Un flux de travail de remise en forme Analyse quantitative

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Biology
 

Summary

Analyse quantitative de remise en forme (QFA) est une série complémentaire de méthodes expérimentales et de calcul pour estimer fitnesses cultures microbiennes. QFA estime l'effet de mutations génétiques, les médicaments ou autres traitements appliqués sur la croissance des microbes. Mise à l'échelle des expériences de l'analyse ciblée des cultures en un seul à des milliers de cultures parallèles peuvent être conçus.

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Banks, A. P., Lawless, C., Lydall, D. A. A Quantitative Fitness Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (66), e4018, doi:10.3791/4018 (2012).

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Abstract

Analyse quantitative de remise en forme (QFA) est un flux de travail expérimental et de calcul pour comparer fitnesses de cultures microbiennes cultivées en 1,2,3,4 parallèle. QFA peut être appliquée à des observations ciblées de cultures en un seul, mais est très utile pour l'ensemble du génome d'interaction génétique ou de dépistage de drogues de l'enquête jusqu'à des milliers de cultures indépendantes. La méthode expérimentale centrale est l'inoculation des indépendants, diluer le liquide cultures microbiennes sur des plaques d'agar solides qui sont incubés et régulièrement photographié. Photographies de chaque point dans le temps sont analysés, la production des estimations quantitatives de densité de cellules, qui sont utilisés pour construire des courbes de croissance, ce qui permet des mesures de remise en forme quantitatifs pour être dérivée. Fitnesses Culture peut être comparé à quantifier et de classer les forces d'interaction génétiques ou sensibilités aux médicaments. L'effet sur l'aptitude de la culture de tous les traitements ajouté dans la gélose substrat (par exemple les petites molécules, des antibiotiques ou des nutriments) ou appliqués sur des plaques externesment (par exemple l'irradiation UV, température) peut être quantifiée par QFA.

Le flux de travail QFA produit le taux de croissance les estimations analogues à ceux obtenus par mesure spectrophotométrique de parallèles cultures liquides dans les lecteurs de plaques à 96 puits ou 200 puits. Il est important, QFA a un débit nettement plus élevé par rapport à ces méthodes. Cultures QFA croître sur une surface de la gélose solide et sont donc bien aéré pendant la croissance sans la nécessité d'agitation ou secousses.

Débit QFA n'est pas aussi élevé que celui de certains antenne synthétique génétique (SGA) les méthodes de dépistage 5,6. Cependant, puisque les cultures QFA sont fortement dilués avant d'être ensemencé sur une gélose, QFA peut capturer des courbes de croissance plus complètes, y compris les phases de saturation exponentielle et 3. Par exemple, les observations des courbes de croissance permettent des temps de doublement de la culture à estimer directement avec une grande précision, tel que discuté précédemment 1.

Nous présentons ici unespécifique QFA protocole appliqué à des milliers de S. cultures cerevisiae qui sont automatiquement gérés par des robots lors de l'inoculation, l'incubation et l'imagerie. N'importe laquelle de ces étapes automatisées peuvent être remplacés par un équivalent, une procédure manuelle, avec une réduction du débit associé, et nous présentons également un protocole inférieure débit manuel. Les mêmes outils logiciels QFA peut être appliqué aux images capturées dans les deux flux de travail.

Nous avons une vaste expérience application QFA à des cultures de la levure bourgeonnante S. cerevisiae, mais nous nous attendons à ce que QFA va se révéler tout aussi utile pour examiner les cultures de la levure à fission S. pombe et des cultures bactériennes.

Protocol

Manuel QFA Protocole (pour les souches de S. cerevisiae)

1. Les souches culture de levure

  1. Jusqu'à 96 souches de levure indépendantes sont cultivées dans 200 pi de riches milieux liquides dans une boîte de culture de 96 puits. Les souches sont cultivées à la saturation dans une étuve à température contrôlée.
  2. Une goupille 96, 1/8 "de diamètre manuelle réplique Plater (SIGMA R-2508) est stérilisé d'abord tremper le plaqueur réplique dans de l'éthanol à 100%, flamboyante, puis en laissant refroidir.
  3. 200 pi d'eau stérile est vêtue d'une plaque de culture à 96 puits. Les cultures sont saturés vortex (Eppendorf MixMate, 30 sec, 750 rpm) et dilué par trempage de l'outil broches stérilisé dans les souches saturés trois fois, puis dans la plaque contenant l'eau une fois.
  4. L'outil broche est re-stérilisés selon 1.2.
  5. L'outil est stérilisé broches utilisé pour repérer la culture diluée sur des géloses vendus par trempage dans l'assiette contenant la culture diluée trois fois lesn transfert de l'outil broches sur une plaque de gélose solide rectangulaire.
  6. Les plaques rectangulaires agar solides sont incubés à une température appropriée avant d'être imagé manuellement à l'aide d'un S & P Robotics spImager. D'autres méthodes de capture d'image peut également être utilisé comme un FujiFilm LAS4000, ou un moyen moins coûteux appareil photo reflex numérique, si l'on prend soin d'assurer un éclairage uniforme et cohérente de positionnement plaque par rapport à la caméra.
  7. La méthode est adaptable à de plus petits nombres de cultures parallèles, tels que 48, qui peuvent être montés sur des boîtes de Pétri rondes, si l'on prend soin d'assurer la même angle par rapport à la caméra d'imagerie au cours de chaque photographie.

Fully Automated QFA Protocole (pour les souches de S. cerevisiae)

2. Les souches culture de levure

  1. Commencez avec un tableau rectangulaire de souches de levure indépendantes qui poussent sur gélose solide. Dans cet exemple, les souches de départ sont le résultat du croisement une températuremutation requête sensible à la collection de levure Suppression (JAN) par Array génétique synthétique (SGA). Finales plaques SGA sont en 1536 en format. C'est 16 lignes par 24 colonnes de colonies et cultures représentant quatre répétitions de 384 souches de levures indépendants. Voir Figure 1 pour les mises en plaque.
  2. 384 souches de 1536 sur sont transférés en utilisant un robot S & P Robotics Inc BM3-SC robot avec une broche 96, 1-mm diamètre de la tige stérile pintool en quatre plaques de culture 96 puits contenant 200 ul de milieux sélectifs (Figure 1). La propreté et la stérilité Pintool est réalisée de manière séquentielle à laver dans l'eau stérile (une fois avec une brosse rotative pour enlever les débris), l'éthanol à 70% (avec sonication) et, enfin, l'éthanol à 100%.
  3. Les cultures sont cultivées à la saturation (pour trois jours à 20 ° C dans cet exemple, voir Figure 1).

3. Spotting Yeast Cultures

  1. L'utilisation d'un Beckman Biomek FX, les cultures saturées unere remis en suspension par vortex sur une Teleshake Variomag (dans le sens antihoraire à 1000t/min pendant 20 secondes) et dilué d'environ 1:70 en épinglant dans 200 ul d'eau stérile en utilisant un outil stérile 96 broches broches robotique (V & P scientifique de montage magnétique pintool, 2 mm diamètre de la tige). La propreté et la stérilité outil Pin est réalisé par lavage à l'eau stérile, lavage à l'éthanol 70% (avec une brosse pour enlever les débris) et, enfin, trempage dans de l'éthanol à 70% suivie d'un séchage.
  2. Cultures dilué sont déposés sur des plaques d'agar solides dans le format 384 en utilisant l'outil même axe robotique (voir figure 1) après le nettoyage et la stérilisation.
  3. Après ancrage, plaques sont transférées à une température contrôlée Cytomat, incubateur humidifié avec carrousel automatique et trappe d'accès.

4. Capture d'image

  1. Un S & P Robotics automatisé imageur supprime plusieurs reprises les plaques de l'incubateur Cytomat, supprime le couvercle de la plaque, les place précisément en vertu d'un jointd, espace uniformément éclairé sous un Canon EOS Rebel Ti DSLR 35mm, capture une image à la résolution 5184 x 3456 px, remplace le couvercle de la plaque, et les renvoie vers le carrousel incubateur. Une image est capturée immédiatement après le transfert initial de l'incubateur pour permettre un temps de mesure de la croissance zéro (fond). Robot de manutention et de la photographie prend 2 minutes par plaque.
  2. Avec un carrousel à pleine charge, la fréquence maximale atteignable capture plaque image est une photographie toutes les six heures. Les plaques sont incubées pendant six jours (jusqu'à saturation croissance de la colonie. La figure 1 montre trois images typiques d'une époque bien sûr-à 20 ° C.
  3. Pour des fins de suivi, les plaques sont nommés selon le nom de l'incubateur, la température, numéro de lot unique séquentielle et la position dans l'incubateur. Noms d'images sont une concaténation du nom de la plaque et l'horodatage et sont automatiquement construits sur la capture d'image (par exemple K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, FT Type de fichier1, tableau 1).

5. Capturez des métadonnées expérimentale

Les fichiers de métadonnées décrits dans cette section sont des fichiers texte délimités par des tabulations qui sont générées manuellement (par exemple en utilisant un tableur). Le fichier de description expérimentale (FT2, tableau 1) est unique à chaque expérience, mais la Bibliothèque Description (FT3, tableau 1) peut être ré-utilisé abondamment une fois construit.

  1. L'expérience est décrite dans le fichier de description expérimentale (FT2, tableau 1) contenant des colonnes pour codes à barres (ou le nom de plaque généré automatiquement), timestamp expérience de départ, le traitement de plaque, le contenu de gélose solide, un nom d'écran, une bibliothèque, numéro de la plaque (pour les bibliothèques avec plusieurs plaques) et un certain nombre de répétition quadrants (voir Figure 1) pour révision à la baisse de 1536 à 384 en format format.
  2. La bibliothèque souche de levure est décrit avec un fichier de description de la bibliothèque (FT3,
  3. Une option de fichier standard Nom Gene (FT4, Tableau 1) décrivant le nom du gène standard (par exemple Rad9) associé à chaque systématique ORF y nombre (par exemple YDR217C) l'identification des souches étant projetés peuvent être fournis. Ce fichier contient deux colonnes: nom ORF & Gene.

6. Analyse des données

Le QFA flux de calcul nécessite un accès à un poste de travail informatique multicœur assez puissant (par exemple un Dell Precision T3500 avec Xeon quad-core 2,67 GHz et 12 Go de RAM) sur lequel est installé l'image Colonyzer logiciel d'analyse de l'outil et le paquet 3,4 QFA R 7 , qui tous deux sont documentés en ligne, sont disponibles gratuitement et fonctionner sur une gamme de systèmes d'exploitation.

  1. Exécuter Colonyzer avec chacune des images capturées de la plaque en entrée, générer un fichier de sortie Colonyzer (Tableau FT5 1) pour chaque image capturée. Les fichiers de sortie Colonyzer préciser les estimations de densité de la culture, de la région de la culture, la forme et la couleur pour chacun des 384 emplacements sur la plaque imagée. Nom de fichier de sortie est automatiquement copié à partir du nom du fichier image source (par exemple la photographie la plaque K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, tableau 1) correspond au fichier de sortie Colonyzer K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, Tableau 1)).
  2. En utilisant le package QFA R, charger les métadonnées expérimentale (FT2, tableau 1) et les fichiers de sortie Colonyzer (tableau FT5 1). Ces données sont fusionnées dans des trames de données R (qui peut être exporté en tant QFA fichiers Raw données de texte (FT6, Tableau 1)) pour une analyse plus approfondie.
  3. Le paquet contient des fonctions QFA R pour recueillir timecourses densité cellulaire pour chaque culture, pour s'adapter à généraliser loles modèles de population Gistic aux observations et à l'intrigue à la fois. (voir les figures 2 et 3 pour des exemples) Les valeurs des paramètres ajustés sont écrites dans des fichiers de paramètres logistiques (QFA FT7 tableau 1). Consultez la documentation de QFA package R pour plus de détails.
  4. Le paquet QFA R contient également des fonctions de contrôle de qualité: les colonies de bord sont mis au rebut en raison de la plus grande disponibilité des éléments nutritifs sur les bords de la plaque et de la difficulté avec l'analyse d'image à proximité des murs de plaques, des cultures qui n'ont pas la SGA et les génotypes afficher les liens avec les gènes marqueurs de l'écran-spécifiques sont supprimés de l'analyse.
  5. Plusieurs mesures de remise en forme quantitatives proviennent de paramètres du modèle logistique de la population pour chaque culture. Il s'agit notamment des taux maximum de doublement de population (MDR) et le nombre de divisions de l'inoculation de la saturation (MDP). Pour chaque ensemble de cultures répétées (de génotype unique par exemple) et pour chaque définition de remise en forme, les statistiques sommaires de plusieurs estimations de remise en forme sont comptribué: moyenne et la médiane de remise en forme, fitness écart-type et le nombre de répétitions observées. Les statistiques sommaires sont les fichiers de sortie QFA Résumé Fitness (FT8, tableau 1) pour une analyse plus poussée, par exemple, le calcul des scores d'interaction génétiques (FT9 tableau 1).

7. Les résultats représentatifs

La figure 2 montre une courbe de croissance typique de cultures QFA 384 croissants à 20 ° C sur gélose solide, telle que quantifiée par Colonyzer, avec une augmentation de la densité de la première cellule devient détectable après environ deux jours. Ce retard est probablement un effet combiné de la phase de latence après l'inoculation de la culture sur milieu solide et une limite inférieure de détection de la densité cellulaire. La figure 3 montre les courbes de croissance similaires 308 capturés à partir d'une seule plaque. La figure 4 montre la comparaison de deux l'échelle du génome écrans QFA d'inférer génétiqueforces d'interaction (adapté de 1). Le QFA package R 7 inclut également des fonctions pour produire la figure 3 et pour sortir des listes classées de génotypes examinés et les estimations de la force d'interaction génétique (SIG), avec une valeur q (False Discovery Rate (FDR) a corrigé p-valeur) pour le l'importance des SIG observée.

Figure 1
Figure 1. Schéma pour l'inoculation de souches de levures robotique en 384 place le format. Cette procédure commence par 1536 cultures indépendantes par plaque (à gauche). Dans cet exemple typique, les colonies à des positions 1,1; 1,2; 2,1 et 2,2 (couleur rouge) sont quatre répétitions du même génotype his3 :: cultures kanMX en jaune, de plus en plus sur le bord de la plaque. , ont un avantage de croissance en raison du manque de concurrence et ne sont donc pas examinées par QFA. L'une de ces répétitions (par exemple 1,1) est inoculé dans un milieu de croissance liquide en plaque de 96 puits s en utilisant un outil à 96 broches qui inocule 96 sur 1536 colonies à chaque fois. Afin d'inoculer une répétition pour chacun des 384 suppressions de gènes, quatre différents "quadrants" (indiqué en rouge, bleu, vert et violet) sont inoculés dans quatre différentes plaques à 96 puits contenant un milieu de croissance. Après une croissance de la saturation (par exemple 3 jours à 20 ° C), les cultures sont diluées dans l'eau, puis les quatre quadrants de l'une répétition sont repérés à 384 format sur une plaque de gélose solide (à droite) dans le même schéma que la plaque d'origine SGA (comme indiqué par la couleur). Le processus peut être répété pour tester d'autres répliques: 1,2; 2,1 et 2,2. Exemple time-lapse images sur le droit ont été capturés 0,5, 2 et 3,5 jours après l'inoculation. Adapté à partir du 1er figure supplémentaire 2. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 2. Un seul robot capturé courbe de croissance QFA. Une courbe) la croissance QFA d'une souche de levure de plus en plus sur le galactose agar contenant à 20 ° C. Les images ont été capturées robotique environ toutes les 2 heures. Phase exponentielle à cette température a été observée pendant environ 1,5 jours, avec une augmentation de la densité de la culture d'abord devenir détectable environ 2 jours après l'inoculation. Un modèle logistique généralisée a été ajustée aux données observées (courbe grise). Les paramètres du modèle automatiquement installés par le paquet QFA R sont présentés: K (capacité de charge (UA)), r (taux de croissance (d -1)), g (densité de l'inoculum (UA)), v (symétrie de croissance). B) En ce qui concerne la partie A, tracées avec la densité cellulaire sur une échelle logarithmique. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. Automatiquement gène courbes de croissance noté capturé en parallèle à partir d'un seul format de plaque 384-. Chaque panneau présente les estimations de densité cellulaire (croix rouges) et ajuster le modèle (courbes noires) pour les cultures indépendantes marquées par nom de gène ou ORF y nombre grandi dans une procédure QFA. Cette plaque a été par exemple imagé par un robot et cultivées dans un incubateur automatisé à 20 ° C. Métadonnées expérimentale sont automatiquement inclus dans le titre de la figure: le nom de plaque, le traitement de plaque, gélose et le numéro de plaque de la bibliothèque. Equipée des valeurs des paramètres du modèle sont également automatiquement imprimé sur chaque panneau (voir Figure 2). Cultures de bord ont été dépouillés de l'analyse QFA, laissant les 308 cultures dans ce complot (voir QFA protocole 5.4). Puisque les cultures de pointe ne sont pas analysées dans le QFA, ces lieux de culture sont généralement remplis avec des souches de contrôle neutres (pGAL-HIS3 dans ce cas). La version originale de ce chiffre, la production par le paquet QFA R, est en format. Pdf et est donc infiniment zoomables et consultable par les requêtes de texte.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 4
Figure 4. Comparaison des écrans fitnesses QFA deux pour en déduire l'interaction génétique. Ce graphique montre la comparaison de l'aptitude des suppressions de levure bourgeonnante (yfgΔ) combinés avec la mutation neutre ura3Δ ou sensible à la température CDC13-1 mutation et cultivés à la température de semi-permissif pour CDC13- une (27 ° C). Fitness a été calculée comme le produit du taux de doublement et le potentiel maximum de doublement maximum 1. La plupart des souches de suppression poussent bien lorsqu'il est combiné avec la mutation neutre ura3Δ, comme prévu et avoir les aptitudes de haut, mais les suppressions combinées avec CDC13-1 ont un large éventail de fitnesses. Les lignes de lumière bleue se croisent à eemplacement e de la mutation neutre his3Δ, la ligne continue est un modèle de régression linéaire de l'indépendance génétique (de remise en forme attendu de CDC13-1 yfgΔ mutants donnés de remise en forme de ura3Δ yfgΔ mutants) et la ligne pointillée est la ligne de remise en forme égale. Suppressions de couleur verte améliorer considérablement le défaut de remise en forme de CDC13-1 souches. Suppressions de couleur rouge de manière significative de supprimer du même défaut. La distance verticale de toute mutation CDC13-1 yfgΔ partir de la ligne pleine indique la force de l'interaction génétique entre CDC13-1 et yfgΔ dans les conditions de la plaque. Notez que certaines des plus fortes suppresseurs de CDC13-1 sont préalablement identifié des gènes de point de contrôle RAD17, RAD24 et DDC1 et la nucléase EXO1 en haut à droite. Les gènes dont la suppression réduit de remise en forme comprennent YKU80 (codant pour la réparation de l'ADN et de protéines coiffage des télomères Yku80) près de la en bas à droite. A noter également que certains groupes de gènes qui fonctionnent ensemble ont tendance à être co-localisés sur cette parcelle. Trois groupes, par exemple sont surlignés en bleu Spe1, Spe2 et SPE3: gènes de synthèse de la spermidine, RAD17, DDC1 et RAD24: composants d'encodage de la pince checkpoint coulissant et d'un chargeur de serrage point de contrôle, MRE11, RAD50 et XRS2: le complexe MRX, impliqués dans le DDR et EST1 & EST3: les gènes impliqués dans la régulation des télomères. Adapté de la figure 1B complémentaire 1, les données brutes à partir desquelles cette parcelle a été générés peuvent être téléchargés à partir d'ici: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . Cliquez ici pour agrandir la figure .

"> ID du fichier Type de fichier Construits manuellement Fréquence des mises à Condition préalable FT1 Plaque photo Aucun Par plaque & timepoint Oui FT2 Description de l'expérimental Oui Par expérience Oui FT3 Description de la librairie Oui Par la bibliothèque Oui FT4 Noms de gènes standard Oui Par la bibliothèque Aucun FT5 Sortie Colonyzer Aucun Par timepoint par plaque Oui FT6 Les données brutes QFA Aucun Par expérience - FT7 Aucun Par expérience - FT8 QFA Fitness Résumé Aucun Par expérience - FT9 Hitlist QFA interaction génétique Aucun Par l'étude SIG (2 expts.) -

Tableau 1. QFA électroniques fichiers. Tous les fichiers répertoriés (à l'exception FT1) sont des fichiers texte délimités par des tabulations et peut être construit ou lire en utilisant n'importe quel éditeur de texte ou un tableur. Pour plus de détails au sujet de la construction des fichiers de métadonnées QFA et l'interprétation précise de la production QFA s'il vous plaît consultez la documentation QFA package R 7 et la documentation du logiciel Colonyzer 3.

Tableau 2
Tableau 2. Méthodes pour évaluer l'aptitude de la culture. Un résumé des caractéristiques et exigentments d'un certain nombre de méthodes pour évaluer l'aptitude de la culture microbienne. Une étude réalisée par Blomberg 8 contient une comparaison plus détaillée de certains d'entre eux. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

QFA est à bien des égards un lien direct descendant de trois établis l'échelle du laboratoire des techniques microbiologiques: la culture des tests de dilution de la série 9, place de détermination courbe de croissance dans des cultures liquides aérés 9 et placage réplique 13. Ces trois méthodes sont résumés et comparés avec QFA et d'autres techniques à haut débit dans le tableau 2. Alors que les tests de dilution de la série comptant définir de remise en forme d'une souche que sa capacité à former des colonies dans une série de cultures cultivées à partir d'une gamme de dilutions d'inoculum, de remise en forme QFA souche mesures par des observations répétées d'une culture unique pour construire une courbe de croissance. Quantification de remise en forme à partir de cultures en un seul permet de nombreuses souches plus à être examinés simultanément, dans des conditions identiques. Réplication des tableaux de cultures permet des tests répétés de collections de souches, la plupart utilement lors de l'essai pour les différences de conditionnement physique de la culture dans différents environnements ou antécédents génétiques. Le protocole présenté QFAutilise ici coûteux équipement robotique pour reproduire, ensemencer, incuber et des plaques d'agar d'image, approprié pour observer la croissance des milliers de cultures indépendantes (robotique QFA, tableau 2). Cependant, depuis QFA est basé sur des techniques de laboratoire établies, traditionnels, il peut également être réalisée beaucoup plus cher en remplaçant l'aide de robot avec des étapes manuelles (manuel QFA, tableau 2). Manuel QFA implique la réplication et l'inoculation des cultures sur des plaques de gélose en utilisant un outil de broche manuel et le transfert manuel des plaques vers et à partir d'un incubateur pour la photographie. Le flux de travail même analyse computationnelle peut être appliquée pour générer des courbes de croissance de soit la conception expérimentale.

QFA estimations de conditionnement physique semblent être relativement précis. Dans la figure 4, les fitnesses moyennes de quatre grappes par exemple de la délétion de gènes fonctionnellement liés sont mis en évidence. La proximité des membres de chaque classe fonctionnellement lié au gène de dans deux indépendancehorizons différents (génétiques ura3Δ et CDC13-1) indique la reproductibilité des estimations de remise en forme QFA. Par exemple, seulement 3 délétions de gènes (sur un 4300 possible) séparer les trois membres du complexe MRX conservée.

À haut débit alternatives à QFA pour l'essai des caractéristiques de croissance des souches microbiennes comprennent SGA 5,6, écrans de la concurrence dans les bibliothèques à code-barres et des écrans de saisie 11,12 cinétique de densité optique dans les lecteurs de plaques spectrophotométriques 10, qui sont résumées dans le tableau 2 et décrits plus en détail ailleurs 8 . QFA et les plaques SGA, où les cultures se développent sur ​​des surfaces de gélose solide (gélose des méthodes basées sur, tableau 2) peuvent être traitées rapidement et facilement par un robot. Solides cultures de surface de gélose sont bien aérées long de la croissance et les cellules peuvent croître dans les cultures fixes, permettant microbes sociables à grandir dans une communauté 14. Laissée intacte, les communautés microbiennes quelquesffect leurs propres micro-environnements, sécrétant des toxines comme l'éthanol, et éventuellement de signalisation entre les cellules. Cependant, continue le mélange des cultures liquides, nécessaires pour atteindre une aération adéquate, artificiellement perturbe les communautés microbiennes et leurs micro-environnements qui peuvent influer sur leurs modes de croissance. La contamination croisée est moins un sujet de préoccupation dans les méthodes de gélose solide car il ya moins de possibilités de projections de liquides transportant des cellules entre les cultures. Si la contamination se produit par l'étranger suspension dans l'air des microbes dans les dosages de gélose solide, il peut souvent être détectés par une inspection visuelle des plaques d'agar solides et ont représenté ou supprimés.

QFA débit est sensiblement plus élevée que celle de méthodes parallèles liquides de deux manières. Tout d'abord, sur la QFA (et SGA) plaques, cultures inoculées sont emballés ensemble plus dense, donnant des cultures plus indépendants par plaque. En QFA il ya généralement 308 cultures, sans compter les cultures de bord non-expérimentales (Figure 1) comcomparativement à des cultures liquides parallèle avec 96 ou 100 cultures par plaque. Deuxièmement, les expériences QFA peut être adapté à un plus grand nombre de plaques. Alors que le nombre de plaques analysés en une seule expérience QFA est seulement limité par l'espace disponible dans une salle incubateur ou chaud, la fréquence minimale admissible de capture d'image et de la fréquence de capture maximale possible, le nombre de plaques dans une expérience de croissance liquide est fortement limitée par la capacité du lecteur de plaque (typiquement une ou deux plaques), ou de l'empileur fixé à la plaque de lecteur (typiquement 25-50 plaques). Nous avons récemment réalisé une expérience entièrement automatisé QFA sur 123 plaques, chacune avec 308 cultures expérimentales, ce qui donne 37,884 cultures simultanées. Nous estimons que le nombre maximum possible des cultures indépendantes qui poussent dans liquide est 96 (cultures / plaque) x 50 (plaques / empileur) = 4800, ce qui représente environ dix fois moins que notre débit QFA. Une alternative pour les écrans de culture liquide est d'utiliser un grand nombre gro automatiséwth dispositifs en parallèle (Tableau 1 de la revue par Blomberg 8), chacun ayant une capacité de un ou deux plaques. Contrôle de la température dans chaque dispositif est indépendant, et ainsi de conditions ne sont pas identiques, mais en supposant qu'ils sont, ce flux de travail, il faudrait au moins 190 de ces dispositifs pour correspondre à un débit QFA (en supposant que 200 cultures liquides par appareil).

En résumé, QFA est un workflow de haute qualité qui peuvent être utilement appliquées à recueillir phénotypes de croissance quantitative dans les deux petites expériences à l'échelle axés et à haut débit écrans. Il est suffisamment souple pour être appliqué efficacement avec différentes exigences pour l'équipement robotique. La composante de calcul du flux de travail QFA est basé sur librement disponible, le code source ouvert.

Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier tous les membres de notre laboratoire et le Centre pour la biologie Système intégré de vieillissement et de la nutrition (CISBAN) pour le soutien et les discussions utiles. Cette étude a été soutenue par la biotechnologie et sciences biologiques du Conseil de recherche (BBSRC) (BB/C008200/1) et le Wellcome Trust (075294, 093088).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replica Plater Sigma R-2508 96 pin manual pintool with 1/8 " diameter pins
Mix Mate Eppendorf 5353 000.014
Biomek FX Beckman A31842
Teleshake Thermo Scientific 50095890 Installed on Biomek FX
BM3-SC S&P Robotics Inc BM3-SC 192 shelf rotating carousel
spImager S&P Robotics Inc spImager High resolution manual imaging
spImager with Cytomat S&P Robotics Inc Custom Temperature controlled automated high resolution imaging
Cytomat 6001 with heat exchanger Thermo Scientific 51022222 Attached to spImager
Ecoline RE207 Lauda RE207 Attached to Cytomat
spImager with carousel S&P Robotics Inc Custom Automated high resolution imaging
Robot pin tool fixture for FP12pins V&P Scientific AFIX96FP12 N/A
96 x FP12 pins V&P Scientific FP12 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length
Docking Station for Pin Tool V&P Scientific VP425 Docking station base removed to allow fan drying of pins
Pin Cleaning Brush V&P Scientific VP425 N/A
Replica Plater Sigma R-2508 Manual pin tool
Nunc OmniTray with Lid Nunc 734-0490 N/A
96 well sterile polystyrene plates Greiner BioOne 655161 N/A
96 well sterile polystyrene lids Greiner BioOne 656171 N/A

Table 3. Specific reagents and equipment.

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References

  1. Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects. PLoS Genetics. 7, (4), e1001362 (2011).
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