Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

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Biology
 

Summary

Análisis de aptitud cuantitativa (QFA) es una serie complementaria de los métodos experimentales y computacionales para la estimación de eficacias de cultivos microbianos. QFA estima el efecto de mutaciones genéticas, medicamentos u otros tratamientos aplicados en el crecimiento de microbios. Los experimentos de escala a partir del análisis de las culturas individuales enfocada a miles de culturas paralelas se pueden diseñar.

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Banks, A. P., Lawless, C., Lydall, D. A. A Quantitative Fitness Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (66), e4018, doi:10.3791/4018 (2012).

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Abstract

Análisis de aptitud cuantitativa (QFA) es un flujo de trabajo experimental y computacional para la comparación de eficacias de los cultivos microbianos crecido en paralelo 1,2,3,4. QFA se puede aplicar a las observaciones de las culturas centradas individuales, pero es más útil para todo el genoma interacción genética o la investigación de análisis de drogas a miles de culturas independientes. El método experimental central es la inoculación de independientes, diluidas cultivos líquidos microbianos sobre discos de agar sólidos que son incubados y se fotografiaron con regularidad. Las fotografías de cada punto de tiempo se analizan, produciendo cuantitativos estimaciones de la densidad de células, que se utilizan para construir curvas de crecimiento, lo que permite medidas cuantitativas aptitud para ser derivado. Eficacias Cultura se puede comparar a cuantificar y clasificar las fortalezas genéticas de interacción o de sensibilidad a los medicamentos. El efecto sobre la aptitud cultivo de cualquier tratamiento añadido en agar sustrato (por ejemplo, pequeñas moléculas, antibióticos o nutrientes) o se aplica a placas externoly (irradiación UV, por ejemplo, temperatura) se puede cuantificar por QFA.

El flujo de trabajo QFA produce tasa de crecimiento estima análoga a los obtenidos por medición espectrofotométrica de paralelas cultivos líquidos en los lectores de placas de 96 pocillos o bien 200. Es importante destacar que QFA tiene el rendimiento significativamente mayor en comparación con estos métodos. Culturas QFA crecer en una superficie de agar sólido y por lo tanto bien aireado durante el crecimiento sin la necesidad de agitación o agitación.

QFA rendimiento no es tan alta como la de algunos matriz sintética genética (SGA) de los métodos de detección 5,6. Sin embargo, ya que las culturas están fuertemente QFA diluido antes de ser inoculadas en agar, QFA puede capturar las curvas de crecimiento más completos, incluyendo las fases exponencial y la saturación de 3. Por ejemplo, las observaciones de la curva de crecimiento permiten tiempos de la cultura de duplicación que se calcula directamente con la alta precisión, como se indicó anteriormente 1.

Aquí les presentamos unaprotocolo específico de QFA aplicado a miles de S. culturas cerevisiae, que se gestionan automáticamente mediante robots durante la inoculación, incubación y de imagen. Cualquiera de estos pasos automatizados puede ser sustituido por un procedimiento equivalente, manual, con una reducción asociada en el rendimiento, y que también presentan un protocolo de instrucciones rendimiento más bajo. Las mismas herramientas de software QFA se puede aplicar a las imágenes capturadas, ya sea en flujo de trabajo.

Tenemos amplia experiencia en la aplicación de QFA a los cultivos de la levadura de gemación S. cerevisiae, pero esperamos que QFA será igualmente útil para examinar las culturas de la levadura de fisión S. pombe y cultivos bacterianos.

Protocol

Manual de Protocolo QFA (por cepas de S. cerevisiae)

1. El cultivo de las cepas de levadura

  1. Hasta 96 cepas de levadura independientes se cultivaron en 200 l de medios líquidos ricos en un plato de cultivo de 96 pocillos. Las cepas se cultivan a la saturación en un incubador de temperatura controlada.
  2. Un pasador 96, 1/8 "de diámetro manual de réplica chapista (SIGMA R-2508) se esteriliza por primera inmersión del chapista réplica en etanol al 100%, llamas y luego dejando que se enfríe.
  3. 200 l de agua estéril se dispuestos en una placa de cultivo de 96 pocillos. Los cultivos saturados se agitaron (Eppendorf MixMate, 30 segundos, 750 rpm) y se diluyó por inmersión de la herramienta pasador esterilizada en las cepas saturados tres veces y luego en la placa que contiene el agua una vez.
  4. La herramienta de pasador se re-esterilizados como por 1,2.
  5. La herramienta pasador esterilizada se utiliza para detectar el cultivo diluido en placas de agar vendidos por inmersión en la placa que contiene el cultivo diluido tres veces losn la transferencia de la herramienta de contactos a una placa de agar sólido rectangular.
  6. Las placas rectangulares sólidos de agar se incubaron a una temperatura adecuada antes de ser fotografiado de forma manual con un S & P Robótica spImager. Los métodos alternativos de captura de imágenes puede también ser utilizado como una FujiFilm LAS4000, o una cámara digital SLR más barato si se tiene cuidado para asegurar una iluminación uniforme y el posicionamiento de la placa coherente en relación con la cámara de imágenes.
  7. El método es adaptable a un menor número de cultivos paralelos, tales como 48, que pueden ser montados en placas de Petri redondas si se tiene cuidado para asegurar el ángulo relativo mismo a la cámara de imagen durante cada fotografía.

Totalmente automatizado QFA Protocolo (por cepas de S. cerevisiae)

2. El cultivo de las cepas de levadura

  1. Comience con una matriz rectangular de cepas de levadura de cultivo independientes en agar sólido. En este ejemplo, las cepas de partida son el resultado de cruzar una temperaturamutación sensible a consulta con la colección de eliminación de levadura (YDC) por Array genético sintético (SGA). Finales placas SGA se encuentran en formato de 1536. Se trata de 16 filas por 24 columnas de las colonias y culturas que representan cuatro repeticiones de 384 cepas de levaduras independientes. Ver Figura 1 para los diseños de las placas.
  2. 384 cepas fuera de 1536 se transfieren mediante un robot de S & P Robotics Inc BM3-SC robot con un pasador 96, 1-mm pintool diámetro del pasador estéril en cuatro placas de cultivo de 96-pocillos que contenían 200 l de medios selectivos (Figura 1). Pintool limpieza y esterilidad se consigue mediante secuencialmente lavado en agua estéril dos veces (una vez con un cepillo rotatorio para eliminar los desechos), 70% de etanol (con sonicación) y finalmente etanol 100%.
  3. Los cultivos se envían a la saturación (durante tres días a 20 ° C en este ejemplo, ver Figura 1).

3. Detectar cultivos de levadura

  1. Usando un Beckman Biomek FX, cultivos saturados unanuevamente volvió a suspender por agitación en un Teleshake Variomag (en sentido antihorario a 1000 rpm durante 20 segundos) y se diluyó aproximadamente a 1:70 fijando en 200 l de agua estéril utilizando una aguja estéril 96 herramienta de Pin Pin robótica (V & P Científico de montaje magnético pintool, 2 mm de diámetro del pasador). Pin limpieza y esterilidad herramienta se consigue mediante lavado en agua estéril, lavado en etanol al 70% (con un cepillo para eliminar los desechos) y finalmente inmersión en etanol al 70% seguido de secado.
  2. Culturas diluidas se colocan sobre placas de agar sólido en formato de 384 utilizando la misma herramienta robótica pines (ver Figura 1) después de la limpieza y la esterilización.
  3. Después de clavos, placas se transfieren a una temperatura controlada Cytomat, incubador humidificado con carrusel automático y escotilla de acceso.

4. Captura de imágenes

  1. El S & P Robótica automatizado de imágenes repetidas ocasiones elimina las placas de la incubadora Cytomat, quita la tapa del plato, coloca precisamente en virtud de un adjuntod, el espacio uniformemente iluminado por debajo de una cámara Canon EOS Rebel Ti 35 mm réflex digital, captura una imagen en la resolución de 5184 x 3456 píxeles, sustituye a la tapa de la placa, y los devuelve al carrusel de la incubadora. Una imagen se captura inmediatamente después de la transferencia inicial a la incubadora para permitir una medición del crecimiento tiempo cero punto (fondo). El manejo del robot y la fotografía es de 2 minutos por plato.
  2. Con un carrusel a plena carga, la máxima alcanzable imagen placa frecuencia de captura es una fotografía cada seis horas. Las placas se incuban durante un máximo de seis días (hasta la saturación de la colonia de crecimiento. La figura 1 muestra tres imágenes típicas de un curso de duración a 20 ° C.
  3. Para fines de seguimiento, las placas se denominan según el nombre de la incubadora, la temperatura, el número único de lote secuencial y la posición en la incubadora. Los nombres de imágenes son una concatenación de nombre de la placa y la marca de tiempo y automáticamente se construye sobre la captura de imágenes (por ejemplo, K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, Archivo FT Tipo1, Tabla 1).

5. La captura de metadatos Experimental

Los archivos de metadatos que se describen en esta sección son archivos delimitados por tabuladores de texto que se generan de forma manual (por ejemplo, utilizando el software de hoja de cálculo). El archivo Descripción experimental (Tabla FT2, 1) es único para cada experimento, pero la descripción de biblioteca (T3L, Tabla 1) puede ser re-utilizado ampliamente una vez construido.

  1. El experimento se describe en el archivo de descripción experimental (FT2, Tabla 1) que contiene las columnas de código de barras (o el nombre se genera automáticamente la placa), fecha y hora de partida experimento, el tratamiento de la placa, el contenido de un medio de agar sólido, nombre de pantalla, la biblioteca, número de placa (para las bibliotecas con múltiples placas) y un número de repetición de cuadrantes (ver Figura 1) para la ampliación por debajo de 1536 a 384 en formato en formato.
  2. La biblioteca de la cepa de levadura se describe con un archivo de descripción de biblioteca (FT3,
  3. Un opcional de archivo estándar Gen (FT4, Tabla 1) que describe el nombre del gen estándar (por ejemplo Rad9) asociada a cada ORF y sistemática de números (por ejemplo, YDR217C) la identificación de las cepas examinadas se puede proporcionar. Este archivo contiene dos columnas: Nombre del ORF & Gene.

6. Análisis de Datos

El flujo de trabajo QFA computacional requiere el acceso a una estación de trabajo razonablemente potente equipo multi-núcleo (por ejemplo, un Dell Precision T3500 con Xeon de cuatro núcleos del procesador 2,67 GHz y memoria RAM 12 Gb) en la que se ha instalado la imagen Colonyzer herramienta de análisis de software y el paquete de 3,4 QFA R 7 , las cuales están documentadas en línea, son gratuitas y funcionan sobre una variedad de sistemas operativos.

  1. Ejecutar Colonyzer con cada una de las imágenes capturadas de la placa como de entrada, generando un archivo de salida Colonyzer (Tabla FT5 1) para cada imagen capturada. Colonyzer archivos de salida especifican las estimaciones de densidad, área de cultivo de la cultura, la forma y el color para cada uno de los 384 lugares en la placa de imágenes. Nombre del archivo de salida se copia automáticamente a partir del nombre de archivo de imagen de origen (por ejemplo, la fotografía la placa K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, Tabla 1) se corresponde con el archivo de salida Colonyzer K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, Tabla 1)).
  2. Usando el paquete QFA R, cargar los metadatos experimental (FT2, Tabla 1) y los archivos de salida (Tabla Colonyzer FT5 1). Estos datos se combinan en las tramas de datos de investigación (que se pueden exportar como archivos de texto QFA Raw Data (FT6, Tabla 1)) para su posterior análisis.
  3. El paquete QFA R contiene funciones para reunir curso temporal de la densidad celular para cada cultura, para adaptarse a generalizarse he aquímodelos sinérgica de la población a las observaciones y trazar los dos. (ver figuras 2 y 3 para ver ejemplos) Valores ajustados de los parámetros se escriben en archivos QFA parámetros logísticos (FT7 Tabla 1). Ver QFA paquete de documentación R para obtener más detalles.
  4. El paquete R QFA también contiene funciones para el control de calidad: las colonias de borde son descartados debido a la mayor disponibilidad de nutrientes en los bordes de la placa y la dificultad con el análisis de la imagen cerca de las paredes de la placa, las culturas que fallaron el SGA y los genotipos de mostrar la vinculación con los genes marcadores de pantalla específicos se eliminan del análisis.
  5. Varias medidas de aptitud cuantitativos se derivan de la logística parámetros de la población del modelo para cada cultura. Estos incluyen tasas máximas de duplicación de la población (MDR) y el número de divisiones de la inoculación a la saturación (MDP). Para cada conjunto de réplicas de culturas (de genotipo único, por ejemplo) y para cada definición de la aptitud, varias estadísticas de resumen de las estimaciones de la aptitud son un borradorbuido: la aptitud media y la mediana, desviación estándar y el gimnasio número de repeticiones observadas. Las estadísticas de resumen se emiten a los archivos QFA Resumen de fitness (FT8, Tabla 1) para su posterior análisis, por ejemplo, el cálculo de las puntuaciones de interacción genético (FT9 Tabla 1).

7. Los resultados representativos

La figura 2 muestra una curva de crecimiento típica de 384 culturas QFA crecimiento a 20 ° C en agar sólido como se cuantifica por Colonyzer, con aumento de la densidad celular primera convirtiendo detectable después de aproximadamente 2 días. Este retardo es probable un efecto combinado de una fase de retardo de cultivo después de la inoculación en un medio sólido y un límite inferior de detección de la densidad celular. Figura 3 muestra las curvas de crecimiento similares 308 capturados de una sola placa. Figura 4 muestra la comparación de dos genoma QFA pantallas para inferir genéticafuerzas de interacción (adaptado de 1). El paquete R QFA 7 también incluye funciones para producir la Figura 3 y para la salida de las listas de ranking de los genotipos examinados y estimaciones de las fuerzas de interacción genética (SIG), junto con un q-valor (False Discovery Rate (FDR), corregida p-valor) para el importancia de los SIG observado.

Figura 1
Figura 1. Esquema para la inoculación de cepas de levadura robótica en el formato de 384-punto. Este procedimiento se inicia con 1536 culturas independientes por placa (izquierda). En este ejemplo típico, las colonias en las posiciones 1,1; 1,2; 2,1 y 2,2 (color rojo) son cuatro repeticiones del mismo genotipo his3 :: culturas kanMX en amarillo, que crece en el borde de la placa. , tienen una ventaja de crecimiento debido a la falta de competencia y por lo tanto no examinados por QFA. Una de estas repeticiones (por ejemplo, 1,1) se inoculó en medio de crecimiento líquido en placa de 96 pocillos s usando una herramienta de 96-patillas que inocula 96 de 1536 colonias cada vez. Con el fin de inocular a una réplica de cada una de las 384 supresiones de genes diferentes, cuatro "cuadrantes" (indicado como rojo, azul, verde y morado) se inoculan en cuatro diferentes placas de 96 pocillos que contienen medios de cultivo. Después de un crecimiento a la saturación (por ejemplo 3 días a 20 ° C), las culturas se diluyen en agua, luego los cuatro cuadrantes de una repetición se vio en formato de 384-en una placa de agar sólido (derecha) en el mismo modelo que el original placa de trabajo sustancial y lucrativo (como se indica en color). El proceso se puede repetir para probar otro replica: 1,2; 2,1 y 2,2. Ejemplo de time-lapse imágenes de la derecha fueron capturados 0.5, 2 y 3,5 días después de la inoculación. Adaptado de la figura suplementaria 1 2. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

018/4018fig2.jpg "/>
Figura 2. Un solo robot capturado QFA curva de crecimiento. Una curva) QFA crecimiento de una cepa de levadura que crece en agar que contiene galactosa a 20 ° C. Las imágenes fueron capturados robóticamente aproximadamente cada 2 horas. Fase exponencial a esta temperatura era observable durante aproximadamente 1,5 días, con aumento de la densidad de cultivo primero convertirse detectables aproximadamente 2 días después de la inoculación. Un modelo logístico generalizado se ajustan a los datos observados (curva gris). Los parámetros del modelo de forma automática instalados por el paquete QFA I se presentan: K (capacidad de carga (UA)), r (tasa de crecimiento (d -1)), g (densidad de inóculo (UA)), v (simetría de crecimiento). B) En cuanto a grupo A, trazado con la densidad celular en una escala logarítmica. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3
Figura 3. Automáticamente gen curvas de crecimiento nominal capturado en paralelo desde un solo formato de placa de 384. Cada panel muestra las estimaciones de la densidad celular (cruces rojas) y el ajuste del modelo (curvas negras) de las culturas independientes marcados por su nombre gen u ORF-y el número crece en un procedimiento QFA. Esta placa fue fotografiada por ejemplo, robots y crecido en una incubadora automática a 20 ° C. Metadatos experimental se incluyen automáticamente en el título de la figura: nombre de la placa, el tratamiento de la placa, un medio de agar y el número de placa de la biblioteca. Valores de los parámetros del modelo empotrados también se imprimen automáticamente en cada panel (ver Figura 2). Culturas Edge fueron despojados a partir del análisis QFA, dejando a los 308 cultivos en esta parcela (ver QFA Protocolo 5.4). Dado que las culturas de borde no se analizan en QFA, estos lugares de cultivo suelen ser lleno de cepas de control neutros (PGAL HIS3-en este caso). La versión original de esta cifra, la producción en el paquete QFA R, está en formato pdf. Por lo que es infinitamente ampliable y puede buscarse por consultas de texto.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande figura.

Figura 4
Figura 4. Comparación de eficacias de dos pantallas QFA para deducir la interacción genética. Este gráfico muestra la comparación de la aptitud de las supresiones de levadura en ciernes (yfgΔ) combinada con la mutación neutra ura3Δ o la mutación sensible a la temperatura cdc13-1 y crecido a la temperatura semi-permisivo para cdc13- 1 (27 ° C). Con se calcula como el producto de la tasa de duplicación máximo y el potencial máximo de duplicación 1. La mayoría de supresión cepas crecen bien cuando se combina con el neutro mutación ura3Δ, como se esperaba y tienen aptitud alta, pero deleciones combinadas con cdc13-1 tienen una amplia gama de eficacias. Las líneas de color azul claro se cruzan en ªubicación e de la mutación neutra his3Δ, la línea continua es un modelo de regresión lineal de la independencia genética (fitness espera de cdc13-1 yfgΔ mutantes dado la aptitud de ura3Δ yfgΔ mutantes) y la línea de puntos es la línea de la aptitud de igualdad. Las supresiones de color verde para ampliar considerablemente el defecto físico de cdc13-1 cepas. Las supresiones de color rojo significativamente suprimir el mismo defecto. Distancia vertical de cualquier mutación cdc13-1 yfgΔ de la línea continua indica la fuerza de interacción entre genética cdc13-1 y yfgΔ bajo las condiciones de la placa. Tenga en cuenta que algunos de los más fuertes supresores de cdc13-1 han sido previamente identificado los genes de punto de control Rad17, DDC1 y Rad24 y la nucleasa Exo1 cerca de la parte superior derecha. Los genes cuya supresión reduce la aptitud incluyen YKU80 (que codifica para la reparación del ADN y los telómeros limitación proteínas Yku80) cerca de la abajo a la derecha. También tenga en cuenta que algunos grupos de genes que funcionan juntos tienden a estar ubicados en esta parcela. Tres grupos de ejemplo, se resalta en color azul SPE1, SPE2 y SPE3: los genes de síntesis, espermidina, DDC1 Rad17 y Rad24: componentes de codificación de la abrazadera del puesto de control de deslizamiento y el cargador puesto de control de la abrazadera, MRE11, RAD50 y XRS2: el complejo de MRX, que participan en DDR y EST1 y est3: los genes implicados en la regulación longitud de los telómeros. Adaptado de 1B complementaria la figura 1, los datos en bruto del que se ha generado esta parcela se puede descargar desde aquí: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . Haga clic aquí para ver más grande la figura .

"> Archivo ID Tipo de Archivo Construido de forma manual Frecuencia de actualización Requisito previo FT1 Placa de la fotografía No Por plato y punto de tiempo Sí FT2 Descripción Experimental Sí Por experimento Sí FT3 Descripción de la librería Sí Por la biblioteca Sí T4L Los nombres estándar de genes Sí Por la biblioteca No FT5 Colonyzer salida de la señal No Por punto de tiempo por placa Sí FT6 QFA datos sin procesar No Por experimento - FT7 No Por experimento - FT8 QFA Gimnasio Resumen No Por experimento - FT9 QFA Hitlist interacción genética No Por estudio de GIS (2 expts.) -

Tabla 1. Los ficheros electrónicos de QFA. Todos los archivos que aparecen (exceptuando FT1) son delimitados por tabuladores archivos de texto y se puede construir o leer con cualquier editor de texto o una hoja de cálculo. Para más detalles sobre la construcción de archivos de metadatos y la interpretación QFA precisa de la producción QFA por favor, consulte la documentación del paquete de QFA R 7 y la documentación del software Colonyzer 3.

Tabla 2
Tabla 2. Métodos para evaluar la aptitud de cultivo. Un resumen de las características y requierenmentos de un número de métodos para evaluar la aptitud cultivo microbiano. Una revisión de Blomberg 8 contiene comparación más detallada de algunos de ellos. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Discussion

QFA es en muchos sentidos, un descendiente directo de los tres establecidos a escala de banco técnicas microbiológicas: cultura dilución, pruebas in situ de la serie 9, la determinación de la curva de crecimiento en cultivos líquidos aireados y las planchas del 9 de réplica 13. Estos tres métodos se resumen y se comparan con QFA y otras técnicas de alto rendimiento en la Tabla 2. Considerando que la dilución, pruebas in situ de la serie definirá la aptitud de una cepa como su capacidad de formar colonias en una serie de culturas cultivadas a partir de una serie de diluciones del inóculo, QFA gimnasio cepa medidas por parte de las observaciones repetidas de una misma cultura para construir una curva de crecimiento. Cuantificación de la aptitud de los cultivos individuales permite muchas cepas más a ser examinada simultáneamente, bajo condiciones idénticas. Replicar las matrices de las culturas permite repetir la prueba de las colecciones de la cepa, el más útil cuando las pruebas de diferencias de aptitud de cultivo en diferentes ambientes o las bases genéticas. El protocolo presentado QFAaquí utiliza equipos robóticos costosas de duplicar, inocular, incubar y las placas de agar de imagen, adecuada para observar el crecimiento de miles de culturas independientes (robótica QFA, Tabla 2). Sin embargo, puesto QFA se basa en técnicas establecidas, de laboratorio tradicionales, sino que también puede llevarse a cabo mucho más barata mediante la sustitución de asistencia robot con pasos Manual (Manual de QFA, Tabla 2). Manual de QFA implica la replicación y la inoculación de los cultivos sobre discos de agar con una herramienta manual de pin y la transferencia manual de las placas hacia y desde una incubadora para la fotografía. El flujo de trabajo mismo análisis computacional puede ser aplicado para generar curvas de crecimiento de cualquier diseño experimental.

QFA estimaciones salud física parecen ser relativamente precisa. En la Figura 4, las eficacias medias de cuatro grupos de ejemplo de supresiones de genes funcionalmente relacionados se destacan. La proximidad de los miembros de cada clase de genes relacionados funcionalmente en dos independenciarentes orígenes genéticos (ura3Δ y cdc13-1) indica la reproducibilidad de QFA estimaciones de fitness. Por ejemplo, sólo tres supresiones de genes (de un máximo de 4.300) separar a los tres miembros del complejo MRX conservada.

De alto rendimiento alternativas a QFA para probar las características de crecimiento de cepas microbianas incluyen SGA 5,6, las pantallas de la competencia en las bibliotecas de código de barras y pantallas de captura de 11,12 cinética de la densidad óptica de lectores de placas espectrofotométrico 10, que se resumen en la Tabla 2 y se describe más detalladamente en otro lugar 8 . QFA y placas SGA, donde las culturas crecen en las superficies de agar agar (sólidos basados ​​en métodos, Cuadro 2) se puede manejar de forma rápida y fácil por el robot. Sólidos culturas superficie del agar son bien aireado durante todo el crecimiento y las células pueden crecer en cultivos fijos, permitiendo microbios sociables a crecer en una comunidad 14. Dejado a las comunidades microbianas intactas, unFECTOS sus propios micro-ambientes, toxinas que secretan tales como etanol, y posiblemente de señalización entre las células. Sin embargo, la continua mezcla de culturas líquidas, necesarias para lograr una aireación adecuada, de forma artificial altera las comunidades microbianas y sus entornos de microorganismos que puedan afectar a su modo de crecimiento. La contaminación cruzada es una preocupación menor en los métodos de agar sólido ya que hay menos oportunidad para que las salpicaduras de líquidos que transportan las células entre las culturas. Si se produce contaminación por el aire exterior transmitidas por microbios en los ensayos de agar sólido, a menudo puede ser detectada mediante inspección visual de las placas de agar sólido y representó o eliminado.

Rendimiento QFA es significativamente mayor que la de paralelas métodos líquidos de dos maneras. En primer lugar, en QFA (y SGA) placas, cultivos inoculados se empaquetan con mayor densidad, lo que las culturas más independientes por placa. En QFA normalmente hay 308 culturas, sin contar las no experimentales culturas de borde (Figura 1) comcomparación en paralelo cultivos líquidos con 96 o 100 por placa culturas. En segundo lugar, los experimentos QFA se puede escalar a un número mucho mayor de las placas. Considerando que el número de placas analizadas en un único experimento QFA sólo está limitado por el espacio disponible en una sala de incubadora o caliente, la frecuencia mínima permisible de captura de imágenes y la frecuencia máxima alcanzable captura, el número de placas en un experimento de crecimiento líquido es fuertemente limitado por la capacidad del lector de placas (normalmente una o dos placas), o del apilador unido al lector de placas (típicamente 25-50 placas). Recientemente hemos llevado a cabo un experimento QFA totalmente automatizado en 123 platos, cada uno con 308 cultivos experimentales, dando 37.884 cultivos simultáneos. Se estima que el número máximo posible de las culturas de cultivo independientes en el líquido es de 96 (cultivos / placa) x 50 (placas / apilador) = 4,800, que es de alrededor de diez veces menor que nuestro rendimiento QFA. Una alternativa para las pantallas de cultivo líquidos es utilizar muchas gro automatizadowth dispositivos en paralelo (Tabla 1 de la revisión de Blomberg 8), cada uno con una capacidad de uno o dos platos. El control de temperatura en cada dispositivo es independiente, y así que las condiciones no son idénticas, pero suponiendo que lo sean, este flujo de trabajo que requieren al menos 190 dispositivos de este tipo para que coincida con el rendimiento QFA (suponiendo 200 cultivos líquidos por dispositivo).

En resumen, QFA es un flujo de trabajo de alta calidad que pueden ser útiles para obtener los caracteres cuantitativos de crecimiento en los dos pequeños experimentos a escala centrados y pantallas de alto rendimiento. Es lo suficientemente flexible para ser aplicado eficazmente con diferentes requisitos para el equipo robótico. El componente de cálculo del flujo de trabajo QFA se basa en libre disposición, el código fuente abierto.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Queremos agradecer a todos los miembros de nuestro laboratorio y el Centro para la Biología de Sistema Integrado de Envejecimiento y Nutrición (CISBAN) para el apoyo y útiles debates. Este estudio fue apoyado por las Ciencias Biológicas y la Biotecnología Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) y el Wellcome Trust (075294, 093088).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replica Plater Sigma R-2508 96 pin manual pintool with 1/8 " diameter pins
Mix Mate Eppendorf 5353 000.014
Biomek FX Beckman A31842
Teleshake Thermo Scientific 50095890 Installed on Biomek FX
BM3-SC S&P Robotics Inc BM3-SC 192 shelf rotating carousel
spImager S&P Robotics Inc spImager High resolution manual imaging
spImager with Cytomat S&P Robotics Inc Custom Temperature controlled automated high resolution imaging
Cytomat 6001 with heat exchanger Thermo Scientific 51022222 Attached to spImager
Ecoline RE207 Lauda RE207 Attached to Cytomat
spImager with carousel S&P Robotics Inc Custom Automated high resolution imaging
Robot pin tool fixture for FP12pins V&P Scientific AFIX96FP12 N/A
96 x FP12 pins V&P Scientific FP12 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length
Docking Station for Pin Tool V&P Scientific VP425 Docking station base removed to allow fan drying of pins
Pin Cleaning Brush V&P Scientific VP425 N/A
Replica Plater Sigma R-2508 Manual pin tool
Nunc OmniTray with Lid Nunc 734-0490 N/A
96 well sterile polystyrene plates Greiner BioOne 655161 N/A
96 well sterile polystyrene lids Greiner BioOne 656171 N/A

Table 3. Specific reagents and equipment.

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References

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