Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen

Published 10/31/2007
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Biology

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Summary

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel von Mäusen. Die Zellen werden zu Pellets in den letzten Schlauch für die Transplantation der Zellen unter die Nierenkapsel verwendet konzentriert. Die Leichtigkeit dieser Technik reduziert den Stress auf die Zellen und der Maus.

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Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404, doi:10.3791/404 (2007).

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Abstract

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel diabetischer oder normalen Mäusen. Wir fanden, dass es leichter war, die kleinen Inseln oder Zellen in Pellets in den letzten Förderschlauch (PE50) verwendet werden, um die Zellen unter die Nierenkapsel Transplantation zu konzentrieren. Diese Technik bietet sowohl Geschwindigkeit und Leichtigkeit bei gleichzeitiger Verringerung unnötigen Stress auf die Zellen oder die Maus.

Loading: Settled, hob die Hand, Inseln oder pelletierten Zellen werden sorgfältig aus dem Boden eines 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit einem p200 pipetteman und eine gerade, dünnwandige Pipettenspitze aufgenommen. Eine Länge von PE50 Schlauch wird die Pipettenspitze mit einem kleinen Silikon-Adapter Schlauch befestigt. Die Zellen sind absitzen, in die Spitze, und dann sind die PE50 Rohr durch langsames Wahl der pipetteman übertragen. Sobald die Zellen in der Nähe des Ende des PE50 Schläuche sind, ist ein Knick machte und die Silikon-Adapter Schlauch wird über den Knick gestellt. Der PE50 Schlauch wird in ein 15 ml konische mit einem Schnitt 5 ml Pipette übertragen, und die PE50 Schlauch wird über die Seite der 5 ml-Pipette mit Klebeband zu verhindern Eisstockschießen beim Zentrifugieren. Die Zellen sind erlaubt bis 1.000 Umdrehungen pro Minute erreichen und blieb stehen.

Transplantation: Empfänger Mäuse betäubt, rasiert und gereinigt. Durch einen kleinen Schnitt an der linken Flanke der Maus gemacht und die Niere freigelegt. Die Niere, Fett und Gewebe feucht gehalten mit physiologischer Kochsalzlösung Tupfer. Das distale Ende des PE50 ist ein Hamilton Schneckenantrieb Spritze befestigt ist, mit einer Pipettenspitze, mit dem Silikon-Adapter Schlauch. Eine kleine nick ist auf der rechten Flanke Seite der Nieren gemacht, nicht zu groß noch zu tief. Die abgeschrägte Ende des PE50-Schlauch, am nächsten die Zellen, wird sorgfältig unter der Kapsel wird der Schlauch um sanft bewegt, um Platz zu machen, während swabbing physiologischer Kochsalzlösung; einem trockenen Kapsel kann leicht reißen. Eine kleine Luftblase unter der Kapsel durch langsames Wählen Sie die Spritze Schneckenantrieb geliefert. Inseln sind dann langsam hinter die Luftblase geliefert. Sobald die Inseln geliefert worden Nieren Homöostase erhalten bleibt und die knick ist bei niedriger Hitze verödet. Die Niere ist zurück in die Höhle gebracht und das Bauchfell und Haut werden vernäht und geheftet. Mäuse sind sofort mit Flunixin und Buprenorphin sq behandelt und in einem Käfig auf einem Heizkissen.

Protocol

Vorbereitung der Inseln für die Transplant (Tx)

  1. Unter einem inversen Mikroskop, hand-pick Inselchen mit einem P200 Pipetman und gerade Pipettenspitze aus den kultivierten Inseln in einem 100mm Platte.
  2. Graf Inselchen 100 pro und Transfer in jede Mikrozentrifugenröhrchen (~ 500 Inseln / Rohr / Maus).
  3. Lassen Inseln auf den Grund des Mikrozentrifugenröhrchen begleichen.
  4. Zeichnen Sie eine kleine Insel Pellets in ein P200 Pipetman (eingestellt auf 130ul) mit einer geraden dünnwandigen Pipettenspitze.
  5. Legen Sie einen Silikonschlauch-Adapter über die Spitze der Spritze. Legen Sie eine Länge von PE50 Rohr in die Silikon-Adapter.
  6. Hängen Sie die Pipetman auf die Seite der Motorhaube und Band der PE50 Schlauch an der Haube Wand höher als die Inseln in der Spitze. Damit können die kleinen Inseln, nur in der Spitze der Pipette zu begleichen.
  7. Übertragen Sie die Inseln in den PE50 Rohr durch langsames Wahl der Pipetman und Bewegung der kleinen Inseln in der PE50 Rohre, darauf achten, daß die Inseln aus dem Ende zu vertreiben.
  8. Machen Sie einen Knick in das abgeschrägte Ende des PE50 Schlauch. Unter Beibehaltung der Knick, trennen Sie das Silikon-Adapter Schlauch von der Pipetman und sichern Sie den Knick mit dem Silikon-Adapter.
  9. Legen Sie die kleinen Inseln in der PE50 Schläuche, geknickt Silikon-Adapter Schlauch nach unten in ein konisches 15 ml mit einem Schnitt 5 mL Pipette und Band der PE50 Schlauch über die Seite der 5 ml Pipette zu verhindern, Eisstockschießen des PE50 Schlauch während Zentrifugieren.
  10. Zentrifugieren Sie die PE50/15mL konische zu 1000 Umdrehungen pro Minute, und schalten Sie Zentrifuge. (Never bereiten mehr als 10 Inselchen Vorbereitungen auf einmal).
  11. Das Röhrchen auf Eis.

Vorbereitung der Mouse for Transplant

  1. Anesthetize die Mäuse mit Isofluoran oder mit Ketamin / Xylexene (siehe Vorbereitung Protokoll).
  2. Nach Betäubung entnommen beeinflussen, rasieren die linke Flanke der Maus.
  3. Swab Haut von Mäusen, Center-out, mit Povidon Jod Tupfer und wischen Sie dann mit einem ETOH Tupfer.
  4. Suchen Sie die linke Niere (knapp rechts von der Milz). Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut, Aussetzen des Bauchfells.
  5. Machen Sie einen kleinen Schnitt in das Bauchfell Freilegung der Niere. Keeping the Schnitt kleiner wird im Sinne der Niere erhöht und ausgesetzt zu helfen.
  6. Tragen Sie einen leichten Druck auf beiden Seiten des Einschnitts, erhöhen oder Pop die Niere aus die Maus.
  7. Halten Sie die Niere feucht durch die Anwendung physiologischer Kochsalzlösung mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen.
  8. Mit einer Spritze 23 oder 25 Gauge-Nadel, einen kleinen Kratzer auf der rechten Flanke der Niere, die Schaffung eines nick in die Nierenkapsel; nicht zu tief oder zu groß.

Transplantation von Inselzellen

Hinweis: Während sich die Maus für Tx vorbereitet wird, die zweite Person sollte die Hamilton Schraub-Laufwerk Inseltransplantats Spritze vorzubereiten.

  1. Entfernen Sie langsam die Silikon-Adapter Schlauch vom PE50 Rohr unter Beibehaltung der Knick im Schlauch.
  2. Platzieren Sie das andere Ende des PE50 Rohr in die Silikon-Adapter Schlauch und platzieren Sie den Silikon-Adapter Schlauch an der Pipettenspitze an der "Schraube-drive" Glas Hamilton-Spritze. Langsam loslassen Knick in der PE50 Rohre darauf achten, dass die Inseln nicht austreten.
  3. Schieben Sie die Inseln langsam an die Spitze des PE50-Schlauch mit der "Schraube"-Mechanismus, aber halten Sie eine kleine Luftblase in der Vorderseite des kleinen Inseln in der PE50-Schlauch.
  4. Into the nick gemacht in der Niere, vorsichtig die PE50 Rohre unter der Kapsel, so dass eine kleine Tasche. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht auf die Nieren-oder Punktion durch die Kapsel Beitel.
  5. Es hilft, die Fläche und Kapsel feucht mit normaler Kochsalzlösung getränkt Gentamycin Wattestäbchen Wattestäbchen zu halten; einem trockenen Kapsel leicht reißen.
  6. Bewegen Sie den Schlauch in alle Richtungen, wodurch ein "Taschengeld" für die transplantierten Inseln zur Ruhe. Denken Sie daran, zusätzliche physiologische Kochsalzlösung erneut, damit die Fläche feucht.
  7. Unter der Leitung von der Person, die mit der Maus geöffnet hat und wer hat die PE50 Schlauch unter die Nierenkapsel platziert, die zweite Person, die die Maus und Hamilton Transplantation Spritze vorbereitet, wird langsam voran Inseln unter der Kapsel, in der "Tasche", hinter einer kleinen Luftblase durch den PE50 Schläuche geliefert werden, bis alle Inseln verpflanzt.
  8. Entfernen Sie langsam den PE50 Schläuche, trocknen Sie den Bereich mit einem trockenen Wattestäbchen und vorsichtig cauterize den nick mit geringer Wärmeentwicklung.
  9. Mit einem trockenen Wattestäbchen Wattestäbchen, sicherzustellen, dass alle Blutung aufgehört hat. Sobald Blutung aufgehört hat, wieder befeuchten die Niere mit steriler Kochsalzlösung, und sanft ersetzen die Niere in die Bauchhöhle vor dem Schließen der Maus mit Naht und die Haut Heftklammern.

Closing / Revival der Maus

  1. Schließen Sie das Bauchfell mit einer laufenden Stich mit 5-0 Seidenfäden w / a C-6 19mm Nadel.
  2. Mit einer Pinzette ziehen beide Seiten der Hautschnitt zusammen.
  3. Staple die Haut zusammen mit 2 oder 3 Klammern.
  4. Reinigen Sie die Haut der Maus von Blut, mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen und Saline.
  5. Unmittelbar behandeln die Maus mit einer subkutanen Injektion von Flunixin und Buprenorphin.
  6. Platzieren Sie die Maus in einen Käfig, der auf einem Heizkissen oder unter eine Wärmelampe gelegt wird, bis die Maus ist vollständig aktiv.
  7. Entfernen Sie die Haut Heftklammern in 2 Wochen.

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Discussion

Dieses Protokoll bietet eine praktische und effiziente Möglichkeit für die sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel diabetischer oder normalen Mäusen. Die Technik der Konzentration und Pelletierung der Inseln oder Zellen in den letzten Förderschlauch (PE50) verwendet werden, um die Zellen unter die Nierenkapsel Transplantation bietet eine einfache und effektive Methode der Transplantation von Zellen bei gleichzeitiger Verringerung unnötigen Stress auf die Zellen oder die Maus.

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Acknowledgements

UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc. Johnson & Johnson Company.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical gloves Fisher Scientific 11-394-95(sz)
Surgical scrub sponges Moore Medical 42940AK
Forceps Miltex Inc. 6-114 and 6-26 2 with teeth, 2 straight
Dissecting scissors n=2 Miltex Inc. 5-290
Oster razor (sz. 40 blade) Fisher Scientific 01-305-10B
4x4 Sterile gauze pads Moore Medical 08252AK
Povidone Iodine pads Moore Medical 08486AK
Alcohol pads Fisher Scientific 14-819-2
Heating pad Moore Medical 42508AK
23G or 25G needles 1" long
Cidex solution Moore Medical 07535AK for cleaning/santizing instruments
PE50 polyethylene tubing BD Biosciences 427411 PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D.
Cidex + 28 day soln Moore Medical 35625AK
Silicone tubing Spectrum Chromat. 123732 5/32”OD x 1/32” ID
Instrument sterilizing container Moore Medical 39074AK
Straight Pipet Tips USA Scientific, Inc. 1111-0810 sterile
Glass syringe w/screw-drive Hamilton Co 1001
Cauterizing tool Roboz Surgical Instruments Co. RS230
Needle Holder Moore Medical 41-067
5-0 silk LOOK Surgical 754B for suture (6-C)
Cotton tipped swab Moore Medical
9mm autoclip stapler BD Biosciences 7630
9mm staples BD Biosciences 7631
9mm staple remover BD Biosciences 7637

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
  2. Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
  3. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
  4. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).

Comments

12 Comments

  1. Could you tell me which  type of Hamilton screw drive syringe be used?  Hamilton  Precision Syringe Pump PSD-² or PSD-3 or somethingelse?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 5:21 AM
  2. We use the Hamilton #1001 syringe catalog# 81341.  Its a threaded plunger syringe that includes a screw drive plunger; $²59. Website: http://www.hamiltoncompany.com/syringes/syringesLS-Threaded.asp We then cut the back-end of a pipet tip to fit on the leur tip of the syringe.  This allows for the attachment of the silicone adaptor tubing to attach to the syringe and move your pellet of cells through the PE50 polyethylene tubing from Becton Dickenson #4²741.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 12:18 PM
  3. Hi Dear, the kidney is located retroperitoneally, that means if you have chosen approach from backside, there is not any peritoneum to be cut and sutured.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2008 - 3:46 AM
  4. I see smart people

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2008 - 1:13 PM
  5. Could you tell me what type of silicone adaptor tubing is used when it is attached to pipet tip? Is it commercially available?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2008 - 2:45 AM
  6. Hello, I can't seem to find the Syringe with the screw-drive on the Hamilton website, dŒs anybody have anymore information on this item? Thank you so much!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2009 - 9:12 PM
  7. Hello! Thank you for this wonderfull and very instructive video! I was wondering if it is possible to save the video on a harddrive! If yes could you tell me how to do it Thank you a lot in advance   Evrim Jaccard PhD student  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2009 - 12:42 PM
  8. Hello Evrim, Why don't you shoot me an email at nikitab@jove.com and we'll see what we can do. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 2:19 AM
  9. Hi Dr. Szot, Thank you for posting a very helpful video demonstrating islet transplant.  What do you think of isolating islet cells and culturing them overnight before transplantation the next day?  If you think this possible, do you recommend any particular culturing conditions (medium, temp, etc)? Thank you in advance, Omar

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 13, 2009 - 6:43 PM
  10. Thanks for sharing the impressive video.
    Would you like to tell me, in your experience, how long did the mice maintain their euglycemia status after receiving transplantation?

    Reply
    Posted by: Ruei-Ren W.
    July 16, 2009 - 4:52 AM
  11. Excellent work to teach the people how to do the surgery

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2009 - 1:23 PM
  12. Dear Librarian,
    I would like to request access to JoVE because I am a young scientist and study the problem of diabetes. Your help will be invaluable to me.
    Alibek Mereke
    Department of surgery, Kazakh National Medical university, Almaty

    Reply
    Posted by: Alibek M.
    January 9, 2012 - 9:50 AM

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