Diyabetik Fare Böbrek Kapsül içine, Pankreas Islets Nakli

Published 10/31/2007
12 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Protokolü, temiz ve kolay bir adacık veya hücreleri farelerin böbrek kapsülü altında sunmak için geliştirildi. Hücreler, böbrek kapsül altında hücrelerinin nakli için kullanılan son tüp pelet içine yoğunlaşmıştır. Bu tekniğin kolaylığı hücreleri ve fare stresi azaltır.

Cite this Article

Copy Citation

Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404, doi:10.3791/404 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protokolü, temiz ve kolay bir şekilde diyabetik veya normal farelerin böbrek kapsülü altında adacıklar veya hücreleri sunmak için geliştirildi. Biz böbrek kapsülü altında hücre nakli için kullanılan son teslim boru (PE50) pelet içine adacıklar veya hücrelerin konsantre kolay olduğu bulundu. Bu teknik, hücrelere ya da fare herhangi bir aşırı stres azaltırken hem hız ve kolaylık sağlar.

Yükleme: oturanlar, el adacıklar veya tohum hücreleri dikkatle P200 pipetteman ve düz, ince duvar pipet kullanarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüp alt aspire, aldı. PE50 boru uzunluğu, küçük bir silikon adaptörü tüp kullanarak pipet ucu takılır. Hücreler ucu, yerleşmeye ve sonra yavaş yavaş pipetteman arama PE50 boru aktarılır izin verilir. PE50 boru sonuna yakın hücrelerin sonra, bir bükülme yapılır ve silikon adaptör boru kink üzerine yerleştirilir. PE50 tüp 15 ml içeren konik bir kesim 5 ml pipetlemeyin aktarılır ve PE50 tüp santrifüj sırasında kıvrık önlemek için 5 ml pipetlemeyin yan üzerinde bantlanmış. Hücreler 1.000 rpm ulaşmak için izin ve durdu.

Nakli: Alıcı fareler anestezi, traş ve temizlenmelidir. Farenin sol kanadında küçük bir kesi yapılır ve böbrek maruz kalmaktadır. Böbrek, yağ ve doku normal tuzlu çubukla nemli tutulmalıdır. PE50 distal ucu silikon adaptörü boru kullanarak, pipet içeren, Hamilton vidalı tahrik şırınga eklenir. Küçük bir nick çok büyük ne de çok derin değil, böbrek sağ kanadında yan üzerinde yapılır. PE50 boru kesik uç, hücrelerin en yakın dikkatle kapsül altına yerleştirilir, tüp normal salin sürüntü sırasında yer açmak için hafifçe dolaştı; kuru bir kapsülü kolayca yırtılabilir. Kapsül altında küçük bir hava kabarcığı, yavaş yavaş şırınga vida sürücü arama tarafından teslim edilir. Adacıklar sonra yavaş yavaş hava kabarcığı arkasında teslim edilir. Adacıklar teslim edilmiştir böbrek homeostazı korunur ve ıvır düşük ısı ile koterize. Böbrek boşluğuna yerleştirilir ve periton ve cilt sütüre ve zımbalanmış. Fare hemen Flunixin ve Buprenorfin ² ile tedavi edilen ve bir ısıtma yastığı bir kafes yerleştirilir.

Protocol

Nakli için Islets hazırlanması (Tx)

  1. Inverted mikroskop altında, P200 Pipetman ve 100mm plaka kültür adacıkları düz pipetlemeyin ucu kullanarak el almak adacıklar.
  2. Kont, her mikrosantrifüj tüp (~ 500 adacık / tüp / fare) bir zaman ve transfer 100 adacık.
  3. Adacıklar mikrosantrifüj tüplerin altına yerleşmek için izin ver.
  4. Düz bir ince duvar pipetlemeyin ucunu kullanarak P200 Pipetman (130ul ayarlanır) içine bir adacık pelet çizin.
  5. Şırınga ucu üzerinde bir silikon tüp adaptörü yerleştirin. PE50 boru uzunluğu silikon adaptörü içine yerleştirin.
  6. Kaput duvara PE50 boru uç adacıklar daha yüksek bant kaput ve yan Pipetman asın. Bu adacıklar sadece pipet ucu yerleşmek için izin verecektir.
  7. Yavaş yavaş sonuna adacıklar sınırdışı Pipetman arama ve PE50 tüp içine adacıklar hareket dikkatli olmak adacıklar PE50 tüp içine aktarın.
  8. PE50 boru kesik sonunda bir kink olun. Kink korurken, Pipetman silikon adaptör boru bağlantısını kesin ve silikon adaptör ile kink güvenli.
  9. Konik bir kesim 5 ml pipetlemeyin ve bant santrifüj ise PE50 boru kıvrık önlemek için 5 ml pipetlemeyin yan üzerinde PE50 tüp içine 15 ml, PE50 tüp, bükülmüş silikon adaptör boru tarafı, adacıklar yerleştirin.
  10. 1000 rpm PE50/15mL conicals Santrifüj ve santrifüj kapatın. (Bir kerede 10'dan fazla adacık hazırlıkları hazırlamak asla).
  11. Buz tüpü yerleştirin.

Nakli için Mouse hazırlanması

  1. Isofluorane veya Ketamin / Xylexene (bkz. hazırlık protokolü) ile fareleri anestezisi.
  2. Anestezik etkileyebilir alındıktan sonra, farenin sol kanadını tıraş.
  3. Swab fare Povidon İyot çubukla cilt, merkez, ve sonra bir ETOH bez ile silin.
  4. (Dalak sadece sağ) sol böbrek bulun. Periton açığa, deride küçük bir kesi olun.
  5. Böbrek açığa periton küçük bir kesi olun. Kesi küçük tutulması böbrek kaldırdı ve pozlanmış tutmada yardımcı olacaktır.
  6. Kesi her iki taraf için hafif bir basınç uygulayın, artırma veya böbrek farenin dışarı pop.
  7. Bir pamuk ile normal salin uygulayarak böbrek nemli tutun çubukla uçlu.
  8. Bir şırınga 23 veya 25 iğne kullanarak, böbrek kapsülünde bir nick oluşturmak, böbrek sağ kanadında küçük bir çizik çok derin ya da çok büyük değil.

Islets Nakli

Not: fare Tx için hazırlanan edilirken, ikinci bir kişi Hamilton vida sürücü adacık nakli şırınga hazırlamalıdır.

  1. Hortumun kink tutarken silikon adaptör tüp PE50 tüp yavaşça çıkarın.
  2. Silikon adaptör tüp ve yer "vida-drive" cam Hamilton şırınga bağlı pipet ucuna silikon adaptör tüp içine PE50 hortumun diğer ucunu yerleştirin. Yavaş yavaş, adalarında sızıntı olmadığını emin olun, PE50 boru kink bırakın.
  3. "Vida" mekanizması kullanılarak PE50 hortumun ucu yavaş yavaş adacıklar Advance, ancak küçük bir hava kabarcığı PE50 tüp adacıklar önünde tutmak.
  4. Nick böbrek içine küçük bir cep dikkatlice, kapsül altında PE50 boru slayt. Kapsül ile böbrek veya delinmesiyle oymak için çok dikkatli olun.
  5. Normal tuzlu-Gentamisin ıslatılmış pamuklu uçlu alan ve kapsül nemli kalmasına yardımcı olur, kuru bir kapsülü kolayca gözyaşı olacak.
  6. Yavaşça geri kalanı için nakledilen adacıklar için bir "cep" oluşturarak, tüm yönlerde boru hareket ettirin. Bölgenin nemli tutmak için ek olarak normal serum fizyolojik yeniden unutmayın.
  7. Fare açtı ve kim, böbrek kapsülü altında fare ve Hamilton nakli şırınga hazırlanan ikinci kişi, PE50 tüp yerleştirilir kişinin yönetimi altında yavaş yavaş, "cep" içinde, kapsül altında adacıklar ilerleyecektir PE50 tüp tarafından verilen küçük bir hava kabarcığı arkasında, tüm adacıklar kadar nakledilmektedir.
  8. Yavaşça, PE50 tüp kaldırmak için, kuru bir bez ile bölgeyi kuru ve düşük ısıda dikkatlice nick dağlamak.
  9. Tüm kanama durdu emin olun ve kuru bir pamuk kullanarak çubukla uçlu. Kanama durduktan sonra, steril serum fizyolojik ile böbrek tekrar nemlendirin ve yavaşça dikiş ve cilt zımba ile fare kapanış önce periton içine böbrek yerine.

Kapanış / Mouse Revival

  1. Periton 5-0 ipekle w / C-6 19mm iğne kullanarak çalışan bir dikiş ile kapatın.
  2. Kullanarak forseps birlikte cilt insizyonu her iki tarafında çizin.
  3. 2 veya 3 zımba ile birlikte cilt Zımba.
  4. Herhangi bir kan fare Cildin temiz bir pamuk kullanarak sürüntü ve SALIN uçlue.
  5. Hemen fareyi Flunixin ve Buprenorfin bir cilt altı enjeksiyonu ile tedavi.
  6. Fare, fare tam aktif olana dek, bir ısıtma yastığı veya altında bir ısıtma lambası yerleştirilir bir kafes yerleştirin.
  7. 2 hafta içinde cilt zımba çıkarın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, temiz ve kolay bir şekilde diyabetik veya normal farelerin böbrek kapsülü altında adacıklar veya hücreleri sunmak için pratik ve etkili bir seçenek sunmaktadır. Hücrelere herhangi bir aşırı stres ya da fare azaltırken hücrelerin nakli, böbrek kapsül altında hücre nakli için kullanılan son teslim boru (PE50) adacıklar veya hücreleri zenginleştirme ve peletleme tekniği kolay ve etkili bir yöntem sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

UCSF Diyabet Merkezi. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LIFESCAN A.Ş. Johnson & Johnson Company.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical gloves Fisher Scientific 11-394-95(sz)
Surgical scrub sponges Moore Medical 42940AK
Forceps Miltex Inc. 6-114 and 6-26 2 with teeth, 2 straight
Dissecting scissors n=2 Miltex Inc. 5-290
Oster razor (sz. 40 blade) Fisher Scientific 01-305-10B
4x4 Sterile gauze pads Moore Medical 08252AK
Povidone Iodine pads Moore Medical 08486AK
Alcohol pads Fisher Scientific 14-819-2
Heating pad Moore Medical 42508AK
23G or 25G needles 1" long
Cidex solution Moore Medical 07535AK for cleaning/santizing instruments
PE50 polyethylene tubing BD Biosciences 427411 PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D.
Cidex + 28 day soln Moore Medical 35625AK
Silicone tubing Spectrum Chromat. 123732 5/32”OD x 1/32” ID
Instrument sterilizing container Moore Medical 39074AK
Straight Pipet Tips USA Scientific, Inc. 1111-0810 sterile
Glass syringe w/screw-drive Hamilton Co 1001
Cauterizing tool Roboz Surgical Instruments Co. RS230
Needle Holder Moore Medical 41-067
5-0 silk LOOK Surgical 754B for suture (6-C)
Cotton tipped swab Moore Medical
9mm autoclip stapler BD Biosciences 7630
9mm staples BD Biosciences 7631
9mm staple remover BD Biosciences 7637

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
  2. Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
  3. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
  4. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).

Comments

12 Comments

  1. Could you tell me which  type of Hamilton screw drive syringe be used?  Hamilton  Precision Syringe Pump PSD-² or PSD-3 or somethingelse?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 5:21 AM
  2. We use the Hamilton #1001 syringe catalog# 81341.  Its a threaded plunger syringe that includes a screw drive plunger; $²59. Website: http://www.hamiltoncompany.com/syringes/syringesLS-Threaded.asp We then cut the back-end of a pipet tip to fit on the leur tip of the syringe.  This allows for the attachment of the silicone adaptor tubing to attach to the syringe and move your pellet of cells through the PE50 polyethylene tubing from Becton Dickenson #4²741.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 12:18 PM
  3. Hi Dear, the kidney is located retroperitoneally, that means if you have chosen approach from backside, there is not any peritoneum to be cut and sutured.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2008 - 3:46 AM
  4. I see smart people

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2008 - 1:13 PM
  5. Could you tell me what type of silicone adaptor tubing is used when it is attached to pipet tip? Is it commercially available?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2008 - 2:45 AM
  6. Hello, I can't seem to find the Syringe with the screw-drive on the Hamilton website, dŒs anybody have anymore information on this item? Thank you so much!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2009 - 9:12 PM
  7. Hello! Thank you for this wonderfull and very instructive video! I was wondering if it is possible to save the video on a harddrive! If yes could you tell me how to do it Thank you a lot in advance   Evrim Jaccard PhD student  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2009 - 12:42 PM
  8. Hello Evrim, Why don't you shoot me an email at nikitab@jove.com and we'll see what we can do. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 2:19 AM
  9. Hi Dr. Szot, Thank you for posting a very helpful video demonstrating islet transplant.  What do you think of isolating islet cells and culturing them overnight before transplantation the next day?  If you think this possible, do you recommend any particular culturing conditions (medium, temp, etc)? Thank you in advance, Omar

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 13, 2009 - 6:43 PM
  10. Thanks for sharing the impressive video.
    Would you like to tell me, in your experience, how long did the mice maintain their euglycemia status after receiving transplantation?

    Reply
    Posted by: Ruei-Ren W.
    July 16, 2009 - 4:52 AM
  11. Excellent work to teach the people how to do the surgery

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2009 - 1:23 PM
  12. Dear Librarian,
    I would like to request access to JoVE because I am a young scientist and study the problem of diabetes. Your help will be invaluable to me.
    Alibek Mereke
    Department of surgery, Kazakh National Medical university, Almaty

    Reply
    Posted by: Alibek M.
    January 9, 2012 - 9:50 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats