הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jha, S. S., Komar, A. A. Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA. J. Vis. Exp. (65), e4026, doi:10.3791/4026 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

קצב התארכות translational היא לא אחידה. mRNA מבנה משני, שימוש קודון ו-mRNA חלבונים הקשורים סילוף תנועת הריבוזום על הודעה של חוות דעת ראה 1. עם זאת, זה עתה מקובל כי השימוש קודון נרדף הוא הגורם העיקרי שאינם אחידים שיעורי התארכות של תרגום 1. קודונים נרדפים לא משמשים בתדירות זהה. ההטיה קיימת בשימוש קודונים נרדף כמה קודונים בשימוש בתדירות גבוהה יותר מאחרים 2. קודון ההטיה היא אורגניזם כמו גם רקמה ספציפית 2,3. יתר על כן, תדירות השימוש קודון עומד ביחס ישר ריכוזי tRNAs מאותו מקור 4. לפיכך, קודון שימוש תכוף יהיה רב יותר של tRNAs המתאימים, אשר נוסף מצביע על כך קודון תכופים יתורגם מהר יותר מאשר 1 נדירים. כך, אזורים על mRNA המועשר קודונים נדירים (אתרי להשהות פוטנציאליים) יהיה בדרך כלל להאט את תנועת הריבוזום על מסהGE ולגרום הצטברות של פפטידים המתהווה של גדלים בהתאמה 5-8. אתרים אלה יכולים להשהות השפעה תפקודית על ביטוי החלבון, יציבות ה-mRNA ו קיפול חלבונים לבדיקה לראות 9. אכן, הוכח כי הקלה של אתרי להשהות כאלה יכולים לשנות את תנועת הריבוזום על ה-mRNA, ובהמשך עשוי להשפיע על היעילות של קיפול (in vivo) שיתוף translational חלבון 1,7,10,11. כדי להבין את התהליך של קיפול חלבונים in vivo, בתא, כי הוא יחד בסופו של דבר לתהליך של סינתזה של חלבון זה חיוני כדי לקבל תובנות מקיפות אל ההשפעה של השימוש בתוכן / tRNA קודון על תנועת ריבוזומים לאורך ה-mRNA במהלך התארכות translational .

כאן אנו מתארים טכניקה פשוטה, שניתן להשתמש בהם כדי לאתר הגדולות להשהות תרגום אתרי ה-mRNA ניתן לתרגם בתא ללא מערכות שונות 6-8. הליך זה מבוסס על בידוד של המתהווה פוליפפטידים accumulating על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה. הרציונל הוא כי בתדירות נמוכה קודונים, עלייה בזמן מגוריו של תוצאות ריבוזומים בכמות מוגברת של פפטידים המתהווה של בגדלים המתאימים. ב-mRNA חוץ גופית עיבד משמש במבחנה תגובות של תרגום בנוכחות חומצות אמינו שכותרתו רדיואקטיבית כדי לאפשר זיהוי של רשתות המתהווה. כדי לבודד את הריבוזום מתחמי קשורות פוליפפטיד המתהווה התגובה התרגום שכבות על גבי פתרון גליצרול 30% ואחריו צנטריפוגה. פוליפפטידים המתהווה ב polysomal גלולה מטופלים נוספים עם ribonuclease והחליט על ידי SDS. טכניקה זו יכולה לשמש פוטנציאל של חלבון כל ומאפשר ניתוח של תנועת הריבוזום לאורך ה-mRNA לבין זיהוי האתרים להשהות הגדולות. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד גורמים ותנאים שיכולים לשנות תנועת הריבוזום ובכך באופן פוטנציאלי יכול גם לשנות את הדואר פונקציה / קונפורמציה של החלבון.

Protocol

1. תבנית ה-DNA הכנה בתעתיק חוץ גופית

  1. הגן של הריבית מתחת T7 לשכפל ו / או למשל SP6 האמרגן תעתיק.
  2. שכן שעתוק במבחנה DNA התבנית לינארית עם אנזים הגבלה מתאים לחיתוך במורד הזרם של קודון עצירה ORF ו / או ה-mRNA סוף '3. יש צורך לאמת את לינאריזציה מלאה של DNA פלסמיד על ידי הפעלת המוצר העיכול מגבלה על ג'ל אלקטרופורזה agarose.
  3. הפלסמיד לינארית משמש בתגובה שעתוק במבחנה. ריכוז שונה של DNA התבנית ניתן לבדוק לזהות ריכוז ה-DNA האופטימלי הנדרש ב שעתוק במבחנה. בדרך כלל, עם ערכת MEGAscript של Ambion תמלול, תפוקה גבוהה (Ambion / Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק), ה-DNA 1 מיקרוגרם לינארית מניב 40-60 מיקרוגרם של ה-mRNA. בתעתיק חוץ גופית נעשית בעקבות הוראה של היצרן (Ambion / Life Technologies, גרנד Islanד, ניו יורק).
  4. בעקבות בתעתיק חוץ גופית mRNA מטוהרים על ידי משקעים ליתיום כלוריד על פי הוראה של היצרן (MEGAscript תמלול העליון Ambion ערכת תשואה).
  5. שלמות mRNA מאומת עוד יותר על ידי אלקטרופורזה על ג'ל acrylamide או agarose.

2. Cell תרגום במבחנה חינם

עבור בתרגום חוץ גופית באמצעות R abbit R eticulocyte lysate, RRL (Promega, מדיסון, WI) בצע את הפעולות הבאות:

  1. הכן 100 μl בהוראה התגובה במבחנה התרגום הבאה של היצרן. בקצרה, במים nuclease חינם להוסיף 2 חומצות אמינו μl תערובת מינוס מתיונין (1 מ"מ), 10 יחידות של RNase אינהיביטור (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק), 20 μCi של רדיואקטיבי [35 S]-מתיונין (Biomedicals מגה פיקסל, סולון, OH), 70 μl של הארנב Reticulocyte lysate (Promega, מדיסון, ויסקונסין).
  2. דגירה הדואר התגובה על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מראש תגובה חמה תרגום. הוסף 2 מיקרוגרם של ה-mRNA לתגובה תרגום דגירה על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. לעצור את התגובה על ידי הנחת התגובה התרגום על הקרח.

3. הבידוד של פוליפפטידים המתהווה מ בתגובה תרגום חוץ גופית

  1. לבודד פוליפפטיד המתהווה חייב הריבוזומים (polysome), התגובה התרגום שכבות על גבי 4.5 מ"ל של גליצרול 30% ב 10 mM Tris-HCl pH 7.6 חיץ, המכיל 100 מ"מ KCl, 10 mM MgCI 2, centrifuged ב 100.000 X g בתוך הרוטור TLA-110 (Beckman Coulter, Inc, ברי, CA) עבור שעות 1 ב 4 ° C.
  2. Supernatant הוא עוד יותר להסיר בזהירות.
  3. גלולה המכילה polysomal פוליפפטידים המתהווה הוא resuspended בנפח קטן (10-15 μl) של 1 mM Tris-HCl pH 7.6 המאגר, המכיל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​ribonuclease (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק), ו מודגרות עבור 30 דק 'ב 37 ° C. על מנתכדי לשפר את הידרוליזה של peptidyl-tRNA אסתר בונד, NaOH מתווסף הריכוז הסופי של 10 מ"מ, ו הדגירה נמשך 30 דקות נוספות.

במבחנה התגובה התרגום כינס ללא mRNA וביצע באותם תנאים (ואחריו בידוד של פפטידים המתהווה כפי שתואר) ישמש שליטה מרכזי. טיפול התגובה התרגום (ים) עם puromycin לפני העמדת תמצית כדי צנטריפוגה שיפוע צפיפות עשוי לשמש מלאה נוספת.

4. פתרון פוליפפטיד ינוקא על טריס-tricine SDS PAGE

  1. פוליפפטידים המתהווה מבודדים נפתרות ונותחו על טריס-tricine SDS-PAGE. יש לציין כי כמות החומר טעון על ג'ל יהיה תלוי היעילות של תיוג חלבון, יעילות על תרגום חלבונים רבים פרמטרים אחרים. כמות של חומר טעון צריך להיות מותאם באופן אמפירי כדי לאפשר את BESויזואליזציה לא והפרדה של בודדים רשתות פוליפפטיד המתהווה.
  2. לאחר ג'ל אלקטרופורזה קבועים, מיובשים באמצעות ואקום ג'ל דייר ו נתון autoradiography. הפצה של פוליפפטידים המתהווה הם נצפו באמצעות phosphoimaging.

5. נציג תוצאות

שור Gamma-B Crystallin תורגם על lysate Reticulocyte הארנב וכן א ' coli S30 תמצית מערכות (Promega, מדיסון, WI) ולאחריו בידודו של שרשרות פוליפפטיד המתהווה. איור 1 מתאר את השלבים הכרוכים בבידוד של הריבוזום רשתות המתהווה הנכנס. במחקר הנוכחי המטרה היתה לבדוק, אם משנים את הסביבה של הרפרטואר של התרגום כלומר tRNAs (ידוע להיות שונה באופן משמעותי יונקים (RRL) ו פרוקריוטים (E. coli) מערכות בשל הבדלי דעה קדומה קודון בין אורגניזמים) יכול לשנות את תנועת הריבוזום לאורך ה-mRNA ותוצאה והפצה של אתרי להשהות תרגום.תנועת הריבוזום שינה צריך להביא לשינויים בהתפלגות הגדלים של פוליפפטידים המתהווה המצטברים במהלך התרגום, כמו גם בעוצמות היחסיות שלהם. העוצמות היחסיות של להקות משקפים את משך הזמן של שתיקה. פוליפפטידים המתהווה בודדו והחליט על 16.5% T, 6% C טריס-tricine SDS PAGE (איור 2). Gamma-B Crystallin הוא חלבון 20 kDa. תצפית של פוליפפטידים המתהווה של לא זהים אורכי ועוצמות ב RRL וא ' מערכות קולי עולה כי תנועת ריבוזומים לאורך ה-mRNA של שתי מערכות אלו כדלקמן קינטיקה תרגום שונות. לדוגמה, צפינו בלהקה בולט של 17.7 kDa ב א coli lysate ולא במערכת RRL, דבר המצביע על כך שיש אתר נוסף להשהות translational באזור 3'-end של ה-mRNA (קידוד בטרמינל C-באזור של גמא ב Crystallin), כאשר היא מתורגמת א ' coli המערכת. נציין כי Gamma-B Crystallin נמלים במקביל Arg קודונים (AGG 153 ו AGA 154) כי הם תכופים במערכות יונקים, אך ידועים להיות נדיר ביותר ותורגם לאט א ' coli. פפטיד הרומן המתהווה צבירת ה מערכת coli (~ 17.7 kDa איור 2.2) נגרמת ככל הנראה על ידי הריבוזום משתהה ליד אלה קודונים טנדם נדירים. שים לב לא ניתן לראות להקות בהעדר mRNA (איור 2.3), וכי הטיפול puromycin מסיר את רוב רשתות המתהווה של polysomes (איור 2.3). טיפול ממושך עם puromycin (> 15 דקות) מסיר את כל רשתות המתהווה (מידע לא מוצג). זו מאשרת את המוצרים פוליפפטיד שנצפו הם הריבוזום רשתות המתהווה נלווים, ולא mRNPs cosedimenting עם polysomes.

כאמור, הטיה קודון הוא אורגניזם כמו גם ברקמות ספציפיות. דוגמה מייצגת המתואר כאן, משקף את שינוי הסביבה של הרפרטואר של התרגום כלומר tRNAs / קודוןהטיה יכולה להוביל תנועה שונה של הריבוזום לאורך ה-mRNA. ככל הנראה, טכניקה פשוטה זו לא רק לאפשר זיהוי האתרים הפסקה של תרגום לאורך ה-mRNA, אלא גם מאפשר השוואה מהירה של להשהות אתרי תרגום בין מערכות שונות.

איור 1
באיור 1. סכמטי להסביר את שלבים בידוד הריבוזום פוליפפטידים המתהווה הנכנס. שור Gamma-B Crystallin רצף ORF (528 זוגות בסיסים) שוכפלה במורד הזרם של האמרגן T7 ב pBSKS +. שכן שעתוק במבחנה DNA התבנית לינארית על ידי טיפול זה עם EcoRI. תבנית לינארית שימש ב שעתוק במבחנה. האמרגן T7 בתבנית ה-DNA הוא מוכר על ידי RNA פולימראז T7 כי מעתיק את הגן במורד Gamma-B Crystallin. mRNA מטוהרים באמצעות ליתיום כלוריד שיטת משקעים. MRNA מטוהרים משמש בתרגום חוץ גופית. הבאהדגירה, התגובה התרגום שכבות על גבי פתרון גליצרול 30% ו centrifuged עבור שעות 1 על 4 מעלות צלזיוס ב 100.000 X גרם לבודד הריבוזום פוליפפטידים המתהווה הנכנס.

איור 2
איור 2. הבידוד של פוליפפטידים שור Gamma-B Crystallin המתהווה המתורגמים הארנב Reticulocyte lysate (RRL) וא ' lysate coli. 2 mRNA מיקרוגרם היה מעורב בתגובה 100 μl המכיל RRL או E. coli S30 תמצית מערכת (Promega, מדיסון, ויסקונסין) על פי הוראה של היצרן עם 20 μCi [35 S]-מתיונין מודגרות על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הדגירה הבאה התגובה התרגום שכבות על גבי 4.5 מ"ל של גליצרול 30% ב 10 mM Tris-HCl pH 7.6 המאגר, המכיל 100 מ"מ KCl, 10 mM MgCI 2, centrifuged במשך שעה 1 ב 4 ° C ו-X 100.000 גרם TLA-110 הרוטור (Beckman Coulter, Inc, ברי, קליפורניה). מבודד polyribosome גלולה היה resuspended ב μl 20 מתוך 1 mM Tris-HCl pH 7.6, המכיל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​ribonuclease (Invitrogen / Life טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק) ואחריו טיפול עם NaOH (כמתואר בסעיף בפרוטוקול). פוליפפטידים המתהווה נפתרו על 16.5% T, 6% C טריס-Tricine ג'ל SDS PAGE. ג'ל היה יבש וחשוף עבור autoradiography. בעקבות חשיפת ג'ל נסרק באמצעות סורק הדמיה טייפון של GE Healthcare. איור 2.1 מראה את הג'ל עם פוליפפטידים המתהווה מבודדים נפתרה לאחר התגובות תרגום לעשות זאת בשתי מערכות שונות (RRL ו E. coli). איור 2.2 ג'ל נותח על ידי תמונה קוואנט TL ., תוכנה v2005 ומשומשים כאן כדוגמה כדי להראות את המשקל בעוצמה מולקולרית של פוליפפטידים המתהווה המצטבר בשתי המערכות ניתן לנתח בקלות לעומת איור 2.3 מציג את שתי מערכות בקרה: פוליפפטידים המתהווה מבודדים והחליט בעמוד SDS לאחר התרגום התגובות נאספוללא mRNA ו / או אחרי התגובות תרגום טופלו puromycin (5 דק ', קונצרט כלשהו הסופי. 1 מ"מ) לפני התגובה היה נתון צנטריפוגה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לקבלת תוצאות לשחזור, איכות ריכוז המרכיבים המשמשים ב שעתוק במבחנה תרגום התגובות הן קריטיות. במחקר הנוכחי השתמשנו ערכות זמינים מסחרית ותמציות המספקים נתונים לשחזור ביותר, אם מטופל בזהירות. עם זאת, תרגום, המוסמכות תמציות ניתן להכין מתא הבחירה של האדם, במידת הצורך. האיכות של ה-mRNA יכול להשפיע על התרגום, ולכן הוא בעל חשיבות עליונה לבחון את תקינות mRNAs לפני השימוש בו במהלך בתרגום חוץ גופית.

יתר על כן, משך הזמן של התגובה בתרגום חוץ גופית צריך להיות מותאם במיוחד חלבון בנפרד. זהו צעד קריטי עבור בידוד של פוליפפטידים המתהווה. דגירה ממושכת מובילה סינתזה של חלבון באורך מלא, ואת שחרורו של רוב פוליפפטידים המתהווה של הריבוזומים. זמן הדגירה יכול להיות מותאם על ידי ביצוע במבחנה תרגום reactions עם נקודות זמן שונות. לאחר הזמן המינימלי הנדרש לתרגום של חלבון באורך מלא שנוצר, השלב הבא הוא לעשות סדרה נוספת של ניסויים סביב פרק ​​זמן ולזהות את תקופת הדגירה, שם רוב פוליפפטידים המתהווה יהיה כבול עדיין (של הריבוזום ) (כלומר, תהליכי חניכה תרגום סיום יהיה עדיין בשיווי משקל). התגובה תרגום יכול גם לעצור על ידי הוספת אנטיביוטיקה כי התארכות המעצר translational (למשל cycloheximide). ברור כי זו מערכת ניסיונית שתאפשר החלטה וניתוח של האתרים הגדולים הפסקה לאורך ה-mRNA ויכולת פתרון של מערכת ג'ל לשימוש תהיה השפעה גדולה על איכות התוצאות. Tricine נתרן סולפט-polyacrylamide dodecyl ג'ל אלקטרופורזה המאפשר הפרדת חלבונים בטווח של 1 עד 100 kDa מומלץ מאוד לשימוש בסוגים אלה של הניסויים 12. יש לציין כי אסטרטגיה זוניתן להתאים גם לניתוח של מיקום האתרים הפסקה במהלך ביטוי חלבון in vivo (בתאים). במקרה מאוחר יותר, חלק polysomal סך מתאי שכותרתו מטבולית יש לבודד 1. Polysomes התרגום mRNA ספציפי של עניין צריך להיות מבודד אז immunoprecipitation עם אנטי (חלבון עניין) נוגדנים ספציפיים וניתוח של רשתות המתהווה שכותרתו צריך להיעשות כמתואר. עדיף להשתמש נוגדנים המכוונים נגד אזור N-terminal של החלבון של עניין. במידת הצורך, החלבון של עניין יכול להיות מתויג עם הדגל למשל פפטיד על מנת להבטיח יעילות לנתץ. פרוטוקול חלופי המבוסס על בידוד סלקטיבי של הריבוזומים בתרגום מאוגד mRNA ביוטין, שכותרתו הייתה אף decribed לאחרונה 13. יש לציין כי להגדרה מדויקת יותר של האתרים להשהות תרגום, במיוחד עבור חלבונים גדולים אפשר להשתמש micrococcal nuclease assay הגנה 5. שינוי לאמאוחר יותר הוא assay, המבוסס על רצף העמוק של הריבוזום המוגנים שברי mRNA ומאפשר חקירת הדינמיקה של תרגום חלבונים ברמה הגנום כולו, תוארה גם 14.

הטכניקה פשוטה וישימה המתואר במאמר זה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר התנועה של ריבוזומים לאורך ה-mRNA, לסייע בזיהוי להשהות תרגום אתרים וגם גורמי הבדיקה והתנאים שיכולים לשנות תנועת הריבוזום במהלך התארכות translational. ניתן להשתמש בו באופן פוטנציאלי על ידי התאמת המיקומים הנכונים של הפסקה האתרים הגדולים תרגום על ידי העסקת החלפות קודון נרדפים לאופטימיזציה של קיפול שיתוף translational חלבון במערכת Heterologous (ים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית מדע האדם Frontier מענק RGP0024.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEGAscript T7 High yield Transcription Kit Ambion AM1333
Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 15518012
Trans [35S]-Label MP Biomedicals 0151006
Ribonuclease-A Invitrogen 12091
Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated Promega L4960
E. coli S30 Extract System for Linear Templates Promega L1030
Centrifugation Beckman Coulter Optima TLX Ultracentrifuge
Storage phosphor autoradiography GE Healthcare Typhoon 9410 variable mode imager
Software for nascent polypeptide analysis GE Healthcare Image Quant TL, v2005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
  2. Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
  3. Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
  4. Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
  5. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
  6. Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
  7. Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
  8. Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
  9. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
  10. Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
  11. Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  12. Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
  13. Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
  14. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics