en S & P Robotics spImager. Alternative bildefotografering metoder kan også brukes som en LAS4000 FujiFilm, eller en rimeligere digitalt speilreflekskamera hvis omsorg er tatt for å sikre jevn belysning og konsistent plate posisjonering i forhold til kamera.
  7. Metoden er tilpasningsdyktig til mindre antall parallelle kulturer, for eksempel 48, som kan monteres på runde petriskåler hvis omsorg er tatt for å sikre at den samme vinkelen i forhold til kamera under hvert bilde.

Helautomatisk QFA Protocol (for S. cerevisiae stammer)

2. Dyrkning Gjær Stammer

  1. Start med et rektangulært utvalg av uavhengige gjær stammer vokser på fast agar. I dette eksempelet start stammer er resultatet av krysset en temperatursensitiv spørring mutasjon med gjær Sletting Collection (YDC) av syntetisk Genetisk Array (SGA). Endelige SGA platene er i 1536-format. Dette er 16 rader med 24 kolonner med kolonier / kulturer representerer fire replikater av 384 uavhengige gjær stammer. Se figur 1 for plate oppsett.
  2. 384 stammer out of 1536 blir overført robotically bruker en S & P Robotics Inc BM3-SC robot med en 96 pin, 1-mm pin diameter sterilt pintool inn i fire 96-vel kultur plater som inneholder 200 mL av selektive medier (figur 1). Pintool renslighet og sterilitet oppnås ved å sekvensielt vask i sterilt vann to ganger (en gang med en roterende børste for å fjerne rusk), 70% etanol (med sonikator) og til slutt 100% etanol.
  3. De kulturer dyrkes til metning (for tre dager ved 20 ° C i dette eksempelet, se figur 1).

3. Spotting Gjær kulturer

  1. Ved hjelp av en Beckman Biomek FX, mettede kulturer enre resuspendert av virvling på en Variomag Teleshake (mot urviseren ved 1000rpm i 20 sekunder) og fortynnes ca 1:70 ved å feste inn 200 mL sterilt vann ved hjelp av en steril 96 pin robot pin verktøy (V & P Scientific magnetisk montering pintool, 2 mm pin diameter). Pin verktøy renslighet og sterilitet oppnås ved å vaske i sterilt vann, vask i 70% etanol (med en pensel for å fjerne rusk) og til slutt dyppe i 70% etanol etterfulgt av tørking.
  2. Utvannet kulturer er prikket inn solide agar plater i 384-format ved hjelp av den samme robot pin verktøyet (se figur 1) etter rengjøring og sterilisering.
  3. Etter pinning, blir platene overført til en Cytomat temperatur kontrollert, fuktet inkubator med automatisk karusell og tilgang luke.

4. Image Capture

  1. En S & P Robotics automatisert imager fjerner gjentatte ganger platene fra Cytomat inkubator, fjerner plate lokket, plasserer dem nøyaktig under en vedlegged, jevnt opplyst plass under et Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR, fanger et bilde på 5184 x 3456 px oppløsning, erstatter plate lokket, og returnerer dem til inkubatoren karusellen. Ett bilde er tatt umiddelbart etter innledende overføring til inkubatoren for å tillate en null tidspunkt vekst måling (bakgrunn). Robot håndtering og fotografering tar 2 minutter per plate.
  2. Med en fullastet karusell, er den maksimale oppnåelige platen bildeopptak frekvens ett bilde hver sjette time. Plater inkuberes i opptil seks dager (inntil kolonien vekst metning. Figur 1 viser tre typiske bilder fra en time-kurs ved 20 ° C.
  3. For sporing, blir platene navngitt i henhold til inkubator navn, temperatur, unikt sekvensielt batchnummer og posisjon i kuvøse. Bilde navnene er en sammensetning av plate navn og tidsstempel og blir automatisk bygget på Image Capture (f.eks K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, File Type FT1, Tabell1).

5. Capture of Experimental Metadata

De metadatafilene beskrevet i dette avsnittet er tabulatordelte tekstfiler som blir manuelt generert (f.eks ved hjelp av regneark programvare). Eksperimentell Description fil (FT2, Tabell 1) er unikt for hvert forsøk, men biblioteket Beskrivelse (FT3, Tabell 1) kan gjenbrukes i stor utstrekning en gang konstruert.

  1. Eksperimentet er beskrevet i Experimental Description filen (FT2, Tabell1) inneholder kolonner for strekkode (eller automatisk generert plate navn), eksperiment starter tidsstempel, plate behandling, innholdet av fast agar medium, skjermnavn, bibliotek, plate nummer (for biblioteker med flere plater) og en repeat-kvadrant nummer (se figur 1) for skalering ned fra 1536 format til 384 format.
  2. Den gjær belastningen biblioteket er beskrevet med en Library Beskrivelse fil (FT3,
  3. En valgfri Standard Gene Navn fil (FT4, Tabell 1) beskriver standard genet navn (f.eks RAD9) knyttet til hver systematisk ORF y-nummer (f.eks YDR217C) identifisere stammer bli screenet kan gis. Denne filen inneholder to kolonner: ORF & Gene navn.

6. Data Analysis

Den QFA beregningsorientert arbeidsflyt krever tilgang til en rimelig kraftig multicore datamaskin arbeidsstasjon (f.eks en Dell Precision T3500 med Xeon quad-core 2,67 GHz prosessor og 12GB RAM) som er installert Colonyzer bildeanalyse programvare verktøyet 3,4 og QFA R pakken 7 , som begge er dokumentert på nettet, er fritt tilgjengelig og kjøres på en rekke operativsystemer.

  1. Kjør Colonyzer med hver av de fangede plate bildene som innspill, generere en Colonyzer Output fil (FT5 tabell 1) for hvert bilde du har tatt. Colonyzer utdatafiler spesifisere kultur tetthet estimater, kultur areal, form og farge for hver av de 384 stedene på avbildes plate. Utgang filnavn blir automatisk kopiert fra kildebildet filnavn (f.eks plate fotografiet K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, Tabell 1) tilsvarer Colonyzer utdatafilen K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, Tabell 1)).
  2. Bruke QFA R pakken, laste eksperimentell metadata (FT2, Tabell1) og Colonyzer utdatafiler (FT5 tabell 1). Disse dataene er flettet inn i R datarammer (som kan eksporteres som QFA rådata tekstfiler (FT6, Tabell 1)) for videre analyse.
  3. Den QFA R-pakken inneholder funksjoner for å samle celletetthet timecourses for hver kultur, til å passe generalisert logistic befolkningen modeller til observasjoner og å plotte begge (se figur 2 og 3 for eksempler). Spesiallys parameterverdiene er skrevet for å QFA Logistic parameterfiler (FT7 tabell 1). Se QFA R pakke dokumentasjon for ytterligere detaljer.
  4. Den QFA R-pakken inneholder også funksjoner for kvalitetskontroll: edge kolonier forkastes på grunn av økt tilgjengelighet av næringsstoffer ved metallkanter og problemer med bildeanalyse nær plate vegger, kulturer som mislykkede SGA og genotyper viser kobling med skjerm-spesifikke markør gener fjernes fra analysen.
  5. Flere kvantitative fitness tiltak er avledet fra logistiske befolkningsundersøkelser modell parametere for hver kultur. Disse inkluderer maksimale befolkningen dobling priser (MDR) og antall divisjoner fra inokulasjon til metning (MDP). For hvert sett gjentatte kulturer (av unike genotype for eksempel) og for hver fitness definisjon, flere sammendrag statistikk over fitness anslagene er computed: gjennomsnitt og median fitness, fitness standardavvik og antall duplikater observert. Statistikken er utgang til QFA Fitness Sammendrag filer (FT8, Tabell 1) for videre analyse, f.eks beregning av genetisk interaksjon score (FT9 tabell 1).

7. Representative Resultater

Figur 2 viser en typisk vekstkurve ut av 384 QFA kulturer vokser ved 20 ° C på solid agar som kvantifiseres ved Colonyzer, med økning i celle tetthet første blir synlig etter ca 2 dager. Denne forsinkelsen er sannsynligvis en kombinert effekt av en kultur etterslep fase etter inokulasjon på fast medium og en nedre deteksjonsgrense for celle tetthet. Figur 3 viser 308 lignende vekstkurver tatt fra en enkelt plate. Figur 4 viser en sammenligning av to genom-wide QFA skjermer å antyde genetiskinteraksjon styrker (tilpasset fra 1). Den QFA R-pakken 7 inneholder også funksjoner for å produsere Figur 3 og hente ut rangerte lister over undersøkte genotyper og estimater av genetisk interaksjon styrke (GIS), sammen med en q-verdi (False funnrate (FDR) korrigert p-verdi) for betydningen av observerte GIS.

Figur 1
Figur 1. Ordning for robot inokulering av gjær stammer i 384-spot format. Denne prosedyren starter med 1536 uavhengige kulturer per plate (venstre). I dette typisk eksempel kolonier i posisjonene 1,1, 1,2, 2,1 og 2,2 (farget rød) er fire gjentak av samme genotype his3 :: KANMX kulturer i gult, vokser på kanten av tallerkenen. , har en vekst fordel på grunn av manglende konkurranse, og er derfor ikke undersøkt av QFA. En av disse replikater (f.eks 1,1) blir inokulert til flytende vekstmedier i 96-brønn plate s ved hjelp av en 96-pinners verktøy som inoculates 96 av 1536 kolonier hver gang. For å vaksinere en gjengivelse for hver av 384 genet slettinger, fire forskjellige "kvadranter" (angitt som rød, blå, grønn og lilla) blir inokulert i fire ulike 96-brønners plater som inneholder vekstmedier. Etter vekst til metning (f.eks 3 dager ved 20 ° C), er kulturer fortynnet i vann, så de fire kvadrantene fra en rapport er oppdaget i 384-format på en solid agar plate (til høyre) i samme mønster som den opprinnelige SGA plate (som angitt av farge). Prosessen kan gjentas for å teste andre gjentak: 1,2, 2,1 og 2,2. Eksempel time-lapse bilder på høyre ble fanget 0,5, 2 og 3,5 dager etter inokulasjon. Tilpasset fra Supplementary Figur 1 2. Klikk her for å se større figur .

018/4018fig2.jpg "/>
Figur 2. En enkelt robot-fanget QFA vekstkurve. A) QFA vekst kurve av en gjær belastning vokser på agar inneholder galaktose ved 20 ° C. Bilder ble tatt til fange robotically ca hver 2 time. Eksponentielle fasen ved denne temperaturen ble observerbare for cirka 1,5 dager, med kultur tetthet økning første bli synlig ca 2 dager etter inokulasjon. En generell logistiske modellen ble passe til de observerte data (grå kurve). Modell parametere automatisk montert ved QFA R pakken presenteres: K (nyttelast (AU)), R (vekstrate (d -1)), g (podestoff tetthet (AU)), v (vekst symmetri). B) Som for panel A, plottet med celle tetthet på en log skala. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Automatisk genet rangerte vekstkurver fanget i parallell fra en enkelt 384-format plate. Hvert panel viser celletetthet estimater (røde kors) og modelltilpasning (svarte kurver) for uavhengige kulturer merket med genet navn eller ORF y-nummer vokst i en QFA prosedyre. Dette eksempelet plate ble fotografert av robot og vokst i en automatisert inkubator ved 20 ° C. Eksperimentell metadata blir automatisk inkludert i figuren tittelen: plate navn, plate behandling, agar medium og bibliotek plate nummer. Spesiallys modell parameterverdiene er også skrives automatisk ut på hvert panel (se figur 2). Edge kulturer ble strippet fra QFA analyse, forlater de 308 kulturer i denne tomten (se QFA Protocol 5.4). Siden edge kulturer ikke er analysert i QFA, er disse kultur stedene vanligvis fylt med nøytrale kontrollstammer (pGAL-HIS3 i dette tilfellet). Den opprinnelige versjonen av dette tallet, er produksjonen ved QFA R pakken, i. Pdf format og er derfor uendelig zoomable og søkbar tekst spørringer.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Figur 4
Figur 4. Sammenligning fitnesses fra to QFA skjermer å utlede genetisk interaksjon. Denne tomten viser sammenligning av egnethet av spirende gjær delesjoner (yfgΔ) kombinert med den nøytrale ura3Δ mutasjon eller temperatur sensitive cdc13-1-mutasjon og vokst på det semi-ettergivende temperatur for cdc13- 1 (27 ° C). Fitness ble beregnet som produktet av maksimal dobling hastighet og maksimal dobling potensial 1. De fleste sletting stammer vokser godt i kombinasjon med nøytrale ura3Δ mutasjonen, som forventet og har høy kondisjon, men sletting kombinert med cdc13-1 har et bredt spekter av fitnesses. De lyseblå linjene krysser ved the plasseringen av den nøytrale his3Δ mutasjon, er heltrukken linje en lineær regresjonsmodell av genetisk uavhengighet (forventet skikkethet cdc13-1 yfgΔ mutanter gitt egnethet av ura3Δ yfgΔ mutanter) og den stiplede linjen er den linjen lik fitness. Slettinger farget grønn betydelig forbedre kondisjon mangelen av cdc13-1 stammer. Slettinger farget rød betydelig undertrykke den samme feilen. Vertikal avstand av noen mutasjon cdc13-1 yfgΔ fra den heltrukne linjen angir styrken av genetisk interaksjon mellom cdc13-1 og yfgΔ under platen forhold. Merk at noen av de sterkeste suppressors av cdc13-1 er tidligere identifisert checkpoint gener, RAD17, DDC1 og RAD24 og nuclease EXO1 nær toppen til høyre. Gener som sletting reduserer fitness inkludere YKU80 (koding av DNA-reparasjon og telomere capping protein Yku80) nær nederst til høyre. Merk også at enkelte grupper av gener som fungerer sammen tendens til å være samlokalisert på denne tomten. Tre eksempler på klynger er uthevet i SPE1 blått, SPE2 og SPE3: spermidine syntese gener, RAD17 og DDC1 og RAD24: koding komponenter av sjekkpunkt glidende klemmen og sjekkpunkt klemme loader, MRE11, RAD50 og XRS2: den MRX komplekset, er involvert i DDR og EST1 & EST3: gener involvert i telomere lengde regulering. Tilpasset fra Supplementary Figur 1B 1, kan rådata som dette plottet ble generert lastes ned herfra: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . Klikk her for å se større figur .

"> Fil ID File Type Manuelt Konstruert Oppdater Frekvens Forutsetning FT1 Plate fotografi Ingen Per plate & endepunktet Ja FT2 Eksperimentell Beskrivelse Ja Per eksperiment Ja FT3 Bibliotek Beskrivelse Ja Per bibliotek Ja FT4 Standard Gene navn Ja Per bibliotek Ingen FT5 Colonyzer utgang Ingen Per endepunktet per plate Ja FT6 QFA Rå Data Ingen Per eksperiment - FT7 Ingen Per eksperiment - FT8 QFA Fitness Oppsummering Ingen Per eksperiment - FT9 QFA genetisk interaksjon Søket Ingen Per GIS studie (2 expts.) -

Tabell 1. Elektroniske QFA filer. Alle filene som er oppført (unntatt FT1) er tabulatordelte tekstfiler og kan konstrueres eller leses med et tekstredigeringsprogram eller et regneark programvare. For nærmere informasjon om bygging QFA metadatafilene og presis tolkning av QFA utgang se QFA R pakken dokumentasjon 7 og Colonyzer programvaredokumentasjonen tre.

Tabell 2
Tabell 2. Metoder for å vurdere kulturen fitness. Et sammendrag av funksjonene og krevermenter av en rekke metoder for å vurdere mikrobiell kultur fitness. En gjennomgang av Blomberg 8 inneholder mer detaljert sammenligning av noen av disse. Klikk her for å se større figur .

Discussion

QFA er på mange sanser en direkte etterkommer av tre etablerte benk-skala mikrobiologiske teknikker: kultur fortynning serien stikkprøver 9, vekstkurve bestemmelse i karbonisert flytende kulturer 9 og kopi plating 13. Disse tre metodene er oppsummert og sammenlignet med QFA og andre high-throughput teknikker i tabell 2. Mens fortynning serien stikkprøver definere en belastning egnethet som evne til å danne kolonier i en rekke kulturer vokst fra en rekke podestoff fortynninger, til QFA tiltak belastningen fitness ved gjentatte observasjoner av en enkelt kultur konstruere en vekst kurve. Kvantifisering fitness fra enkle kulturer kan mange flere stammer skal undersøkes samtidig, under identiske forhold. Innlæring matriser av kulturer tillater gjentatt testing av belastningsskader samlinger, mest nyttige ting når jeg tester for kultur fitness forskjeller i ulike miljøer eller genetiske bakgrunn. Den QFA protokollen presenterther bruker dyrt robot-utstyr å gjenskape, vaksinere, inkuber og bilde agar plater, passende for å observere vekst av tusenvis av uavhengige kulturer (robot QFA, tabell 2). Men siden QFA er basert på etablerte, tradisjonelle lab teknikker, kan det også utføres mye billigere ved å erstatte robot hjelp med manuelle trinn (manuell QFA, tabell 2). Manuell QFA innebærer replikering og poding av kulturer inn på agar plater ved hjelp av en manuell pin verktøy og manuell overføring av platene til og fra en inkubator for fotografering. Det samme beregningsanalyse arbeidsflyten kan brukes til å generere vekstkurver fra enten eksperimentelt design.

QFA fitness anslag synes å være relativt presise. I figur 4 er gjennomsnittlig fitnesses av fire eksempel klynger av funksjonelt beslektede gener slettinger uthevet. Nærheten av medlemmer av hvert funksjonelt beslektede gener klassen i to uavhengigeskjellige genetiske bakgrunn (ura3Δ og cdc13-1) angir reproduserbarhet QFA fitness estimater. For eksempel bare tre genet slettinger (ut av en mulig 4300) skiller de tre medlemmene av konservert MRX komplekset.

High-throughput alternativer til QFA for testing vekstkarakteristikker av mikrobielle stammer inkluderer 5,6 SGA, konkurranse skjermer i strekkodet biblioteker 11,12 og skjermer fange optisk tetthet kinetikk i Spektrofotometrisk plate lesere 10 som er oppsummert i Tabell 2 og beskrevet mer fullstendig annet sted 8 . QFA og SGA plater, der kulturer vokser på solide agar overflater (agar baserte metoder, tabell 2) kan håndteres raskt og enkelt ved robot. Solid agaroverflaten kulturer er godt luftet gjennom vekst og cellene kan vokse i faste kulturer, slik at sosiale mikrober å vokse i et fellesskap 14. Intakt, mikrobielle samfunn etffect sin egen mikro-miljøer, sekresjon giftstoffer som etanol, og muligens signalering mellom cellene. Men kontinuerlig blanding av flytende kulturer, nødvendige for å oppnå tilstrekkelig lufting, kunstig forstyrrer mikrobielle samfunn og deres mikro-miljøer som kan påvirke deres moduser av vekst. Cross-forurensning er mindre av en bekymring i solide agar metoder siden det er mindre mulighet for væskesprut frakter celler mellom kulturer. Dersom forurensning skjer ved utenlandske luftbårne mikrober i solide agar-analyser, kan det ofte bli oppdaget ved visuell inspeksjon av faste agar plater og sto for eller fjernet.

QFA gjennomstrømning er betydelig høyere enn for parallelle flytende metoder på to måter. Først av alt, på QFA (og SGA) plater, er inokulerte kulturer pakket sammen tettere, noe som gir mer selvstendige kulturer per plate. I QFA er det vanligvis 308 kulturer, ikke medregnet ikke-eksperimentelle edge kulturer (figur 1) comsammenlignet med parallell flytende kulturer med 96 eller 100 kulturer per plate. Dernest kan QFA eksperimenter bli skalert til en mye større antall plater. Mens antall plater analysert i en enkelt QFA eksperiment er bare begrenset av tilgjengelig plass i en inkubator eller varme rom, minstekravet Image Capture frekvens og høyest oppnåelige fangst frekvens, er antall plater i en væske vekst eksperiment sterkt begrenset av kapasiteten på plateavleseren (vanligvis én eller to plater), eller av stabler festet til plateavleseren (typisk 25-50 plater). Vi har nylig gjennomført en helautomatisk QFA eksperiment på 123 plater, hver med 308 eksperimentelle kulturer, noe som gir 37,884 samtidige kulturer. Vi anslår at maksimalt oppnåelig antall uavhengige kulturer vokser i flytende er 96 (kulturer / plate) x 50 (plater / stabling) = 4800, som er rundt ti ganger mindre enn vår QFA gjennomstrømming. Et alternativ for flytende kultur skjermer er å utnytte mange automatisert growth enheter i parallell (tabell 1 fra gjennomgangen av Blomberg 8), som hver har en kapasitet på en eller to plater. Temperaturkontroll i hver enhet er uavhengig, og så forholdene er ikke identiske, men forutsatt at de er, ville dette arbeidsflyten krever minst 190 slike enheter for å matche QFA gjennomløp (forutsatt 200 flytende kulturer per enhet).

Oppsummert er QFA en høy kvalitet arbeidsflyt som kan nyttiggjøre å samle kvantitative vekst fenotyper i begge småskala fokusert eksperimenter og høy gjennomstrømning skjermer. Det er fleksibelt nok til å brukes effektivt med varierende krav til robot utstyr. Den beregningsorientert komponenten av QFA arbeidsflyten er basert på fritt tilgjengelig, åpen kildekode.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke for alle medlemmer i vårt laboratorium og Senter for integrert system Biology of Ageing and Nutrition (CISBAN) for støtte og nyttige diskusjoner. Denne studien ble støttet av bioteknologi og Biologisk Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) og Wellcome Trust (075294, 093088).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replica Plater Sigma R-2508 96 pin manual pintool with 1/8 " diameter pins
Mix Mate Eppendorf 5353 000.014
Biomek FX Beckman A31842
Teleshake Thermo Scientific 50095890 Installed on Biomek FX
BM3-SC S&P Robotics Inc BM3-SC 192 shelf rotating carousel
spImager S&P Robotics Inc spImager High resolution manual imaging
spImager with Cytomat S&P Robotics Inc Custom Temperature controlled automated high resolution imaging
Cytomat 6001 with heat exchanger Thermo Scientific 51022222 Attached to spImager
Ecoline RE207 Lauda RE207 Attached to Cytomat
spImager with carousel S&P Robotics Inc Custom Automated high resolution imaging
Robot pin tool fixture for FP12pins V&P Scientific AFIX96FP12 N/A
96 x FP12 pins V&P Scientific FP12 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length
Docking Station for Pin Tool V&P Scientific VP425 Docking station base removed to allow fan drying of pins
Pin Cleaning Brush V&P Scientific VP425 N/A
Replica Plater Sigma R-2508 Manual pin tool
Nunc OmniTray with Lid Nunc 734-0490 N/A
96 well sterile polystyrene plates Greiner BioOne 655161 N/A
96 well sterile polystyrene lids Greiner BioOne 656171 N/A

Table 3. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects. PLoS Genetics. 7, (4), e1001362 (2011).
  2. Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 180, 2251-2266 (2008).
  3. Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar. BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).
  4. Colonyzer - Image analysis software [Internet]. Newcastle University. Newcastle, UK. Available from: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/ (2012).
  5. Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
  6. Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  7. qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. University of Vienna. Vienna, Austria. Available from: http://qfa.r-forge.r-project.org/ (2012).
  8. Blomberg, A. Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping. Curr. Opin. Biotechnol. 22, (1), 94-102 (2011).
  9. Maringele, L., Lydall, D. EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants. Genes and Dev. 16, (15), 1919-1933 (2002).
  10. Warringer, J., Blomberg, A. Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20, 53-67 (2003).
  11. Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, (5874), 362-365 (2008).
  12. Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries. J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).
  13. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).
  14. Queller, C. Behavioural ecology: The social side of wild yeast. Nature. 456, 589-590 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics