अलगाव और और माउस आंत से वृक्ष के समान कोशिकाओं मैक्रोफेज की विशेषता

Published 5/21/2012
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Immunology and Infection

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Summary

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Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040, doi:10.3791/4040 (2012).

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Abstract

Protocol

1. विच्छेदन और आंतों उपकला कोशिकाओं की हदबंदी

अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी:

  • गर्म Ca 2/2 मिलीग्राम + मुक्त कमरे के तापमान को पीबीएस (सीएमएफ पीबीएस).
  • गर्म 2 Ca + / 2 मिलीग्राम 5% (सीएमएफ HbSS / FBS) FBS और 2mm EDTA के कमरे के तापमान के लिए के साथ मुक्त HbSS.
  • गर्म कक्षीय 37 प्रकार के बरतन डिग्री सेल्सियस

नोट: 1.1 1.7 कदम जल्दी के रूप में के रूप में संभव है कोशिका मृत्यु की हद तक कम करने और अधिकतम सेल उपज प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

  1. एक CO 2 और पेट और छाती पर स्प्रे 70% इथेनॉल कक्ष में चूहों Euthanize.
  2. एक कैंची और वापस पेरिटोनियम बेनकाब त्वचा छील के साथ एक छोटे पेट के बीच में क्षैतिज चीरा करें.
  3. आगे बढ़ना जठरनिर्गम दबानेवाला यंत्र को काटने से ऊपरी छोटी आंत से पेट अलग. दूर संदंश साथ अन्त्रपेशी छेड़ो और फिर से कटौतीशेषांत्र अथवा लघ्वांत्र का अर्थ देने वाला उपसर्ग-cecal वाल्व बड़ी आँत से मुक्त करने के लिए पूरे छोटी आंत. गुदा कगार पर काट कर और फिर अलग अन्त्रपेशी तंग बड़ी आँत तक मुफ्त है.
  4. कटौती longitudinally कैंची का उपयोग बृहदान्त्र खोलने और बंद कमरे के तापमान पर सीएमएफ पीबीएस में इन्टेस्टाइनल लुमेन से fecal सामग्री और बलगम धो.
  5. Macroscopically बाहर विरोधी mesenteric छोटी आंत की सतह के साथ Peyer पैच काटना और खुला छोटी आंत longitudinally कटौती कैंची और संदंश का प्रयोग करें.
  6. कमरे के तापमान पर मल सीएमएफ पीबीएस में सामग्री और बलगम की छोटी आंत लुमेन धो लें.
  7. लगभग 1.5 सेमी टुकड़े और जगह में अलग अलग 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूबों युक्त पूर्व गर्म सीएमएफ HbSS / FBS और 2mm EDTA के 30 मिलीलीटर में छोटे / बड़ी आंत में कटौती. 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब के प्रति अधिक से अधिक 1 आंत नहीं जोड़ें.
  8. क्षैतिज प्रत्येक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब जगह एक कक्षीय हिलनेवाला में और के लिए हिला 250 rpm पर 20 मिनट के लिए 37 पर सी. ° </ Li>
  9. बर्बादी की बाल्टी में एक एकल जाल तार छलनी प्लेस और के माध्यम से प्रत्येक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब की सामग्री डाल करने के लिए आंत की 1.5 सेमी टुकड़े को ठीक करने और उन्हें अलग 50 मिलीलीटर की शंक्वाकार 2 के साथ पूर्व गर्म CHBSS के / FBS की 30 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में जगह मिमी EDTA.
  10. 1.8 दोहराएँ.

2. ऊतक पाचन और आंतों की कोशिकाओं के अलगाव

अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी:

  • Collagenase समाधान: 1.5 मिलीग्राम / मिलीग्राम प्रकार आठवीं Collagenase 40 / DNase मैं μg मिलीलीटर के साथ पूर्व गर्म सीएमएफ HbSS / FBS में भंग
  • पूर्व गर्म सीएमएफ HbSS / FBS और 2mm EDTA.
  • 37 में पूर्व गर्म कक्षीय हिलनेवाला डिग्री सेल्सियस
  • बहुत ठंडा सीएमएफ HbSS / FBS.
  1. झटकों के दूसरे दौर के बाद, झरनी के माध्यम से प्रत्येक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब की सामग्री डालना और एक छोटे से प्लास्टिक की आंत की 1.5 सेमी टुकड़े हस्तांतरण दूर अतिरिक्त एक कागज तौलिया का उपयोग मीडिया dabbing के बाद नाव तौलना.
  2. तेजी से एक क़ीमाआंत का .5 सेमी टुकड़े कैंची सीधे वज़न नाव में और का उपयोग कीमा बनाया हुआ आंत से Collagenase समाधान की 20 मिलीलीटर जोड़ने. क्षैतिज 200 rpm पर एक कक्षीय हिलनेवाला और पचाने में 10-20 मिनट के लिए प्रत्येक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब 37 ° जगह सी. अनुकूलन के बारे में नीचे चर्चा देखें.
  3. संक्षेप में एक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब में सीधे एक 100 माइक्रोन सेल की झरनी के माध्यम से किसी भी शेष आंतों ऊतक और फिल्टर की पूरी तरह से हदबंदी सुनिश्चित भंवर.
  4. प्रत्येक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब बंद सीएमएफ HbSS / FBS और 1500 rpm पर 4 पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस के साथ शीर्ष यदि एक ठोस गोली पेट के नमूनों के लिए centrifugation के बाद मनाया जाता है, नमूने 3.5 मिनट के लिए फिर से Centrifuged चाहिए. इस धोने कदम एक बार और दोहराएँ.
  5. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और बर्फ ठंड सीएमएफ HbSS / FBS और बर्फ पर जगह नमूने में सेल गोली resuspend.
  6. FACS अधिग्रहण / विश्लेषण या उच्च गति सेल sorti के लिए चुंबकीय मोती संवर्धन के लिए धारा 4 के लिए धारा 3 के लिए आगे बढ़ेंएनजी.

3. DCs और मैक्रोफेज के प्रवाह बहु रंग cytometric विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी धुंधला

अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी:

  • बहुत ठंडा सीएमएफ पीबीएस.
  • बहुत ठंडा धुंधला बफर (सीएमएफ पीबीएस + 5% FBS) के के.
  • बहुत ठंडा सीएमएफ पीबीएस में 1:1000 कमजोर पड़ने पर मृत दाग सेल / लाइव मर fixable एक्वा मृत सेल दाग किट का उपयोग कर तैयार है.
  • CD45 - PerCP, CD103 पीई, CD11c - APC, MHC द्वितीय (आइए ख) - एलेक्सा 700 Fluor, CD11b: निम्नलिखित प्रतिदीप्ति लेबल मोनोक्लोनल (Mabs) एंटीबॉडी बहुत ठंडा धुंधला बफर जोड़कर एंटीबॉडी धुंधला कॉकटेल तैयार 450 eFluor, F4/80-PE-Cy7.
  1. 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब दौर नीचे (FACS) में कोशिकाओं का स्थानांतरण.
  2. बहुत ठंडा सीएमएफ पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धो.
  3. मृत सेल के साथ सेते हैं नमूने अंधेरे में बर्फ पर 15 मिनट के लिए दाग.
  4. बहुत ठंडा सीएमएफ पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धो.
  5. बहुत ठंडा धुंधला में 2.4G2 anti-FcγRIII/II के साथ ब्लॉक कोशिकाओंबर्फ पर 10 मिनट के लिए बफर.
  6. बर्फ ठंड धुंधला बफर में कोशिकाओं को धो लें.
  7. अंधेरे में बर्फ पर 20 मिनट के लिए एंटीबॉडी धुंधला कॉकटेल के साथ नमूने सेते हैं.
  8. बहुत ठंडा धुंधला बफर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो और बहुत ठंडा धुंधला बफर के 400 μl में नमूने resuspend और 40 माइक्रोन FACS ट्यूब पर फिल्टर टोपी के माध्यम से गुजरती हैं.
  9. नमूने में एलएसआर द्वितीय कोशिकामापी (बी) के रूप में धारा 5 और चित्रा 1 में gating रणनीति द्वारा परिभाषित मोल.

4. DCs और मैक्रोफेज की आंत से संवर्धन

अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी:

  • बहुत ठंडा धुंधला बफर (सीएमएफ पीबीएस + 5% FBS) के के.
  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 2.5 CD11b और CD11c एमएसीएस मोती के साथ कदम से प्राप्त एकल कक्ष निलंबन सेते हैं.
  2. बहुत ठंडा धुंधला centrifugation द्वारा बाद बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें.
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 एमएल धुंधला बर्फ ठंड बफर में सेल गोली resuspendऔर एक 100 माइक्रोन सेल एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के बाद झरनी के माध्यम से गुजरती हैं.
  4. सकारात्मक एमएसीएस लोकसभा चुंबकीय स्तंभ का उपयोग करते हुए चयन के द्वारा चुंबकीय मनका संलग्न कोशिकाओं के लिए समृद्ध.
  5. 4.2 दोहराएँ कदम और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  6. सतह मार्कर के रूप में 3.7 चरण में वर्णित Mabs साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  7. चुंबकीय मनका समृद्ध कोशिकाओं के दो बार धो बर्फ ठंड धुंधला बफर के साथ. 500 μL बर्फ ठंड सोडियम azide बिना धुंधला बफर में सेल छर्रों Resuspend, और एक FACS ट्यूब में 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से गुजरती हैं.
  8. बी.डी. ARIA द्वितीय सेल करने के लिए आंतों डीसी और / या ब्याज की बृहतभक्षककोशिका सबसेट तरह सॉर्टर पर FACS छँटाई करने के लिए आगे बढ़ें.

5. एल.पी. APCs के लिए gating रणनीति

नोट: कृपया ध्यान दें कि अस्थिर आंतों की कोशिकाओं फाटक के उचित स्थान के सकारात्मक और नकारात्मक आबादी को अलग करने में सहायता के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जा सकता है.

  1. जैसा कि चित्र में दिखाया गया1, एक डॉट साजिश बनाने के लिए और कोशिकाओं कि मृत दाग सेल (छवि 1 ए) नक़ल घटनाओं के अपवर्जन (छवि 1 बी और सी) के बाद के लिए सकारात्मक रहे हैं बाहर. फिर, को आगे और पक्ष बिखराव के लिए (छवि 1D) के मलबे को बाहर करने के लिए सुनिश्चित करने के अनुसार ब्याज की कोशिकाओं पर गेट.
  2. अन्य डॉट साजिश और CD45 पर आगे गेट बनाएँ और आइए ख + कोशिकाओं जो phenotypically APCs (छवि 1E) की विशेषता है.
  3. एक अलग डॉट भूखंड पर, CD11b और CD11c विशिष्ट डीसी और बृहतभक्षककोशिका सबसेट (, चित्र 1F R1, R2, R3) भेद अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण. R1 के कोशिकाएं CD11c + CD11b / सुस्त कोशिकाओं. क्षेत्र, R2, जैसे कि इन कोशिकाओं के रूप में r1 के कक्षों में CD11c के लिए सतह अभिव्यक्ति की समान स्तर पर R2 का कोशिकाओं को भी व्यक्त CD11b चित्रित है. - इसके बाद, R3 क्षेत्र के कोशिकाओं है कि CD11b + और ​​/ सुस्त CD11c कर रहे हैं के लिए नामित है.
  4. एकalyze क्षेत्रों R1, R2, R3 F4/80 के लिए आगे और CD103 अभिव्यक्ति बृहतभक्षककोशिका और डीसी आबादी अंतर है, क्रमशः. CD11c + CD11b / सुस्त - R1 αE Integrin, CD103, और F4/80 के निम्न स्तर (छवि 1G) के उच्च स्तर व्यक्त की कोशिकाओं. CD11b + CD11c + R2 का कोशिकाओं दोनों DCs और मैक्रोफेज CD103 और F4/80 (1H छवि) के दिचोतोमोउस अभिव्यक्ति के आधार पर बना रहे हैं. अन्त में, CD11b + CD11c सुस्त / R3 की कोशिकाओं F4/80 + CD103 और प्ररूपी प्रोफ़ाइल पर आधारित मैक्रोफेज का गठन - (1 मैं छवि) 16.

6. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
आकृति 1. आंतों DCs और मैक्रोफेज के लिए gating रणनीति मृत कोशिकाओं (ए) और (बी और सी) दोहरी पहले विश्लेषण से बाहर रखा गया और फिर छोटे intestiएनएएल कोशिकाओं तदनुसार के gated आगे है और (डी) बिखराव की ओर थे, और APCs CD45 के रूप में परिभाषित किया गया है आइए + + b (ई). मैक्रोफेज और DCs CD11b और CD11c के (एफ) की अभिव्यक्ति के द्वारा की पहचान की गई. CD103 और (D) R1, R2 (एच) और (मैं) R3 आबादी पर पूर्व gated कोशिकाओं के लिए F4/80 अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था.

चित्रा 2
चित्रा 2. सेल उपज और एंटीबॉडी धुंधला गुणवत्ता पाचन समय पर निर्भर करता है CD11b और CD11c धुंधला और पैटर्न के तहत (डी) की कुल सेल उपज, बेहतर (बी, ई) पर या पचा ​​(सी, एफ) आंतों ऊतक.

आंतों की कोशिकाओं / 6 C57BL माउस छोटी आंत से अलग थे और DCs और मैक्रोफेज पर FACS बी.डी. एलएसआर द्वितीय द्वारा विश्लेषण किया गया. वोल्टेज और मुआवजा अस्थिर और एक fluorochrome - दाग splenocytes के का उपयोग कर स्थापित किया गया. मृत कोशिकाओं (छवि 1 ए) और दोहरी (छवि 1 बी और सी) पहले से बाहर रखा गयाविश्लेषण. ब्याज की कोशिकाओं को फिर को आगे के लिए और के अनुसार विश्लेषण किया गया बिखराव की ओर (छवि 1D) के CD45 पर gating के द्वारा पीछा किया और आइए ख + कोशिकाओं (छवि 1E). इसके बाद, CD11b और CD11c अभिव्यक्ति के के CD45 बीच मूल्यांकन किया गया था आइए बी + कोशिकाओं से तीन क्षेत्रों (R1, R2, R3., अंजीर 1F) चित्रित करना. तीन क्षेत्रों में CD103 और F4/80 अभिव्यक्ति DCs और मैक्रोफेज के बीच भेद करने के लिए, क्रमशः के लिए मूल्यांकन किया गया था. CD11c + CD11b सुस्त / - r1 के कोशिकाओं αE Integrin, CD103, और F4/80 के निम्न स्तर (छवि 1G) के उच्च स्तर व्यक्त की है. CD11b + CD11c + R2 का कोशिकाओं दोनों DCs और मैक्रोफेज CD103 और F4/80 (1H छवि) के दिचोतोमोउस अभिव्यक्ति के आधार पर बना रहे थे, जबकि CD11b में + CD11c / सुस्त R3 की कोशिकाओं / F4 प्ररूपी प्रोफ़ाइल पर आधारित मैक्रोफेज का गठन 80 + और ​​CD103 - ( 16. R2 और R3 गेट में फाटक मैक्रोफेज भीतर मैक्रोफेज समान आगे और ओर बिखराव गुण है और CD11c अभिव्यक्ति से साफ़ कर रहे हैं. इन सबसेट के कार्यात्मक विरोधाभास अधूरे समझ बनी हुई है.

कुल सेल उपज और CD11b और CD11c की अभिव्यक्ति पर ऊतक पाचन की अवधि के बीच संबंध चित्रा 2 में सचित्र है. आंतों ऊतक कि 3 मिनट (तहत पाचन) के लिए पचा किया गया था कम कुल सेल संख्या (छवि 2 डी) और इस प्रकार कुछ DCs और लक्षण वर्णन के लिए उपलब्ध मैक्रोफेज (2A छवि) मिले. 11 मिनट के लिए ऊतक पाचन DCs और मैक्रोफेज है कि CD11b और CD11c के उच्च स्तर व्यक्त और phenotypically अलग छवि 2C थे की आबादी के साथ एक जीवित कोशिकाओं (छवि 2 ई) की मजबूत उपज का उत्पादन किया. इसके विपरीत, एक समान सेल उपज में 50 मिनट (पाचन) के लिए पाचन परिणामस्वरूप सह जबmpared अनुकूलित पाचन (छवि 2 ई और एफ) के लिए, तथापि, अलग अलग सेल CD11b और CD11c का उपयोग आबादी के वर्णन अधिक कम CD11c की अभिव्यक्ति के रूप में अस्पष्ट हो गया (छवि 2C) और मृत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई (नहीं दिखाया डेटा).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free
Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red Fisher Scientific SH3001603
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
1M HEPES in 0.85% NaCl Lonza Inc. 17-737E
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150H Heat-inactivated
0.5M EDTA (pH 8.0) Cellgro 46-034-CI
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C2139
DNase I Roche Group 14785000 Stock solution: 100mg/ml
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation Invitrogen L34957 Use at 1:1000
CD45-PerCP mAb (30F11) BD Biosciences 557235 Use at 1:100
CD103-PE mAb (M290) BD Biosciences 557495 Use at 1:100
FcγRIII/II mAb (2.4G2) BD Biosciences 553141 Use at 1:200
CD11c-APC mAb (N418) eBioscience 17-0114-82 Use at 1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb eBioscience 56-5321-82 Use at 1:100
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) eBioscience 48-0112-82 Use at 1:200
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) eBioscience 25-4801-82
CD11b microbeads Miltenyi Biotec 130-049-601
CD11c microbeads Miltenyi Biotec 130-052-001
50 mL conical tubes BD Biosciences 352098
Single mesh wire strainer Chefmate
Small weigh boat Fisher Scientific 08-732-116
100 μm cell strainer BD Biosciences 352360
40 μm cell strainer BD Biosciences 352340
5 mL polystyrene round-bottom tubes BD Biosciences 352235 Use at 1:100
MaxQ 4450 benchtop orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Inc.
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
LSR II BD Biosciences
FACSAria II BD Biosciences

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References

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Comments

5 Comments

  1. Hi,

    This is probably your most frequently asked questions. I have the correct Collagenase and I add 30 mg to the ²0 mL prewarmed HBSS with ² mM EDTA. Despite 1 hour at 37 at ²00 the intestine is very stubborn and refuses to digest. I mince it just as described. Any thoughts?? Should I work on increasing the collagenase concentration?

    Many thanks

    Reply
    Posted by: Shehzad S.
    June 13, 2012 - 8:53 AM
  2. Hello there,

    Thank you for your interest in the protocol. Your question seems very perplexing as we have never experienced difficulties with tissue digestion durations greater than 15 minutes, and you seem to be having difficulties after 1 hour. We do not use the ² mM EDTA during tissue digestion and the recommendations I can make are: do not digest the tissue for 1 hour, ensure that you are using an orbital shaker with the 50 ml conical tubes lying horizontally, mince the tissue more finely, and vortex for 50 ml conical tubes after digestion for about 15 to ²0 seconds so that any remaining intestinal tissue is dissociated and digested (you may get some strands of stromal tissue remaining at the end, which is normal). Hope this helps! Please cite our work if you utilize our protocol! Thank you.

    Reply
    Posted by: Duke G.
    June 22, 2012 - 11:16 AM
  3. who can i have a showed vidio play. i want to waching move

    Reply
    Posted by: lee j.
    October 18, 2012 - 9:17 AM
  4. Hi,

    I am using type IV collagenase. I am wondering what U/mg you are using the the type VIII collagenase at?

    Cheers!

    Reply
    Posted by: Mark D.
    November 20, 2012 - 3:17 PM
  5. also,

    I was wondering what is the total cell count you get from 1 small intestine and what cell count you get of cd11c cells per intestine.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Mark D.
    November 21, 2012 - 1:27 PM

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