一种实用的新的方法来提取基因组DNA保存血浆蛋白从血液采集套件

Biology

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Summary

我们所描述的从全血收集的血浆/血清中分离基因组DNA的新方法。血浆采集后,压实血通常是被丢弃。我们的新方法较现有方法相比,一个显着的改善,使得DNA,不要求额外的血液和血浆可以从一个单一的集合。

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Waters, J., Dhere, V., Benjamin, A., Sekar, A., Kumar, A., Prahalad, S., et al. A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation. J. Vis. Exp. (75), e4241, doi:10.3791/4241 (2013).

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Abstract

实验室测试,可以做到对细胞或血液的流体部分。不同的血液收集管的使用确定的部分可以被分析的血液(全血,血浆或血清)。实验室参与研究人类疾病的遗传基础,依靠抗凝全血收集在含EDTA真空采血管作为源DNA遗传/基因组分析。因为大多数临床实验室进行生化,血清学和病毒的​​检测表型的结果调查作为第一步,也收集在含肝素管(等离子管)抗凝血。因此,当DNA和等离子所需的同时并行分析的基因组和蛋白质组数据,这是习惯EDTA和肝素管中收集血液。如果血液可以在单管中收集作为血浆和脱氧核糖核酸的源,该方法将被认为是提高现有的甲基消耗臭氧层物质。使用压实血提取血浆后表示的另外来源的基因组DNA,从而减少了处理的血液样本量,并减少从每个病人所需的样本的数量。这将最终节省时间和资源。

创建BD P100血液收集系统保存血浆蛋白作为一种改进方法比以前的血浆或血清收集管1,稳定血液中的蛋白质含量,从而更好的蛋白质生物标志物的发现和蛋白质组学实验从人血。 BD P100的管内含有15.8毫升K2EDTA喷雾干燥和冻干的专有广谱蛋白酶抑制剂鸡尾酒,以防止凝血和稳定的血浆蛋白。它们还包括机械分离器,它提供了离心后的血浆和细胞颗粒之间的物理屏障。已经制订了一些方法提取DNA血块SA收集旧的等离子管mples 2-4。这些方法的挑战主要与隔板内部管(凝胶分离器)的类型,包括恢复血液凝块的困难,不便过于分散或分散的血块,血块阻塞提取分离凝胶。

我们提出的第一个方法,在新的BD P100管抽血,基因组DNA的提取和净化。我们的DNA样品的质量进行比较,从P100管从EDTA管。我们的做法是简单而有效的。它包括四个主要步骤如下:1)使用的等离子体BD(BD诊断,火花,马里兰州,美国)P100管机械分离器的采血,2)机械分离器除去使用蔗糖的组合和无菌的曲别针的金属钩,3)的血沉棕黄层的层含有白细胞和4的分离)从基因组DNA的分离白膜使用一个普通的商业DNA提取试剂盒或类似的标准协议。

Protocol

1。样品采集

  1. 抽取血液样本,从个人与适当的知情同意。对于每一个人来说,绘制成P100管(BD诊断,富兰克林湖,NY,USA)的4〜5毫升血液。为了便于比较,同时收集血液EDTA管。
  2. BD P100管含有15.8毫升的喷雾干燥K2EDTA和冻干专利广谱蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,以防止凝血和稳定的血浆蛋白。它们还包含一个机械分离器。采集全血后,保持在室温下放置60分钟至过夜,直到两个管子处理发生。
  3. BD P100管离心15分钟,在室温下在2,500克。转移到微离心管上方的机械分离器收集的血浆。
  4. P100管存储,含有血液分离器下方的压实,在-80°C,直到你准备开始DNA转raction。

2.1从血液P100管(P100_DNA)

  1. P100的管保存在-80°C后血浆提取。在3至4个月,检索P100的管中,压实的血液从冷冻和解冻,在37℃的水浴中5分钟( 图1A)。删除任何残留的血浆分离坐在上面。加入2毫升17%的蔗糖溶液(梯度溶液内部测试-未发表的数据)以上P100管分离( 图1B)。离心管在室温下搅拌20分钟,在2,500克;这个过程中推压机械分离器管的顶部,产生的血沉棕黄层( 图1C)的解决方案,包括三层。手动提取使用steriled钩状金属回形针( 图1D)分隔。
  2. 检索从每个管中( 图1D)的机械分离器后,取出和抛弃它d为顶蔗糖层。转移到无菌的15毫升锥形管的中间层,代表的血沉棕黄层(BC)层。加入磷酸盐缓冲液(PBS),血沉棕黄层体积增加至3ml。按照制造商的建议,使用试剂从Qiagen公司Puregene的血包从白膜中提取的DNA除外的2,500克(而不是2000克)的离心速度。
  3. 以溶解和去除红血细胞(RBC),加入9毫升红细胞裂解3毫升的血沉棕黄层。每个管倒置几次,并在室温下孵育10分钟,偶尔在温育过程中反相。向下旋转每种混合物在2,500克5分钟,弃上清。治疗其它颗粒在每个管中,用3毫升的细胞裂解缓冲液和旋涡,持续15秒。治疗的溶胞产物的蛋白沉淀溶液,用1毫升,在15秒的涡流。
  4. 2,500 g下离心5分钟,将上清转移到一个新的15毫升锥形管中3毫升100%的异丙醇。反转的新管10倍和离心机在2,500 G为3分钟。弃上清,加入1毫升70%的乙醇。倒置的锥形管打跑了几次,洗DNA沉淀。离心1分钟2500克。允许沉淀3分钟(颠倒放置管),在室温下干燥,然后暂停的的水化溶液用250ml的DNA在37℃下10分钟,并转移至预先标记的1.7毫升的微管。存储管在-80℃直到使用。

2.2从血液的EDTA Ttube(EDTA_DNA)

  1. 喷雾涂有10.8毫克K 2 EDTA,并储存在-80℃下,全血被收集在用于常规免疫血液学测试塑料vaccutainer管由于显像管不包含机械分离器,提取DNA不包括涉及机械分离器(2.1.1和2.1.2)的步骤。
  2. 在3至4个月的储血,DNA被提取使用翠鸟的Flex(赛默飞世尔科技,沃尔瑟姆,MA,USA)。这是基于磁性颗粒技术,由细胞裂解/ DNA结合,一些洗涤步骤和DNA洗脱的自动化DNA提取系统。
  3. DNA提取中使用的试剂盒是:翠鸟Flex 24的DNA血液试剂盒(Qiagen,德国)。

3。 DNA数量与质量评价

基因组DNA的数量,质量和完整性进行评估相结合的方法,包括picogreen,光谱仪和电泳。

  1. 的基因组DNA的浓度来确定的NanoDrop和picogreen定量。
  2. Nanodrop分光光度计上测量从260/280的比例来确定的纯度。
  3. 样品(500毫微克)还装载在1%琼脂糖凝胶中的DNA的完整性进行评估(退化)。

4。 Genotypin克分析和质量控制

  1. 五P100_DNA其相应的EDTA_DNA样本是随机选择使用定制的免疫芯片(DNA分析BeadChip芯片免疫)作进一步的分析。免疫芯片的Infinium含196,524多态性基因分型芯片是专为免疫遗传学研究5。
  2. 对于每个样品,200 ng的DNA被扩增,分散,沉淀和重新悬浮在适当的杂交缓冲液中。
  3. 免疫芯片上杂交变性的样品在48℃下至少16小时。
  4. 杂交后,免疫芯片单碱基延伸反应和彩色处理。
  5. 免疫芯片,然后成像利用Illumina Hiscan的磁珠阵列阅读器和归一化的钢丝强度的数据加载到Illumina公司GenomeStudio软件转换成基因型。基因型使用GenomeStudio自动调用算法被称为。质量控制volves的呼叫率<95%的单核苷酸多态性(SNPs)的排除。
  6. 的SNP的呼叫率是用来作为衡量免疫芯片检测的效率。算方法,是检测在芯片上(196524个SNP位点编码的,每个芯片上),达到足够的信号强度和质量,接收一个自动化的基因型分配的总数的百分比。 HapMap的对照DNA免疫芯片检测包括在至少相同的呼叫率预计能实现高品质的DNA(260/280比率为1.8或更高,和不存在下的降解)。质量控制涉及排斥的SNPs与呼叫率<95%,在每个数据集。

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Representative Results

DNA质量评估和浓度测量

的产率P100_DNAs明显低于那些的EDTA_DNAs( 表12)。 260/280的比值所表示的DNA的纯度都P100_DNA EDTA_DNA样品组( 表12)类似。虽然一些退化看到在EDTA_DNA样本,如由光线浸润( 图2)的各组样本内的DNA的质量是相当均匀的。更多退化的迹象表明EDTA_DNAs也表明DNA浓度降低。

基因分型

基因分型拆借利率进行了比较为两个EDTA_DNAs P100_DNAs的。他们取得了类似的通话费率,都是比较内部的人类基因组单体型图的控制DNA( 表3)。

图1。捉鬼大衣隔离。

图1
表1中。 DNA样本率(PicoGreen)和比率的NanoDrop。

DNA产量 DNA纯度
样品 P100 EDTA P100 EDTA
1 135 340 1.79 1.9
2 119 344 1.85 1.89
3 57 129 1.88 1.88
4 159 640 1.86 1.88
5 140 430 1.86 1.88
6 150 673 1.86 1.9
7 139 425 1.74 1.88
8 118 240 1.87 1.86
9 51 86 1.87 1.83
p值 P = 0.00221 P = 0.09836

表2中。产量和纯度比较(双尾配对样本t检验)。

为了=“1”>
基因分型细胞率
样品 P100 EDTA
1 97.9 97.5
2 97.9 97.8
4 97.4 97.5
7 97.5 98.2
8 97.9 98
P值 P = 0.67970

表3中。基因分型呼叫率(双尾配对样本t检验)。

“> P100_06
样品 产量(μg) 比(260/280)
巴菲大衣 150 1.86
RBC 4.13 1.73
P100_07 巴菲大衣 139 1.74
RBC 1.00 1.70
P100_08 巴菲大衣 118 1.87
RBC 3.72 1.78
P100_09 巴菲大衣 51 1.87
RBC 0.23 0.98

附录。红血细胞(RBC)的层中发现的DNA的量的评价。

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Discussion

许多人类疾病的遗传原因和探索人类疾病的遗传基础,要求越来越高品质的DNA。遗传研究中使用的最常见的来源的DNA抗凝全血。因为大多数临床实验室进行生化,血清学,病毒检测表型结果调查中,作为第一步,血液被收集在一个等离子管。后收集血浆,压实的血液经常被丢弃。因此,当需要的DNA进行基因的研究或测试时,需要一个额外的抽血来自同一病人。丢弃的压实血指DNA的一个潜在来源,因为它包含的白血细胞。因此,使用压实血从血浆管提供了一个机会,更有效地使用收集到的血液样本,而不需要借助剩余的血液或记得加血的病人。

前的各种方法道白细胞DNA的压实或血块已报告6-10。大多数这些方法的挑战相关的血浆收集管的设计。较早血浆收集管中的隔板制成的凝胶(凝胶分离器),在离心分离时,形成了屏障,从血浆中(位于上方的分离器),分离血细胞(被困隔板下方)。用的凝胶材料,以防止污染的血细胞,分离器必须首先被小心移除,从管11。其次是由血液凝块的碎片,以保证高效的DNA提取。碎裂过程往往导致一个重大的损失血样和DNA产量减少。为了最大限度地减少了样品损失,提高的过程,小孔网状用于机械分散血块切成小块12,但仍然受到碎片的DNA产量和质量和eVEN构成危害健康技术员13。

BD P100管BD生物科学是最新一代的多免疫研究14评估的血浆采集管。像以前的等离子管,它们含有抗凝血剂以防止凝血和蛋白酶抑制剂,稳定的血浆蛋白。 BD P100管驻留在机械分离器(不是凝胶分离器),每个管内的重大创新。机械分离器还提供血浆和细胞沉淀,离心后之间的物理屏障,但不同的是凝胶分离器中,通过凝胶不提供样品污染风险。本研究采用的协议不包括破碎,因此有没有健康危害风险。

白膜提取DNA,使用商业套件协议(见DNA提取)。压实血BD P100管cryop保留一段DNA提取前的3至4个月。从EDTA管(EDTA_DNA)中提取的DNA被用来作为控制在其相应P100_DNA的产量和质量的评估。从以往的研究12,13,15,的EDTA_DNA样品的产率显着高于以往的等离子管从血液的DNA。压实血的血沉棕黄层为相同的量从每名患者收集的全血,在这项研究中,产生较少的DNA( 表2,p值= 0.00221)。在新的P100等离子管从血液中提取DNA,会丢失一些捉鬼海岸的白血细胞,红血细胞层(下面),但指单项金额不重大的DNA相比,那些从白膜(见附录表)。收率与EDTA_DNAs看到的变化也模仿与P100_DNA这表明它是取决于样品。量较高的样品,通常会产生更多的DNA和样本量较低及/或略有降解的DNA会产生较少的DNA。

琼脂糖凝胶电泳分析( 图2)显示,EDTA_DNAs显示退化的迹象(涂抹)不其相应的P100_DNAs中看到。尤其是,两个EDTA_DNA的的样品(EDTA_01053 EDTA_06030)的最低收益率表明比别人更多涂抹。在他们的研究中,黄 11日报道贮存时间增加DNA产量下降。由于我们的资源库中的所有的血液样本进行相同的储存条件下,本研究中使用的样本的子集是随机选择的,存储的长度和条件不可能帐户上的琼脂糖凝胶在的P100_DNAs和EDTA_DNAs之间的差异。仅的EDTA_DNAs显示退化的事实,可以在相关联的缺乏蛋白酶抑制剂EDTA管中的。

的纯度的P100_DNAs和EDTA_DNAs的差异并不显着(

所使用的样本被招募的炎症性肠道疾病的遗传研究。因此,提取的DNA样品的性能进行比较,在免疫芯片5被选择的基因分型测试平台。免疫芯片已被用作免疫遗传学16,17罚款映射的基因分型平台。 SNP基因分型检测全基因组的性质,使用的DNA的性能作为一个严格的措施。在所有芯片中,所有的DNA测试和HapMap项目控制样品的平均基因分型通话费率,分别为97.76%和97.4%,分别来自血液收集管显示可比性能优良的DNA(

结论

DNA可以分离从压实BD P100的管子,促进血浆蛋白质组学研究得出相同的血液样本的基因组测试的血液。我们的研究结果扩展了研究实用P100管。事实上,在P100中收集的血细胞含量的DNA是用于基因组分析可以帮助简化了样品采集,将进行的研究中,蛋白质组学和基因组分析。因此,血少,需要从每个人的主题和相关联的节省成本和精力研究的赞助商和工作人员提高。证明有几个优点:

  • 血少,需要每个人的主体时,则需要进行基因组学和蛋白质组学研究。与疾病状况的患者(如白血病),这就需要仔细限制的血液量,可以得出,这是具有特殊价值。
  • 只有一管血管过程中需要样品采集和处理步骤,简化了整体协议。
  • 例行的商业试剂盒已被证明BD P100管收集的血液中提取DNA的效率。
  • 配合使用,采集和处理一个管相关的节约成本增加。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD P100 tubes BD Diagnostics 366448
EDTA tubes BD Diagnostics 367863
Sucrose Sigma S9378
Paper clip Office product
15 ml tube Corning 430052
Red blood cells (RBC) Qiagen 158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS) Thermo Scientific SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) Qiagen 940054
1.7 ml microtubes Axygen MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit Illumina WG-352-1001
Bead array reader Illumina NA
GenomeStudio Software Illumina N/A

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References

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