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Un método práctico y novela para extraer el ADN genómico de los kits de extracción de sangre para la Preservación Plasma Protein

Biology

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Summary

Estamos describiendo un nuevo método de aislamiento de ADN genómico a partir de sangre entera recogida para el plasma / serología. Después de la recogida de plasma, la sangre compactado se normalmente se descarta. Nuestro nuevo método representa una mejora significativa sobre los métodos existentes y hace que el ADN y el plasma disponible a partir de una sola colección, sin solicitar la sangre adicional.

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Waters, J., Dhere, V., Benjamin, A., Sekar, A., Kumar, A., Prahalad, S., Okou, D. T., Kugathasan, S. A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation. J. Vis. Exp. (75), e4241, doi:10.3791/4241 (2013).

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Abstract

Los exámenes de laboratorio pueden realizarse en las partes móviles o fluido de la sangre. El uso de diferentes tubos de recogida de sangre determina la porción de la sangre que puede ser analizada (sangre entera, plasma o suero). Los laboratorios que participan en el estudio de la base genética de los trastornos humanos se basan en la sangre entera anticoagulada recogido en vacutainer con EDTA como la fuente de ADN para el análisis genético / genómico. Debido a que la mayoría de laboratorios clínicos realizan las pruebas bioquímicas, serológicas y virales como un primer paso en la investigación resultado fenotípico, también se recogió sangre anticoagulada en el tubo que contiene heparina (tubo de plasma). Por lo tanto cuando el ADN y el plasma se necesitan para análisis simultáneos y paralelos de datos genómicos y proteómicos tanto, es habitual para recoger la sangre tanto en tubos de heparina y EDTA. Si la sangre se puede recoger en un solo tubo y servir como una fuente tanto para el plasma y de ADN, que el método sería considerado un avance a la metanfetamina existentesods. El uso de la sangre compactada después de la extracción de plasma representa una fuente alternativa para el ADN genómico, minimizando así la cantidad de muestras de sangre procesadas y reducir el número de muestras requeridas de cada paciente. Esto en última instancia, ahorrar tiempo y recursos.

El sistema de recogida de sangre P100 BD para la conservación de las proteínas del plasma se crea como un método mejorado más de plasma anterior o recogida de suero tubos 1, para estabilizar el contenido de proteína de la sangre, permitiendo un mejor descubrimiento de biomarcadores de proteínas y proteómica experimentación a partir de sangre humana. Los tubos P100 BD contienen 15,8 ml de K2EDTA secado por pulverización y un amplio espectro de cóctel patentada liofilizado de inhibidores de la proteasa para evitar la coagulación y estabilizar las proteínas del plasma. También incluyen un separador mecánico, que proporciona una barrera física entre el plasma y glóbulos de células después de la centrifugación. Algunos métodos se han ideado para extraer el ADN de la sangre coagulada samples recogieron en tubos de plasma viejos 2-4. Desafíos de estos métodos se asocian principalmente con el tipo de separador dentro de los tubos (gel separador) y se incluyen dificultad en la recuperación de la sangre coagulada, la inconveniencia de fragmentar o dispersar el coágulo, y obstrucción de la extracción del coágulo por el gel de separación.

Se presenta el primer método que extrae y purifica el ADN genómico de la extracción de sangre en los nuevos tubos P100 BD. Se compara la calidad de la muestra de ADN de P100 tubos para que a partir de tubos de EDTA. Nuestro enfoque es simple y eficiente. Se trata de cuatro pasos principales de la siguiente manera: 1) el uso de una BD P100 plasma (Diagnósticos de BD, Sparks, MD, EE.UU.) con el tubo separador mecánico de extracción de sangre, 2) la eliminación de la separación mecánica mediante una combinación de sacarosa y una estéril gancho de clip de papel metálico, 3) la separación de la capa de la capa leucocitaria que contiene los glóbulos blancos y 4) el aislamiento del ADN genómico a partir de lacapa leucocitaria usando un kit de extracción de ADN comercial regular o un protocolo estándar similar.

Protocol

1. Recogida de muestras

  1. Recoger muestras de sangre de individuos con el consentimiento informado adecuado. Para cada individuo, dibuja 4 a 5 ml de sangre en un tubo P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, EE.UU.). Para propósitos de comparación, al mismo tiempo recoger la sangre en un tubo con EDTA.
  2. Los tubos P100 BD contienen 15,8 ml K2EDTA secado por pulverización y un amplio espectro de cóctel patentada liofilizado de inhibidores de la proteasa para evitar la coagulación y estabilizar las proteínas del plasma. También contienen un separador mecánico. Después de recoger la sangre entera, mantener los dos tubos a temperatura ambiente durante 60 minutos a toda la noche hasta que se produce el procesamiento.
  3. Centrifugar los tubos BD P100 a 2500 g durante quince minutos a temperatura ambiente. Transferir el plasma recogido por encima del separador mecánico en tubos de micro centrífuga.
  4. Guarde los tubos P100, que contiene la sangre compactado debajo del separador, a -80 ° C hasta que esté listo para comenzar la ext ADNraction.

2.1 A partir de la sangre del tubo P100 (P100_DNA)

  1. Los tubos de P100 se almacenan a -80 ° C después de la extracción de plasma. Dentro de los 3 a 4 meses, recuperar el tubo que contiene la sangre P100 compactado del congelador y descongelar a 37 ° en un baño de agua durante 5 minutos (Figura 1). Retire cualquier plasma residual que se encuentra por encima del separador. Añadir 2 ml de solución de sacarosa al 17% (solución de gradiente probado en casa - datos no publicados) en los tubos de P100 por encima del separador (Figura 1B). Centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 20 min a 2500 g; este proceso empuja el separador mecánico a la parte superior del tubo y produce tres capas de solución que incluye la capa leucocitaria (Figura 1C). Extraer manualmente el separador utilizando un clip de metal gancho steriled (Figura 1D).
  2. Después de recuperar el separador mecánico de cada tubo (Figura 1D), retire y discard de la capa de sacarosa superior. Transferir la capa media, que representa la capa de la capa leucocitaria (BC), en un tubo cónico de 15 ml estéril. Añadir tampón fosfato salino (PBS) para aumentar el volumen de la capa leucocitaria a 3 ml. Extraer el ADN a partir de la capa leucocitaria utilizando reactivos de la Blood Kit Qiagen Puregene según la recomendación del fabricante, a excepción de una velocidad de centrifugación de 2500 g (en lugar de 2000 g).
  3. Para lisar y eliminar las células rojas de la sangre (RBC), añadir 9 ml de RBC lisis a 3 ml de la capa leucocitaria. Invertir cada tubo varias veces y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min con inversión ocasional durante la incubación. Girar cada mezcla hacia abajo a 2.500 g durante 5 minutos y desechar el sobrenadante. Tratar el sedimento restante en cada tubo con 3 ml de solución de lisis celular y agitar durante 15 seg. Se trata el lisado con 1 ml de solución de precipitación de la proteína y agitar durante 15 seg.
  4. Se centrifuga a 2.500 g durante 5 min y transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 15 ml que contiene fresca3 ml de isopropanol al 100%. Invertir los nuevos tubos de 10 veces y centrifugar a 2500 g durante 3 min. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de etanol al 70%. Invertir los tubos cónicos de un par de veces para desalojar y lavar el sedimento de ADN. Centrifugar a 2500 g durante 1 min. Dejar que el precipitado se seque durante 3 min (colocar el tubo boca abajo) a temperatura ambiente y luego suspender el ADN con 250 ml de solución de rehidratación a 37 ° C durante 10 min y la transferencia a un pre-marcado con 1,7 ml microtubo. Guarde los tubos a -80 ° C hasta su uso.

2.2 De Sangre EDTA Ttube (EDTA_DNA)

  1. La sangre entera para las pruebas de inmunohematología rutina se recoge en tubos de plástico vaccutainer revisten mediante pulverización con 10,8 mg de K 2 EDTA y se almacenaron a -80 ° C. Debido a que los tubos no contienen un separador mecánico, la extracción de ADN no incluye las etapas que implican el separador mecánico (2.1.1 y 2.1.2).
  2. Dentro de los 3 a 4 meses de almacenamiento de la sangre, el DNA se extrae mediante el KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Se trata de un sistema de extracción de ADN basado en la tecnología de automatización de partículas magnéticas y se compone de células de lisis / unión a ADN, varias etapas de lavado y elución de ADN.
  3. El kit utilizado en la extracción de ADN es el Flex 24 kit de ADN de sangre KingFisher (Qiagen, Alemania).

3. ADN Cantidad y Evaluación de la Calidad

La cantidad, la calidad y la integridad del ADN genómico fueron evaluados por una combinación de método que incluye PicoGreen, la espectroscopia y la electroforesis.

  1. La concentración del ADN genómico se determina mediante la cuantificación Nanodrop y PicoGreen.
  2. La pureza se determina a partir de la medición de 260/280 en relación el espectrofotómetro Nanodrop.
  3. La muestra (500 ng) también está cargado en gel de agarosa al 1% para evaluar la integridad (degradación) del ADN.

4. GenotypinLos ensayos g y Control de Calidad

  1. Cinco P100_DNA y sus correspondientes muestras EDTA_DNA son seleccionados al azar para su posterior análisis mediante el Immunochip personalizado (Inmuno Análisis de ADN BeadChip). Immunochip es un chip de genotipado Infinium contiene 196.524 polimorfismos y está diseñado para los estudios de inmunogenética 5.
  2. Para cada muestra, 200 ng de ADN se amplifica, fragmentada, se precipitó y se resuspendió en el tampón de hibridación apropiada.
  3. Las muestras desnaturalizadas se hibridan en Immunochips a 48 ° C durante un mínimo de 16 horas.
  4. Después de la hibridación, los Immunochips se procesan para reacciones de extensión de una sola base y se tiñen.
  5. Los immunochips a continuación, se obtuvieron imágenes utilizando un lector de matriz Illumina Hiscan bolas y los datos de intensidad de talón normalizados se cargan en el software Illumina GenomeStudio y se convierten en genotipos. Los genotipos se denominan utilizando el algoritmo autocalling de GenomeStudio. El control de calidad eninvolucra la exclusión de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) con una tasa de llamada <95%.
  6. La tasa de llamada SNP se utiliza como una medida de la eficacia de la prueba immunochip. Se calcula como el porcentaje del número total de ensayos en el chip (196.524 SNPs codificado en cada chip) que lograr suficiente intensidad de la señal y la calidad para recibir una asignación automatizada genotipo. Se espera que el ADN de alta calidad (260/280 proporción de 1,8 o superior y en ausencia de degradación) para lograr al menos la misma tasa de llamada como el ADN de control HapMap incluido en el ensayo immunochip. El control de calidad implica la exclusión de SNPs con una tasa de llamada <95% en cada conjunto de datos.

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Representative Results

Evaluación de la calidad del ADN y medición de la concentración

Los rendimientos de P100_DNAs fueron significativamente más bajos que los de EDTA_DNAs (Tablas 1 y 2). La pureza del ADN representada por su valor de 260/280 proporción es similar tanto para el conjunto de la muestra y P100_DNA EDTA_DNA (Tablas 1 y 2). La calidad del ADN es bastante uniforme dentro de cada conjunto de la muestra a pesar de cierta degradación se ve en las muestras EDTA_DNA, como se indica por frotis de luz (Figura 2). Los EDTA_DNAs que mostraron más signos de degradación también mostraron menor concentración de ADN.

Genotipificación

Se comparó la frecuencia de llamada genotipo para ambos EDTA_DNAs y P100_DNAs. Se produjeron las tarifas de llamadas similares y eran tanto comparable con el ADN de control interno HapMap (Tabla 3).

"Figura Figura 1. Buffy aislamiento abrigo.

Figura 1
Tabla 1. Rendimiento de ADN de la muestra (PicoGreen) y la relación de (nanogota).

Rendimiento ADN Pureza ADN
Muestras P100 EDTA P100 EDTA
1 135 340 1.79 1.9
2 119 344 1.85 1.89
3 57 129 1.88 1.88
4 159 640 1.86 1.88
5 140 430 1.86 1.88
6 150 673 1.86 1.9
7 139 425 1.74 1.88
8 118 240 1.87 1.86
9 51 86 1.87 1.83
valor p p = 0,00221 p = 0,09836

Tabla 2. Comparativa de rendimiento y la pureza (de dos colas, muestras pareadas t-test).

order = "1">
Genotipado Celular Cambio
Muestras P100 EDTA
1 97.9 97.5
2 97.9 97.8
4 97.4 97.5
7 97.5 98.2
8 97.9 98
Valor P p = 0,67970

Tabla 3. Genotipado tarifa de llamadas (dos colas, muestras pareadas t-test).

"> P100_06
Muestras Capas Rendimiento (g) Ratio (260/280)
Buffy escudo 150 1.86
RBC 4.13 1.73
P100_07 Buffy escudo 139 1.74
RBC 1.00 1.70
P100_08 Buffy escudo 118 1.87
RBC 3.72 1.78
P100_09 Buffy escudo 51 1.87
RBC 0.23 0.98

Apéndice. Evaluación de la cantidad de ADN que se encuentra en la capa de glóbulos rojos (RBC).

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Discussion

Muchas enfermedades humanas tienen causas genéticas y exploración de la base genética de la enfermedad humana exige un ADN de alta calidad cada vez mayor. La fuente más común de ADN utilizado en los estudios genéticos se sangre entera anticoagulada. Debido a que la mayoría de laboratorios clínicos realizan las pruebas bioquímicas, serológicas, y virales como un primer paso en la investigación resultado fenotípico, la sangre se recoge a menudo en un tubo de plasma. Después de la recogida del plasma, la sangre compactada a menudo se desecha. Por lo tanto, cuando se necesita ADN para llevar a cabo estudios genéticos o de prueba, se requiere una extracción de sangre adicional del mismo paciente. La sangre compactado desechado representa una fuente potencial de ADN, que contiene las células blancas de la sangre. Por lo tanto, el uso de sangre compactado de los tubos de plasma ofrece la oportunidad de utilizar la muestra de sangre tomada de manera más eficiente, sin la necesidad de extraer exceso de sangre o retirar al paciente de sangre adicionales.

Varios métodos para extracto ADN de las células blancas de la sangre coagulada o compactada se ha informado 6-10. La mayoría de los retos de estos métodos se asociaron con el diseño del tubo de recogida de plasma. Tubos de recolección de plasma anteriores contenían un separador hecho de un gel (gel separador) que, cuando se centrifuga, se formó una barrera para separar las células de la sangre (atrapado debajo del separador) a partir del plasma (que se encuentra por encima del separador). Para evitar la contaminación de las células de la sangre con el material de gel, el separador primero se debe retirar con cuidado desde el tubo 11. Esto es seguido por una fragmentación del coágulo de sangre para garantizar la extracción de ADN eficiente. El proceso de fragmentación a menudo resulta en una pérdida significativa de la muestra de sangre y una reducción en el rendimiento de ADN. Para reducir al mínimo la pérdida de muestra y mejorar el proceso, una malla de poro pequeño se utilizó para dispersa mecánicamente el coágulo de sangre en trozos pequeños 12, pero la fragmentación rendimiento de ADN aún afectado y la calidad y el correoVen constituía un peligro para la salud para el técnico 13.

Los BD P100 tubos de BD biociencias son la última generación de los tubos de recogida de plasma evaluadas en el estudio multicéntrico inmunológica investigación 14. Al igual que los tubos de plasma anteriores, que contienen anticoagulantes para evitar inhibidores de la coagulación y de la proteasa para estabilizar las proteínas del plasma. La principal innovación del tubo P100 BD reside en el separador mecánico (no un separador de gel) en el interior de cada tubo. El separador mecánico también proporciona una barrera física entre el plasma y el pellet de células después de la centrifugación, pero a diferencia del gel separador, no ofrece ningún riesgo de contaminación de la muestra por un gel. El protocolo aplicado en este estudio no incluye una fragmentación, por lo tanto no hay riesgo para la salud.

El ADN se extrajo de la capa leucocitaria, usando un protocolo del kit comercial (véase la extracción de ADN). La sangre compactada en los tubos P100 BD fueron crioconservaciónreservada para un período de 3 a 4 meses antes de la extracción de ADN. ADN extraído de tubos de EDTA (EDTA_DNA) se utilizaron como control en la evaluación del rendimiento y la calidad de su correspondiente P100_DNA. A partir de estudios anteriores 12,13,15, los rendimientos de las muestras EDTA_DNA fueron significativamente más altas que la de ADN de la sangre de los tubos de plasma anteriores. En este estudio, para la misma cantidad de sangre entera obtenida de cada paciente, el escudo de la sangre compactado leucocitaria produjo menos de ADN (Tabla 2, p = 0,00221). Durante la extracción de ADN de la sangre en los nuevos tubos de plasma P100, algunas células blancas de la sangre de la costa leucocitaria se pierden a la capa de células rojas de la sangre (por debajo de ella), pero representa cantidad insignificante de ADN en comparación con las de la capa leucocitaria (véase el apéndice tabla). La variación en el rendimiento visto con EDTA_DNAs también es imitado con la P100_DNA lo que sugiere que es dependiente de la muestra. Las muestras con mayor volumen normalmente producir más ADN y muestrascon un menor volumen y / o ADN degradado ligeramente rendiría menos ADN.

Los análisis en gel de agarosa (figura 2) revelaron que EDTA_DNAs muestran signos de degradación (frotis) que no se ve en sus correspondientes P100_DNAs. En particular, dos muestras EDTA_DNA (EDTA_01053 y EDTA_06030) con el rendimiento más bajo frotis muestran más que otros. En su estudio, Wong et al. 11 informaron de rendimiento de ADN disminuyó con el aumento del tiempo de almacenamiento. Puesto que todas las muestras de sangre en nuestro repositorio fueron sometidos a las mismas condiciones de almacenamiento y el subconjunto de la muestra utilizada en este estudio se seleccionó al azar, longitud de almacenamiento y condiciones es poco probable para dar cuenta de las diferencias observadas en el gel de agarosa entre P100_DNAs y EDTA_DNAs. El hecho de que sólo EDTA_DNAs mostrar la degradación podría estar asociada a la falta de inhibidores de la proteasa en los tubos de EDTA.

La pureza de los P100_DNAs y EDTA_DNAs no fueron significativamente diferentes (

Las muestras utilizadas fueron reclutados para los estudios genéticos de la enfermedad inflamatoria del intestino. Por lo tanto, para comparar el rendimiento de las muestras de ADN extraídas, la immunochip 5 fue seleccionada como la plataforma de pruebas de determinación del genotipo. El immunochip se ha utilizado como una plataforma de genotipado mapeo fino para inmunogenética 16,17. El genoma de la naturaleza de los ensayos de SNP genotipificación se utilizó como una medida rigurosa de rendimiento de ADN. Las tarifas de llamadas genotipo promedio para todas las pruebas de ADN y muestras de control HapMap, en todas las fichas, fueron 97.76% y 97.4%, respectivamente, mostrando un excelente desempeño comparable del ADN de ambos tubos de extracción de sangre (

Conclusión

ADN se puede aislar de la sangre compactado de BD P100 tubos, facilitando pruebas genómico a partir de la misma muestra de sangre para estudios de proteómica plasma. Nuestros resultados extienden la utilidad de la investigación del tubo P100. El hecho de que el ADN en el contenido celular de la sangre recogida en P100 es utilizable para análisis genómicos puede ayudar a simplificar la adquisición de muestras para estudios en los que se realizaron análisis tanto proteómicos y genómicos. Por lo tanto, se necesita menos sangre de cada sujeto humano y se mejora un coste asociado y el ahorro de esfuerzo para los patrocinadores del estudio y el personal. Hay varias ventajas demostradas:

  • Se necesita menos sangre por cada ser humano cuando es necesario realizar dos estudios de genómica y proteómica. Esto es de especial valor para los pacientes con condiciones de enfermedad (tales como la leucemia) que requieren cuidado de limitación del volumen de la sangre que se puede extraer.
  • Sólo se necesita un tubo de sangre durante la adquisición y el procesamiento de las muestras medidas, lo que simplifica el protocolo general.
  • Un kit comercial rutinario ha demostrado su eficacia en la extracción de ADN a partir de sangre recogida en tubos BD P100.
  • El ahorro de costes asociados con el uso, adquisición y procesamiento de uno de los tubos se incrementa.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD P100 tubes BD Diagnostics 366448
EDTA tubes BD Diagnostics 367863
Sucrose Sigma S9378
Paper clip Office product
15 ml tube Corning 430052
Red blood cells (RBC) Qiagen 158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS) Thermo Scientific SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) Qiagen 940054
1.7 ml microtubes Axygen MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit Illumina WG-352-1001
Bead array reader Illumina NA
GenomeStudio Software Illumina N/A

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References

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