Author Produced

En praktisk og Novel metode for å utvinne genomisk DNA fra Blodprøverør Kits for Plasma Protein Preservation

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en ny metode for å isolere genomisk DNA fra blod samles for plasma / serologi. Etter plasma-samlingen, er den kompakterte blod vanligvis kassert. Vår nye fremgangsmåte representerer en betydelig forbedring i forhold til eksisterende metoder og gjør DNA tilgjengelig og plasma fra en enkelt kilde, uten å be om ytterligere blod.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Waters, J., Dhere, V., Benjamin, A., Sekar, A., Kumar, A., Prahalad, S., Okou, D. T., Kugathasan, S. A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation. J. Vis. Exp. (75), e4241, doi:10.3791/4241 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Laboratorieprøver kan gjøres på de cellulære eller væske partier av blod. Bruken av forskjellige blodprøverør bestemmer den del av blodet som kan analyseres (fullblod, plasma eller serum). Laboratorier involvert i å studere det genetiske grunnlaget for menneskelige lidelser stole på antikoagulert fullblod samlet i EDTA-holdig vacutainer som kilden til DNA for genetisk / genomisk analyse. Fordi de fleste kliniske laboratorier utføre biokjemiske, serologiske og viral testing som et første skritt i fenotypisk utfallet etterforskning, er antikoagulert blod også samlet i heparin-holdig tube (plasma tube). Derfor når DNA og plasma er nødvendig for samtidig og parallelt analyser av både genomisk og proteomikk data, er det vanlig å samle opp blod i både EDTA og heparin rør. Hvis blodet kan samles i et enkelt rør og tjener som en kilde for både plasma-og DNA, vil denne metoden anses en avansement til eksisterende methods. Bruken av den komprimerte blod plasma etter ekstraksjon representerer en alternativ kilde for genomisk DNA, og dermed minimere mengden av blod-prøver behandlet og redusere antall prøver kreves fra hver pasient. Dette vil til slutt spare tid og ressurser.

Den BD P100 blod innsamlingssystem for plasmaprotein bevaring ble laget som en forbedret fremgangsmåte i forhold til tidligere plasma eller serum samling rør 1, for å stabilisere proteininnholdet i blod, slik at bedre protein biomarkører og proteomforskning eksperimentering fra humant blod. BD P100 rørene inneholder 15,8 ml spray-tørket K2EDTA og frysetørret proprietær bredt spekter cocktail av proteasehemmere for å hindre koagulasjon og stabilisere plasmaproteiner. De kan også inkludere en mekanisk separator, som gir en fysisk barriere mellom plasma og celle-pellets etter sentrifugering. Noen metoder har blitt utviklet for å trekke ut DNA fra levret blod samples samlet i gamle plasma rør 2-4. Utfordringer fra disse metodene var i hovedsak knyttet til den type separator inne i rørene (gel separator) og inkludert problemer med å utvinne levret blod, det inntrufne av fragmentering eller spredning blodpropp, og obstruksjon av blodpropp utvinning av separasjon gel.

Vi presenterer den første metoden som trekker ut og renser genomisk DNA fra blod trekkes i de nye BD P100 rør. Vi sammenligne kvaliteten av DNA-prøven fra P100 rør som fra EDTA-rør. Vår tilnærming er enkel og effektiv. Det omfatter fire hovedtrinn som følger: 1) bruk av et plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) rør med mekanisk separator for blodprøvetaking, 2) fjerning av den mekaniske separatoren ved hjelp av en kombinasjon av sakkarose og et sterilt binders metallisk krok, 3) separasjon av de buffy coat laget som inneholder de hvite celler og 4) isolering av genomisk DNA fra denbuffycoat å bruke en vanlig kommersiell DNA-ekstraksjon kit eller en lignende standard protokoll.

Protocol

En. Prøvetaking

  1. Samle blodprøver fra personer med riktig informert samtykke. For hvert individ, tegne 4-5 ml blod inn i et rør P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). For sammenligningens skyld, samtidig samle blod i en EDTA røret.
  2. BD P100 rørene inneholder 15,8 ml spray-tørket K2EDTA og frysetørret proprietær bredt spekter cocktail av proteasehemmere for å hindre koagulasjon og stabilisere plasmaproteiner. De inneholder også en mekanisk separator. Etter oppsamling av den fullblod, holde begge rør ved romtemperatur i 60 minutter til over natten inntil behandlingen foregår.
  3. Sentrifuger BD P100 rør på 2500 g for femten minutter ved romtemperatur. Overfør plasma samlet inn over mekanisk separator inn mikrosentrifugerør.
  4. Oppbevar P100 rør, inneholder blodet komprimeres under separator, ved -80 ° C før du er klar til å begynne DNA extraction.

2.1 Fra blod P100 tube (P100_DNA)

  1. P100 Rørene blir lagret ved -80 ° C etter plasma-ekstraksjon. Innen 3 til 4 måneder, hente den P100 røret som inneholder kompaktert blod fra fryseren og tines ved 37 ° i et vannbad i 5 min (figur 1A). Fjern eventuelle gjenværende plasma som sitter over separatoren. Tilsett 2 ml av 17% sukroseløsning (gradient løsning testet i huset - upubliserte data) på P100 rørene ovenfor separatoren (figur 1B). Sentrifuger rørene ved romtemperatur i 20 min ved 2500 g, og dette skyver selv den mekaniske separatoren til toppen av røret, og gir tre lag av oppløsning innbefattende den buffy coat (figur 1C). Manuelt trekke ut separatoren ved hjelp av en steriled hekta metall binders (figur 1D).
  2. Når du har hentet den mekaniske separator fra hvert rør (figur 1D), fjerne og discard toppen sukrose laget. Overfør den midtre lag, som representerer den buffy coat (BC)-laget, i en steril 15 ml konisk rør. Legg fosfatbuffer saltvann (PBS) for å øke buffy coat volum til 3 ml. Pakk ut DNA fra buffy coat bruke reagenser fra Qiagen Puregene Blood Kit som per produsentens anbefaling, bortsett fra en sentrifugering hastighet på 2500 g (i stedet for 2000 g).
  3. Å lysere og fjerne de røde blodceller (RBC), tilsett 9 ml av RBC-til 3 ml buffy coat. Invert hvert rør flere ganger og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter med leilighetsvis inverterende under inkubering. Spinn hver blanding nede på 2500 g for 5 min og kast supernatanten. Behandle den gjenværende pelleten i hvert rør med 3 ml cellelyse løsning og virvle i 15 sek. Unn lysatet med 1 ml protein presipiteringsoppløsning og virvle i 15 sek.
  4. Sentrifuger ved 2500 g i 5 min og supernatanten overføres til en frisk 15 ml konisk rør inneholdende3 ml av 100% isopropanol. Invertere nye rør 10 ganger og sentrifuger ved 2500 g for 3 min. Kast supernatanten og tilsett 1 ml 70% etanol. Invertere koniske rør et par ganger for å løsne og vaske DNA pellet. Sentrifuger ved 2500 g i 1 min. Tillat pelleten tørke i 3 min (plasserer røret opp ned) ved romtemperatur og deretter suspendere DNA med 250 ml av rehydrering-løsning ved 37 ° C i 10 min og overfør til en pre-merket 1,7 ml mikrorør. Oppbevar rørene ved -80 ° C inntil bruk.

2.2 Fra Blood of EDTA Ttube (EDTA_DNA)

  1. Den helblod for rutinen immunohematology testing samles i plast vaccutainer rør spray-belagt med 10,8 mg K 2 EDTA og lagret ved -80 ° C. Siden rørene ikke inneholder en mekanisk separator, ikke DNA-ekstraksjon ikke omfatte trinnene involverer den mekaniske separator (2.1.1 og 2.1.2).
  2. Innen 3 til 4 måneder av blod lagring, DNEn er hentet ved hjelp av KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Det er en automatisering DNA-ekstraksjon system basert på magnetisk partikkel teknologi og består av cellelyse / DNA-binding, flere vasketrinn og DNA elueringsmiddel.
  3. Settet brukes i DNA-ekstraksjon er KingFisher Flex 24 DNA Blood kit (Qiagen, Tyskland).

3. DNA Kvantitet og kvalitet Assessment

Mengden, kvaliteten og integriteten av det genomiske DNA ble undersøkt ved en kombinasjon av metode som inkluderer picogreen, spektroskopi og elektroforese.

  1. Konsentrasjonen av det genomiske DNA er bestemt av NanoDrop og picogreen kvantifisering.
  2. Renheten bestemmes fra 260/280 ratio måling på NanoDrop spektrofotometer.
  3. Prøven (500 ng) blir også lastet på 1% agarosegel for å vurdere integritet (degradering) av DNA.

4. Genotyping Analyser og kvalitetskontroll

  1. Fem P100_DNA og deres tilsvarende EDTA_DNA prøvene er tilfeldig valgt ut for nærmere analyse ved hjelp av tilpassede Immunochip (Immuno DNA analyse BeadChip). Immunochip er en Infinium genotyping chip som inneholder 196 524 polymorfismer og er utformet for immunogenetic studier fem.
  2. For hver prøve ble 200 ng av DNA amplifisert, fragmentert, utfelt og resuspendert i den passende hybridiserings-buffer.
  3. De denaturerte prøvene er hybridisert på Immunochips ved 48 ° C i minimum 16 timer.
  4. Etter hybridisering, er Immunochips behandlet for enkelt-base forlengelse reaksjoner og farget.
  5. De immunochips blir deretter avbildes med Illumina Hiscan Bead matrise leser og de normaliserte perle intensitet data er lastet inn i Illumina GenomeStudio programvare og omgjort til genotyper. Genotyper er kalt med autocalling algoritme av GenomeStudio. Kvalitetskontroll ivolves utelukkelse av single nukleotid polymorfismer (SNPs) med en takst <95%.
  6. SNP takst brukes som et mål på immunochip analysen effektivitet. Den beregnes som en prosentandel av det totale antallet analyser på chip (196 524 SNPs kodet på hver chip) som oppnår tilstrekkelig signal intensitet og kvalitet for å motta en automatisk genotype oppdrag. Høy kvalitet DNA (260/280 forholdet på 1,8 eller høyere, og fravær av degradering) er forventet å oppnå i det minste den samme takst som HapMap kontroll-DNA med i immunochip analysen. Kvalitetskontroll innebærer utelukkelse av SNPs med en takst <95% i hvert datasett.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DNA kvalitetsvurdering og konsentrasjonsmåling

Avkastningen av P100_DNAs var vesentlig lavere enn de av EDTA_DNAs (tabell 1 og 2). DNA renhet representert ved 260/280 ratio verdien er lik for både P100_DNA og EDTA_DNA prøvesett (tabell 1 og 2). Kvaliteten av DNA er ganske ensartet innenfor hvert sett av prøven selv om noen degradering er sett i EDTA_DNA prøvene, som indikert ved lyssmitte (figur 2). De EDTA_DNAs som viste flere tegn på nedbrytning viste også redusert DNA konsentrasjon.

Genotyping

Den genotyping takst for både EDTA_DNAs og P100_DNAs ble sammenlignet. De ga lignende ringe priser og begge var sammenlignbar med den interne HapMap kontroll-DNA (tabell 3).

"Figur Figur 1. Buffycoat isolasjon.

Figur 1
Tabell 1. DNA-prøve yield (PicoGreen) og ratio (NanoDrop).

DNA Yield DNA Purity
Prøver P100 EDTA P100 EDTA
1 135 340 1,79 1.9
2 119 344 1,85 1,89
3 57 129 1,88 1,88
4 159 640 1,86 1,88
5 140 430 1,86 1,88
6 150 673 1,86 1.9
7 139 425 1,74 1,88
8 118 240 1,87 1,86
9 51 86 1,87 1,83
p-verdi p = 0,00221 p = 0,09836

Tabell 2. Sammenligning av utbytte og renhet (tosidige, Paret Sample t-test).

orden = "1">
Genotyping Cell Rate
Prøver P100 EDTA
1 97.9 97.5
2 97.9 97,8
4 97.4 97.5
7 97.5 98.2
8 97.9 98
P-verdi p = 0,67970

Tabell 3. Genotyping takst (tosidige, Paret Sample t-test).

"> P100_06
Prøver Layers Avkastning (mikrogram) Ratio (260/280)
Buffycoat 150 1,86
RBC 4.13 1,73
P100_07 Buffycoat 139 1,74
RBC 1,00 1,70
P100_08 Buffycoat 118 1,87
RBC 3.72 1,78
P100_09 Buffycoat 51 1,87
RBC 0,23 0,98

Vedlegg. Evaluering av DNA-mengden som finnes i røde blodceller (RBC) lag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange menneskelige sykdommer har genetiske årsaker og utforske det genetiske grunnlaget for menneskelig sykdom krever en økende høy kvalitet DNA. Den vanligste kilde til DNA brukt i genetiske studier er antikoagulert fullblod. Fordi de fleste kliniske laboratorier utføre biokjemiske, serologiske, og viral testing som et første skritt i fenotypisk utfallet etterforskning, er blodet ofte samlet i en plasma tube. Etter samling av plasma, er den kompakterte blod ofte kastes. Derfor, når DNA er nødvendig for å utføre genetiske undersøkelser eller tester, er en ekstra blodprøvetaking kreves fra samme pasient. Den kasserte kompakterte blod representerer en potensiell kilde for DNA som inneholder den hvite blodlegemer. Derfor bruker komprimert blod fra plasma rør gir en mulighet til å bruke den innsamlede blodprøve mer effektivt, uten behov for å trekke overflødig blod eller hent pasienten for ekstra blod.

Ulike metoder til exskrift DNA fra de hvite cellene i komprimert eller levret blod har blitt rapportert 6-10. De fleste av utfordringene i disse metodene var i forbindelse med utformingen av plasma samling rør. Tidligere plasma samling rør inneholdt en separator fremstilt av en gel (gel separator) som, når den ble sentrifugert for å danne en barriere for å separere blodceller (fanget under separatoren) fra plasma (plassert over separatoren). For å unngå kontaminering av blodceller med det gel-materialet, må separatoren først fjernes forsiktig fra røret 11.. Dette er etterfulgt av en fragmentering av blodpropp å garantere effektiv DNA-ekstraksjon. Fragmenteringen prosess resulterer ofte i et betydelig tap av blodprøven og en reduksjon i DNA-utbytte. For å minimere prøvetap og forbedre prosessen, ble en liten pore-maske som brukes til mekanisk dispergert blodproppen i små biter 12, men fragmentering fortsatt påvirket DNA utbytte og kvalitet og even utgjorde en helsefare for teknikeren 13.

BD P100 rør fra BD biovitenskap er den nyeste generasjonen av plasma samling rør evaluert i multisenter immunologisk forskningsstudie 14. I likhet med de tidligere rørene plasma, inneholder de antikoagulanter for å hindre koagulasjon og protease-inhibitorer for å stabilisere plasmaproteiner. Den store innovasjon av BD P100 røret ligger i den mekaniske separator (ikke en gel separator) inne i hver tube. Den mekaniske separator gir også en fysisk barriere mellom plasma og celle-pelleten etter sentrifugering, men i motsetning til gelen separatoren, og har ingen risiko for kontaminering av prøver av en gel. Protokollen brukt i denne studien omfatter ikke en fragmentering, og derfor er det ingen helsefare risiko.

DNA ble ekstrahert fra buffy coat, ved hjelp av et kommersielt kit-protokollen (se DNA-ekstraksjon). Den komprimerte blod i BD P100 rørene var cryopreservert for en periode på 3 til 4 måneder før DNA-ekstraksjon. DNA ekstrahert fra EDTA-rør (EDTA_DNA) ble brukt som en kontroll i vurderingen av avling og kvalitet av deres tilsvarende P100_DNA. Fra tidligere studier 12,13,15, var avkastningen av EDTA_DNA prøvene betydelig høyere enn for DNA fra blod av tidligere plasma rør. I denne studien, for den samme mengde hel blod tatt fra hver pasient, ga buffy coat av den kompakterte mindre blod-DNA (tabell 2, p = 0,00221). Under DNA-ekstraksjon fra blodet i de nye P100 plasma rør, noen hvite blodlegemer fra Buffy kysten tapt til røde blodlegemer lag (under det), men representerer ubetydelig mengde DNA i forhold til de fra buffy coat (se vedlegg tabell). Variasjonen i avkastningen sett med EDTA_DNAs er også etterlignet med P100_DNA som tyder på at det er et eksempel avhengig. Prøver med høyere volum normalt vil gi mer DNA og prøvermed lavere volum og / eller litt degradert DNA ville gi mindre DNA.

Analyser av agarose gel (figur 2) viste at EDTA_DNAs viser tegn på nedbrytning (smøre) ikke sett i de tilhørende P100_DNAs. Spesielt to EDTA_DNA prøver (EDTA_01053 og EDTA_06030) med lavest avkastning vise mer smøre enn andre. I sin studie rapporterte Wong et al. 11. redusert DNA avkastning med økt lagringstid. Siden alle blodprøver i vårt oppbevaringssted ble utsatt for samme lagringsområde tilstand og prøven undergruppe brukt i denne studien ble tilfeldig valgt, lagring lengde og tilstanden er usannsynlig å ta hensyn til forskjellene sett på agarose gel mellom P100_DNAs og EDTA_DNAs. Det faktum at kun EDTA_DNAs viser degradering kan være assosiert til mangelen av protease-inhibitorer i EDTA-rør.

Renheten av P100_DNAs og EDTA_DNAs var ikke signifikant forskjellig (

Prøvene som ble brukt var rekruttert til de genetiske studier av inflammatorisk tarmsykdom. Derfor, for å sammenligne resultatene av de hentet DNA-prøver ble immunochip 5 valgt som genotyping testing plattform. Den immunochip har blitt brukt som en fin kartlegging genotyping plattform for immunogenetics 16,17. Genomet-wide naturen av SNP genotyping assayer ble anvendt som en korrekt måling av det DNA-ytelse. Den gjennomsnittlige genotyping ringeprisene for alle DNA-test og HapMap kontrollprøver, på tvers av alle chips, var 97,76% og 97,4% henholdsvis, viser sammenlignbare utmerket ytelse av DNA fra begge blodprøverør (

Konklusjon

DNA kan isoleres fra den komprimerte blod BD P100 rør, tilrettelegging genomisk testing fra samme blodprøve trukket for plasma proteomikk studier. Våre resultater utvide forskningen nytten av P100 tube. Det faktum at DNA i den cellulære innhold av blod samles i P100 er brukbare for genomisk analyser kan bidra til å forenkle prøvetagning for studier der både proteomikk og genomisk analyser vil bli utført. Derfor er mindre blod trengte fra hvert menneske og en tilhørende kostnader og innsats besparelser for studien sponsorer og ansatte er forbedret. Det er flere fordeler demonstrert:

  • Mindre blod som kreves per menneskelige motiv når begge genomisk og proteomikk studier må utføres. Dette er av spesiell verdi for pasienter med sykdomstilstander (for eksempel leukemi) som krever nøye begrensning av volumet av blod som kan trekkes.
  • Bare ett blod tube er nødvendig under prøven innsamling og prosessering trinn, forenkle den generelle protokollen.
  • En rutinemessig kommersielle kit har vist seg effektiv i å trekke ut DNA fra blod samles i BD P100 rør.
  • Kostnadsbesparelsene i forbindelse med bruk innsamling og prosessering av ett rør økes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD P100 tubes BD Diagnostics 366448
EDTA tubes BD Diagnostics 367863
Sucrose Sigma S9378
Paper clip Office product
15 ml tube Corning 430052
Red blood cells (RBC) Qiagen 158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS) Thermo Scientific SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) Qiagen 940054
1.7 ml microtubes Axygen MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit Illumina WG-352-1001
Bead array reader Illumina NA
GenomeStudio Software Illumina N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
  2. Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
  3. Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
  4. Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
  5. Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101 (2011).
  6. Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
  7. Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
  8. Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
  9. Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
  10. Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
  11. Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
  12. Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
  13. Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
  14. Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
  15. Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
  16. Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
  17. Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics