ניתוח ובניית מבני חומצות גרעין עם 3DNA

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

חבילת תוכנת 3DNA היא כלי פופולרי ביואינפורמטיקה ותכליתית עם יכולות לנתח, לבנות, ולדמיין מבני חומצות גרעין תלת ממדיים. מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים לקבוצת משנה של תכונות חדשות והפופולריות זמינות ב3DNA, החלים על שני מבנים והרכבים של מבנים הקשורים בודדים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Colasanti, A. V., Lu, X. J., Olson, W. K. Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA. J. Vis. Exp. (74), e4401, doi:10.3791/4401 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

חבילת תוכנת 3DNA היא כלי פופולרי ביואינפורמטיקה ותכליתית עם יכולות לנתח, לבנות, ולדמיין מבני חומצות גרעין תלת ממדיים. מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים לקבוצת משנה של תכונות חדשות והפופולריות זמינות ב3DNA, החלים על שני מבנים והרכבים של מבנים הקשורים בודדים. 1 פרוטוקול מפרט את הסט של הוראות הדרושות כדי להוריד ולהתקין את התוכנה. זה ואחריו, בפרוטוקול 2, על ידי הניתוח של מבנה חומצת גרעין, ובכלל זה את ההקצאה של זוגות בסיסים וקביעת פרמטרים נוקשי גוף המתארים את המבנה ואת, בפרוטוקול 3, על ידי תיאור של הבנייה מחדש של אטומי מודל של מבנה מהפרמטרים נוקשה הגוף שלה. הגרסה העדכנית ביותר של 3DNA, גרסת 2.1, יש לו תכונות חדשות לניתוח והמניפולציה של הרכבים של מבנים, כגון אלה המשתמעים מתהודה גרעינית (NMR) מדידות מגנטיות ו( MD הדינמי המולקולריסימולציות); תכונות אלה מוצגות בפרוטוקולי 4 ו -5. בנוסף לחבילת התוכנה העצמאית 3DNA, שרת האינטרנט w3DNA, הממוקם בhttp://w3dna.rutgers.edu, מספק ממשק ידידותי למשתמש לתכונות נבחרות של התוכנה. 6 פרוטוקול מדגים תכונה חדשנית של האתר לבניית מודלים של מולקולות דנ"א ארוכות מעוטרות בחלבונים מאוגדים במקומות משתמש שצוינו.

Introduction

הבנת המבנים תלת ממדיים של ה-DNA, RNA, והקומפלקסים שלהם עם חלבונים, סמים, וligands אחר, היא חיונית לפענוח התפקודים הביולוגיים השונים שלהם, ועל שאפשרה תכנון רציונלים של תרופות. חקירה של מבנים כאלה כרוך בשלושה מרכיבים נפרדים, אך קשורים באופן הדוק: ניתוח (כדי לחלץ דפוסים בצורות ובאינטראקציות), מודלים (כדי להעריך את האנרגטיקה ודינמיקה מולקולרית), והדמיה. ניתוח מבני ובניית מודל הם בעצם שני צדדים של אותו מטבע, ויזואליזציה משלימה את שניהם.

חבילת 3DNA של תוכנות מחשב היא ערכת כלים מבניות ביואינפורמטיקה פופולרית יותר ויותר עם יכולות לנתח, לבנות, ולדמיין מבני חומצות גרעין תלת ממדיים. פרסומים קודמים תאר את היכולות של תוכנת 1, ובלבד מתכונים לבצע משימות נבחרות 2, הציג את הממשק מבוסס אינטרנטלתכונות פופולריות של התוכנה 3, מסדי נתונים שהוצגו בתכונות מבניות נאספו באמצעות 4 3DNA, 5 ואייר את התועלת של התוכנה בניתוח של שני מבני RNA-DNA ו6, 7.

מטרתו של מאמר זה היא להביא את ערכת תוכנת 3DNA למדענים במעבדה ואחרים בעלי אינטרסים ו / או צרכי לחקור DNA וארגון המרחבי RNA עם כלים חישוביים מדינה-of-the-art. הפרוטוקולים שהוצגו כאן כוללים הוראות שלב אחרת שלב (i) כדי להוריד ולהתקין את התוכנה במערכת Mac OS X, (II-III) כדי לנתח ולשנות את מבני ה-DNA ברמה של הצעדים של זוגות בסיסים המרכיבים, ( IV-V) כדי לנתח וליישר סטים של מבני DNA קשורים, ו( vi) כדי לבנות מודלים של רשתות ה-DNA חלבון מעוטרים בממשק האינטרנט w3DNA ידידותי למשתמש. יש תוכנה את היכולת לנתח מבנים בודדים לפתור באמצעות שיטות קריסטלוגרפיים רנטגן כמו גם גדולהרכבים של מבנים שנקבעו עם תהודה (NMR) שיטות מגנטיות גרעיניות או שנוצרו על ידי טכניקות מחשב סימולציה.

המבנים בדקו כאן כוללים (i) את מבנה הגביש ברזולוציה גבוהה של ה-DNA חייב חלבון Hbb מBorrelia burgdorferi 8 (חיידק סמן הנישא שגורם למחלת ליים ב9 בני אדם, 10), (ii) שתי קבוצות גדולות של רצף מולקולות ה-DNA הקשורים מיוצרות עם סימולציות מולקולריות 11 - 4,500 תצלומים של D (GGCAAAATTTTGCC) 2 ו-D (CCGTTTTAAAACGG) 2 נאספו במרווחים של 100-psec בחישובים, וכן (iii) אנסמבל קטן של מבנים של מפעיל ה-DNA O3 מבוססי תמ"ג חייבים את headpieces של Escherichia coli לאק repressor החלבון 12. ההוראות שלהלן כוללות מידע על איך לגשת לקבצים של קואורדינטות אטומיות הקשורים כמו גם עם כל אחד מהמבנים האלה איך להשתמש 3DNA (עותק של קובץ זה נמצאבפורום 3DNA בhttp://forum.x3dna.org/jove) כדי לבחון ולשנות את המבנים האלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התקנה של חבילת התוכנה

  1. להתחבר לאתר 3DNA בhttp://x3dna.org ולחץ על הקישור לפורום 3DNA. בתוך הפורום בחר בקישור 'הירשם', ועקוב אחר ההוראות כדי ליצור חשבון חדש.
  2. ההתקנה הבאה הוראות הפירוט של התוכנה במחשב מקינטוש מבוסס OS X עם הקליפה "bash" ברירת מחדל. ההליך למערכות לינוקס או Windows (Cygwin, MINGW / MSYS) עם פגזים נפוצים (כולל 'tcsh') נמצא בתוך פורום 3DNA.
  3. לאחר שקבעת את שם משתמש וסיסמא, להיכנס לפורום. בחר בקישור 'הורדות' בסעיף ברוך ועל הדף החדש לבחור הורדת '3 DNA ". זה יביא אותך לדף הורדת 3DNA שבו ניתן להוריד גירסאות שונות של התוכנה.
  4. בחר את קישור Mac OS X לאינטל להוריד קובץ tarball דחוס (tar.gz) המכיל את התוכנה.
  5. קליק זוגיk על הקובץ (tar.gz) כדי ליצור תיקייה בשם x3dna-v2.1. תיקייה זו, המכילה את חבילת תוכנת 3DNA, ניתן להעביר לכל מקום. לצורך המתכון הזה, אנחנו לגרור ולשחרר אותו לספרייה של היישומים ". בשלב זה שתסיים עם קובץ tar.gz ויכול למחוק אותו.
  6. פתח את יישום המסוף, נמצא בדרך כלל תחת 'כלי עזר', ולשנות את ספריית x3dna-v2.1 יצרה בשלב 5 באמצעות הפקודה הבאה (שהסתיים כאן ובכל ההוראות שלהלן על ידי חזרת גררה):
    cd / Applications/x3dna-v2.1
  7. הפעל את התקנת התסריט נחוץ ל3DNA כדי לתפקד כראוי על ידי הקלדה:
    ./bin/x3dna_setup
  8. להעתיק את הגדרות יצוא שתי השורות המודפסות בשלב 7. אם המשתמש הציב את התוכנה בספרייה של היישומים ", שני הקווים אמורים להופיע באופן הבא:
    יצוא X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    יצוא PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
    מילה אחרת מלבד 'יישומים' תהיה appeAR בפקודת היצוא, אם המשתמש בחר להתקין את התוכנה בספרייה אחרת. שם ספרייה חלופית זה יחליף 'יישומים' בשתי הפקודות הנ"ל. שים לב שאם פגז ברירת המחדל הוא 'tcsh' במקום 'מסיבה', את התוכן של שני הקווים יהיה: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 ונתיב setenv / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ נתיב.
  9. הגעה "Finder", כדי לראות אם קובץ בשם ". Bashrc 'כבר קיים במחשב שלך.
  10. פתח את יישום TextEdit מצא בספרייה של היישומים "ובחר" הפוך טקסט רגיל 'תחת תפריט' העיצוב '.
  11. אם הקובץ '. Bashrc' מהשלב 9 קיים, פתח את הקובץ בTextEdit ולהדביק את הגדרות יצוא משלב 8 לסוף הקובץ. אם היציאות של הקבצים לא '. Bashrc', להדביק את הגדרות יצוא משלב 8 לקובץ ריק ולשמור בשם הקובץ ". Bashrc 'בספרייה הביתית שלך. (ספריית הבית הוא כונה על ידי סמל "בית" על מקינטוש).
  12. כדי שההגדרות החדשות ל-Bדואר זמין, עליך להפעיל את הקובץ שנשמר לאחרונה "bashrc." באמצעות הפקודה הבאה בתכנית המסוף:
    מקור ~ /. bashrc
  13. חבילת 3DNA מותקנת עכשיו במערכת שלך ואתה יכול לבצע 2-5 פרוטוקולים במסגרת תכנית המסוף. 6 פרוטוקול מתבצע באמצעות w3DNA, ממשק אינטרנט לתכונות נבחרות של תוכנת 3DNA.

2. ניתוח של מבנה הגבישי

  1. אנו מדגימים את הניתוח של מבנה חומצות גרעין באמצעות DNA חייב חלבון Hbb מBorrelia burgdorferi 8. ניתן למצוא את הקובץ של קואורדינטות אטומיות הקשורות למבנה זה בחלבון נתוני הבנק 13 (PDB; http://www.rcsb.org), אליו היא משויכת 2np2 מזהה המבני. נתונים המשלימים הנלווים כוללים עותק של הקובץ הזה, שניתן למצוא גם בפורום 3DNA בhttp://forum.x3dna.org/jove.
  2. הצעד הראשון בניתוח 3DNA של המבנה הוא היצירה של קובץ שמפרט את כל הבסיסים לזווג. זה נעשה עם תכנית 'find_pair' על ידי הקלדת הטקסט הבאה:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    כאן 2np2.pdb הוא קובץ הקלט של קואורדינטות אטומיות שתוארו לעיל ו2np2.bps הוא קובץ טקסט הפלט המכיל את מידע בסיס השיוך. קובץ בסיס הזוג השני יכול להיבחן ונערך על ידי המשתמש במידת צורך.
  3. השלב הבא בניתוח הוא לקבוע הפרמטרים הגיאומטריים המאפיינים את המבנה. אלה כוללים זוויות סטנדרטיות כימיות פיתול 14, זוויות pseudorotation המתארות את הכיווץ של טבעת סוכר 15, פרמטרים נוקשה-גוף שקבע את ההסדרים של בסיסים וזוגות בסיסים רצופים 16, ואמצעים אחרים של מבנה כימי תלת ממדי. הפקודה "לנתח" לוקח כקלט את קובץ בסיס הזוג שנוצר בשלב 2 ויוצר כמה ouקבצי tput, אשר מופיעים בספריית העבודה הנוכחית. ערכים אלה מחושבים על ידי הקלדת הפקודה הבאה:
    לנתח 2np2.bps
    את קבצי הפלט בשימוש כאן כוללים 2np2.out, המכיל סקירה כללית של פרמטרים שחושבו, וbp_step.par, המכיל רשימה של נוקשה גוף פרמטרים שתוארו לעיל. הקובץ האחרון ניתן לקרוא בקלות לתוך תכנית גיליון אלקטרוני לניתוח נוסף וקשירת קשר. ראה נציג תוצאות (איור 1) לירושלים.

3. בנייתו של מבנה ה-DNA מפרמטרים קשיח-גוף

  1. בנוסף לניתוח של מבנה חומצת גרעין, תוכנת 3DNA מספקת את היכולת לבנות מודל מבני מפרמטרים נוקשי גוף באמצעות הפקודה 'הבנייה מחדש'. בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד לבנות שני דגמי סליל ה-DNA, תוך שימוש בפרמטרים ראשון נוקשה, הגוף המורכב מHbb-DNA כפי שמחושב בפרוטוקול 2 ולאחר מכן באמצעות סט שונה של פרמטרים בwזוויות גלגול נבחרות hich הם השתנו. זווית הגלגול מודדת את מידת כיפוף של זוגות בסיסים רצופים לתוך החריצים של ה-DNA 16. ערכים חיוביים של גליל קשורים ליצרות של החריץ המרכזי וערכים שליליים עם היצרות של החריץ הקטן. הייחוס הסטנדרטי 17 אומץ על ידי תוכנת ניתוח חומצות גרעין פופולרית 3DNA ואחרת, למשל Curves + 18, מבטיח עקביות מספרית בפרמטרים הממוחשבים של זוגות בסיסי ווטסון וקריק.
  2. כברירת מחדל, הפונקציה 'הבנייה מחדש' 3DNA תיצור מודלים אטומיים מדויקים המכילים רק את הקואורדינטות של האטומים בבסיסים החנקניים. על מנת ליצור מודל אטומי משוער, הכולל נקודות ציון מעמוד השדרה והן אטומי בסיס, הקלד את הפקודה הבאה:
    x3dna_utils cp_std bdna
    פקודה זו מורה 3DNA להציג קונפורמציה עמוד השדרה B-DNA סטנדרטי בבניית דגמים מפרמטרים נוקשה-גוף.
  3. כדי בילLD מודל סליל כפול עם הפרמטרים נוקשים-הגופה שנמצאו במבנה Hbb-DNA, הקלד את השורה הבאה:
    לבנות מחדש את אטומי bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    כאן 'אטומית' מציין את הבנייה של מודל כל אטום עם קואורדינטות אטומיות לכל האטומים הכבדים (לא המימן), 'bp_step.par' הוא הקובץ שנוצר בשלב 3 של פרוטוקול 2 אשר מכיל את הפרמטרים נוקשה הגוף הוזנו , ו'2 np2_rbld_org.pdb 'הוא קובץ הפלט עם הקואורדינטות האטומיות של המבנה נוצר. הקובץ האחרון מעוצב בהתאם למפרט של PDB ובכך מסתיים עם '. Pdb'.
  4. ניתן לערוך הקובץ 'bp_step.par' כדי ליצור מבנה שונה. על מקינטוש, ניתן לבצע את השינויים באמצעות יישום TextEdit כפי שמתואר בפרוטוקול שלב 1 10.
  5. כאן אנו לשנות את זוויות הגלגול הקיצוניות שנוצרו בשני האתרים של כיפוף הגדול ביותר. הערכים, שבאים לידי הביטוי במעלות, הם השתנו לאפס מהערכים של 64.95 בקו 17 ו -600.93 בקו 26. אנו שומרים את הקובץ הנוכחי בשם חדש, "bp_step_roll0.par ', ולסגור את תכנית TextEdit.
  6. אנחנו בונים את המבנה, כמו בשלב 3, עם הסט שונה של פרמטרים אחר צעד כקובץ קלט על ידי הקלדה:
    לבנות מחדש את אטומי bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. ניתן לראות את שני דגמים בצופה מולקולרית סטנדרטית, כגון PyMOL (www.pymol.org), תוך שימוש בקבצים שנוצרו (הקואורדינטות. pdb) כקלט. ראה נציג תוצאות (איור 2) לתמונות של המבנים מחדש.

4. ניתוח של קבצי מבנה רב מודל

  1. בניגוד לפרוטוקול 2, שבו אנו מנתחים את מבנה המכיל חומצת גרעין אחת, כאן אנו מראים כיצד לנתח אנסמבל גדול של מבנים. אנו בוחנים את הווריאציה לאורך זמן מהפרמטרים נוקשה הגוף לאורך סדרה של 14 שרשרות דנ"א של זוגות בסיסים המתקבלות מסימולציות 11 מולקולרי דינמיקה (MD) בhttp://forum.x3dna.org/jove.
  2. הצעד הראשון בניתוח הוא זהה לזה שבצע בפרוטוקול 2, זיהוי מהבסיסים לזווג על ידי הפעלת תכנית 'find_pair'. מאז הסט השלם של מניות מבנים אותו בסיס שיוך ערכה אחד צריך לרוץ "find_pair 'רק פעם אחת בקובץ נציג. כאן אנו בוחרים את המבנה 1001 בסימולציה של רשתות ה-DNA המכילים מרכזי בצעד, עם שם קובץ md_AT_set1.pdb.1001. סוגי ההנחיה הבאיםtes מידע בסיס הזיווג ומאחסן אותו בmd_AT_set1.bps הקובץ:
    md_AT_set1.bps md_AT_set1.pdb.1001 find_pair
    המשתמש יכול לבחון את הבסיס זיהה קילוף ולבצע שינויים ידניים בקובץ המבוססים על ידע של המבנה.
  3. השלב הבא הוא לקבוע את הפרמטרים הגיאומטריים של המערכת שלמה של מבנים באמצעות 'x3dna_ensemble לנתח "הפקודה. התכנית משתמשת כקלט את קובץ בסיס הזוג שנוצר בשלב 2 (md_AT_set1.bps), כמו גם קובץ המכיל רשימה של המבנים כדי להיות מנותחים. הקובץ האחרון, שנקרא md_AT_set1.list כאן, כולל את 4,500 קבצים להיות מנותח, עם שמות הקבצים שהוזנו בקווים בודדים בצו שנוצר על ידי הסימולציה MD. עותק של קובץ זה כלול בחומר המשלים והציע גם בפורום 3DNA. המשתמש צריך להיות זהיר, בגלל המספר הגדול של קבצים, שזמן החישוב יכול להיות ארוך (~ 20 דקות ל -1,000 קבצים על מעבד AMD Phenom II X4 965). הפקודת דואר מנוהלת על ידי הקלדת הטקסט הבאה:
    x3dna_ensemble לנתח-B md_AT_set1.bps-L-o md_AT_set1.list md_AT_set1.out
    בדוגמא שלעיל נוגע '-b' לקובץ בסיס זוג שנוצר בשלב 2, '-L' מציין שרשימה של קבצים היא נתון, ו'-o 'מאפשר למשתמש הקצה שם לקובץ הפלט. ישנן אפשרויות רבות שיכולים לשמש בשילוב עם הפקודה 'x3dna_ensemble לנתח ", כגון מבחר של דגמים ספציפיים. המשתמש 'x3dna_ensemble לנתח-H' יכול להקליד כדי לקבל מידע נוסף על אפשרויות אלה.
  4. השלב הבא הוא לחלץ את הפרמטרים נוקשי הגוף הרצוי מקובץ סקירת הפלט, md_AT_set1.out, שנוצר בשלב 3. זו מתבצעת באמצעות הפקודה "תמצית x3dna_ensemble '. ניתן למצוא רשימה של פרמטרים גיאומטריים זמינים על ידי 'x3dna_ensemble תמצית L-' ההקלדה. כאן אנו לחלץ את זוויות הגלגול וליצור קובץ טקסט מופרד בפסיקים (CSV) של זוויות רול עם הפקודה הבאה:
    x3dna_ensemble תמצית-Pרול-S, ו-md_AT_set1.out-o md_AT_set1_roll.csv
    'רול עמ' בפקודה זו מציין את הפרמטר להיעקר, '-S, "מסמל קובץ מופרד באמצעות פסיקים,'-f 'מציין את קובץ הפלט המתקבל מההרכב לנתח פקודה, ו'-O "מאפשר למשתמש שם לקובץ CSV הפלט של זוויות גלגול לאורך ה-DNA בכל המבנים שנותחו. קובץ זה ניתן לקרוא לתוכניות אחרות לניתוח נוסף וקשירת קשר. ראה נציג תוצאות (איור 3) לניתוח של הווריאציה של גליל בשני מערכי נתונים MD שנוצרו שתוארו לעיל ופורום 3DNA לתסריט MATLAB משמש ליצירת תמונות אלה.

5. סופרפוזיציה של מבנים רבים מודל למסגרת התייחסות משותפת

  1. הגרסה העדכנית ביותר של 3DNA (גרסה 2.1) יש תכונה חדשה המאפשרת למשתמש להתבונן במבנים מרובים מנקודת מבט משותפת. הפקודה 'x3dna_ensemble הארגון מחדש של' כופה את אוסף של structur הקשורes על זוג בסיס משותף או צעד בסיס זוג. הפרוטוקול הבא חל ביכולת זו למבני תמ"ג הנגזרות של מפעיל ה-DNA O3 חייב את headpieces של אק repressor החלבון 12. מבנים אלה מאוחסנים בPDB תחת 2kek מזהה בקובץ מבני רב מודל, המכיל את כל דגמי המבנה בקובץ יחיד, בניגוד לקבצים נפרדים כמו אלה שהיו לכל אחד מהדגמים 4500 בפרוטוקול 4. נתונים המשלימים הנלווים כוללים עותק של הקובץ הזה, שניתן למצוא גם בפורום 3DNA בhttp://forum.x3dna.org/jove.
  2. כמו בפרוטוקולים קודמים, הצעד הראשון הוא לחשב את זיווג הבסיס של ה-DNA בתכנית "find_pair '. במקרה זה אנו משתמשים כקלט את קובץ '2 kek.pdb "והקלד את הפקודה הבאה:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    זיווג הבסיס מופק באמצעות המודל הראשון בקובץ PDB. תיקונים ידניים ב outputtedקובץ ASE-זוג, '2 kek.bps ', יכול להתבצע על בסיס ידע של המבנה.
  3. התכנית 'x3dna_ensemble ארגון מחדש של' יהיה ליישר את הדגמים הבודדים במבנה רב מודל במסגרת התייחסות משותפת. תכנית זו מחייבת גם את קובץ PDB וקובץ בסיס זיווג מהשלב הקודם כקלט ולרוץ עם את הפקודה הבאה:
    x3dna_ensemble ארגון מחדש ב-2kek.bps-F-1 דואר 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
    הנה האפשרות '-B' מציינת את קובץ בסיס ההתאמה, 'F-1 "מציין זוג הבסיס שבו כל המבנים מיושרים, במקרה זוג בסיס זה 1 בסוף 5'-של גדיל נושא רצף, '-e' מציין את קובץ אנסמבל הקלט, ו'-o 'מאפשר למשתמש לספק שם קובץ פלט, במקרה זה '2 kek_fr1.pdb'. מידע נוסף על אפשרויות פקודות ניתן להשיג על ידי "ארגון מחדש של x3dna_ensemble-H 'ההקלדה. ראה נציג תוצאות (איור 4) לדיון במבנים המיושרים.

6. Construction של חלבון, מקושט מולקולת הדנ"א

  1. ממשק האינטרנט w3DNA כולל כמה תכונות פופולריות של חבילת תוכנת 3DNA. כאן אנו מפנים את תשומת לב ליכולת לבנות מודלים תלת ממדיים של חלבון ה-DNA, מקושט עם שרת האינטרנט. שברי DNA הכפותים לאמץ את הפרמטרים נוקשה-הגוף של המתחמים-DNA חלבון הנבחרים, כאן הערכים של ה-DNA חייב חלבון Hbb ניתחו בפרוטוקול 2. האזורים מאוגד של DNA יכולים לאמץ אחת משלוש צורות סליל המשתמש שנבחרו (A, B, או C). A, B, ו-C מתייחסים לשלושה דגמים של ה-DNA הקאנוניים, המתקבלים מניסויים עקיפה סיבים מוקדמים, עם בהתאמה 11, 10, ו 9 זוגות בסיסים לתורו של הסליל הכפול 19-21.
  2. הצעד הראשון בבניית חלבון, מקושט מודל ה-DNA הוא לבקר באתר האינטרנט הממוקם בw3DNA http://w3dna.rutgers.edu. בחירה של 'שיקום' מהתפריט בצד השמאל העליון של הדף actiמעודד את יכולות מודל לבנייה באינטרנט.
  3. השלב הבא הוא לבחור בקישור 'תבנית חלבון-DNA Bound "מצא בתיבת קלילות המוצלת באמצע הדף החדש. בחירה זו תפעיל את תפריט הנפתח, המאפשר למשתמש להגדיר את מספר החלבונים מאוגדים. כאן אנו בוחרים שני חלבונים מאוגדים ולחצו על הכפתור 'המשך'. שים לב שדגמים מוגבלים בגודלו ל1,000 זוגות בסיסים, או 2,000 נוקלאוטידים, ושלושים חלבונים מאוגדים.
  4. בחירה של מספר החלבונים המאוגדים מובילה לדף מפרט דומה לזה שמוצג באיור 5. דף זה מאפשר למשתמש להגדיר את רצף ה-DNA, צורת הסליל של ה-DNA לא מאוגד, ואת זהותם ומיקומם של החלבונים הקשורים.
  5. המשתמש המקליד או משחות ברצף הרצוי בתיבת הטקסט באמצע דף המפרט (איור 5, תווית 1). שימו לב שאריות רגילות בלבד - A, T, C, G ו-U - מקובלות. כאן אנחנו נכנסים Hom של בסיס זוג 81opolymer, מורכב כל כולו · T זוגות עם הגדיל בנושא רצף.
  6. יש תפריט הנפתח (איור 5, תווית 2), מתחת לתיבת הטקסט, כדי לבחור את קונפורמציה הסליל של האזורים מאוגד של ה-DNA. בדוגמה זו אנו בוחרים את B-צורת קונפורמציה.
  7. יש תיבת טקסט בחלקו התחתון של דף המפרט כדי להיכנס לעמדה המחייבת (ים) ואת שם קובץ (ים) של החלבון המאוגד (ים) (איור 5, תווית 3). התפקיד מחייב מציין את מיקומו של המרכז של בר החלבון הנכנס ברצף ה-DNA. אם ה-DNA המאוגד מכיל מספר אי זוגי של זוגות בסיסים, כמו במבנה Hbb-DNA, מצב המחייב מציין את מיקומו של בסיס זוג אמצע הקטע. במקרה של ה-DNA Hbb הנכנס, זוג בסיס האמצע הזה הוא T · T mispair. בדוגמה זו, שבו אנו לאגד שני עותקים של חלבון Hbb לתבנית ה-DNA, T · T הזוג ממוקם במיקומי 20 ו -63 של בסיס זוג 81 SE-DNAהגנום. שימו לב שבר הרצף של הכבול לא צריך לחפוף עם שנכנס בשלב 5. אם אזור חלבון בכריכה מכיל מספר זוגי של זוגות בסיסים, העמדה המחייבת מציינת את מיקומו של צעד בסיס הזוג באמצע את ה-DNA. כלומר, צעד בסיס הזוג המרכזי של הבר המאוגד ממוקם בין בסיס זוגות n +1 וn, כאשר n הוא מספר המסוים לאורך הקטע. כמו כן שימו לב למשתמש שיכול לקשט את ה-DNA עם חלבון כלשהו, ​​כל עוד את המבנה המורכב שלה עם ה-DNA ידוע ומאוחסן בפורמט PDB תקן 13.
  8. בחלק התחתון של דף המפרט יש תיבה שמאפשרת למשתמש ליצור תצוגה מקדימה של ה-DNA חלבון בכריכה (איור 5, תווית 4). כאן אנו לבדוק שהתיבה ולחצו על הכפתור 'המשך'. פעולה זו יוצרת דף ביקורת המפרט את הפרמטרים שנבחרו, כמו גם את כל שגיאות שאולי נובעים מהחפיפה של אתרי הקישור הנבחרים. המשתמש יכול seבוחר בי הכפתור "חזור" אם כל שינויים צריכים להתבצע או על הכפתור 'בניית' כדי להמשיך.
  9. הדף הבא מציג תמונה סטטית של ה-DNA מורכב החלבון בהסדר הארוך ביותר שלה ומאפשר להדמיה אינטראקטיבית באופן מקוון באמצעות Jmol וWebmol. המשתמש יכול גם להוריד קובץ (. Pdb) לתאם המעוצב בהתאם למפרט של PDB. הדבר נעשה על ידי בחירה "הורד את הקובץ מחדש pdb" קישור מתחת לתמונה שנוצרה. הקובץ האחרון ניתן לקרוא בקלות לתכנית גרפיקה מולקולרית להדמיה נוספת. ראה נציג תוצאות (איור 6) לדוגמאות של DNA Hbb המעוטר שתוארו לעיל, ושרשרת ארוכה מעט יותר (86 בסיס זוג) עם מרכז Hbb בעמדות 20 ו -67.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כלי תוכנת 3DNA משמשים באופן שגרתי לניתוח מבני חומצות גרעין. לדוגמה, את זהותם של זוגות בסיסים והפרמטרים נוקשים הגוף המאפיינים את ההסדרים של בסיסים שבברי סליל כפול של ה-DNA ומבני RNA מחושבים באופן אוטומטי ונשמרות עבור כל ערך חדש במאגר חומצות גרעין 22, מאגר עולמי של מידע מבני חומצות גרעין. את הערכים של הפרמטרים נוקשה-הגוף שנקבעו בפרוטוקול 2 בקלות לחשוף עיוותים במבנה תלת ממדים, כמו שני האתרים של DNA הקיצוני כיפוף לתוך החריץ הגדול, עם זוויות גלגול חיוביות גדולות (64.95 ° ו60.93 מעלות), מצאו ב AT · בשלבים 13 ו -22 במתחם הגביש עם Borrelia burgdorferi חלבון Hbb 8 (איור 1).

היכולת של התוכנה כדי לבנות מחדש את המבנים מכמויות אלה עם פרוטוקול 3 מאפשרת לקבוע כיצד בבסיס dividual וצעדי בסיס זוג לתרום לקיפול המולקולרי הכולל. כפי שמודגם באיור 2, הכיפוף העולמי של ה-DNA הנגרם על ידי Hbb משקף יותר משתי עיוותי רול הקיצוניות שצוינו לעיל. כלומר, ה-DNA נשאר מאוד עקום כששחזר בצעדים של זוגות בסיסים אלה יישרו, כלומר עם זוויות גלגול null בשני האתרים. באותה הטכניקה חשפה את תרומתם של צעדי בסיס זוג ספציפיים ועיוותים לבריף superhelical של ה-DNA העטוף על פני השטח של חלקיק ליבת הנוקלאוזום 6 ולרוחבו של החריץ הקטן של ה-DNA קשור בעבר לחיידקי nucleoid- קשורים Fis החלבון 23.

היכולת החדשה ב3DNA, שתוארה בפרוטוקול 4, לבחון מספר גדול של מבנים הקשורים מאפשרת לחלץ גם רצף ודפוסי זמן התלויים בסידורים מרחביים של DNA המדומה ומולקולות RNA. לדוגמה, col (צהוב)או קידוד של זוויות רול בין זוגות בסיסים רצופים בשתי קבוצות גדולות של מבני DNA מדומים 11 חושף את הכיפוף מועדף של מולקולות אלה בשלבי בסיס זוג פירימידין-purine (איור 3). הערכים הגבוהים יותר של רול, המתוארים באדום, כי נמשכות לפרקי זמן קצרים בקצות הדנ"א הם רמיזות של היתוך מקומי וreannealing של מבנה הסליל כפול. את דפוסי הווריאציה של פרמטרים נוקשה-אחרים בגוף, כגון זוויות ומרחקים בין בסיסים משלימים, יכולים לעזור לפענח את העיוותים המבניות המדויקות.

היכולת של תוכנת 3DNA, שהוצגה בפרוטוקול 5, לארגון מחדש של מולקולות הקשורות במסגרת התייחסות משותפת, מגלה תכונות של מבנה כולל שהוסתרו ברבים מהקבצים המאוחסנים בPDB. לדוגמה, היישור הקונבנציונלי של מבנים הקשורים על בסיס כושר שורש מרובע הממוצע של האטומים מקבילים מייצר סדרה של מסלולי מרחבית דומים לאכובע בערך להרכיב על עוד אחד, הנה עשרת הדגמים של מפעיל ה-DNA O3 מבוססי NMR חייבים את headpieces של אק repressor החלבון 12 (איור 4 משמאל). סופרפוזיציה של אותם המבנים במסגרת תיאום משותף על בסיס זוג 5'-המסוף של כל דופלקס מגלה עיוותים ניכרות של מבנה הגלובלי, שבו המולקולות להגמיש בכיוונים שונים ניכר (איור 4 מימין). ההשתנות המבנית עשויה להשפיע על הקלות שבה חלבון Escherichia coli אק repressor נקשר O3 וגורם ללולאה בין O3 ומפעילי רצף רחוקים בלאק אופרון 24.

הצעדים המפורטים בפרוטוקול 6, לבניית מודלים של קטעי DNA הארוכים המעוטרים באתרים שרירותיים עם חלבונים וligands אחרים, מוסיף נקודת מבט חדשה על הארגון של מכלולי macromolecular גדולים. מודלים כאלה מסייעים להבין כיצד מתחמים רב המולקולרייםהאינטראקציה במהלך עיבוד ביולוגי. כפי שמודגם באיור 6, את המיקום המדויק של חלבון אדריכלי כמו Hbb יכול להיות השפעה דרמטית על הקיפול הכולל של ה-DNA. אם שני עותקים של המבנה ברזולוציה גבוהה הידוע 8 מופרדים על ידי 43 זוגות בסיסים, קטע DNA-81 בסיס זוג סוגר לתצורה הדוקה, כמעט סגורה. אם שני החלבונים מופרדים על ידי חמישה זוגות בסיסים נוספים, ה-DNA כדלקמן מסלול פתוח, מתפתל. ההסדרים של החלבון, מקושט תכנית דופלקס השונים מאוד איך המרווח של חלבונים אדריכליים יכולים להשפיע cyclization או לולאה של 25-DNA, 26.

איור 1
איור 1. וריאציה של זווית הגלגול בין זוגות בסיסים רצופים (ר 'מסגרת לתיאור ויזואלי) לאורך צ'ה DNA בחייבים חלבון Hbb מBorrelia burgdorferi 8. ערכים שהתקבלו באמצעות הפקודה "לנתח" של 3DNA והנתונים המבניים שתוארו בפרוטוקול 2. שימו לב לערכים הקיצוניים של גליל בAT צעדים שסוגר השלישי של המבנה המרכזי.

איור 2
איור 2. מודלים אטומיים משוערים של ה-DNA נבנה באמצעות הפונקציה "לבנות מחדש" של 3DNA ו שניתנו בPyMOL עם אטומים בצבעים (C-ציאן, N-כחול; O-אדום, P-זהב). מודלים המבוססים על (משמאל) בפרמטרים אחר צעד נוקשה הגוף של חלבון Hbb ו( מימין) סט שונה של פרמטרים שלב, שבו שני הערכים של רול הגדולים כבר מוגדרים כאפס. ראו פרוטוקול 3 להוראות צעד אחרות צעד . שים לב להתפתחות של ה-DNA הנגרם על ידי השינויים שהוטלו בגליל.

יפ-together.within עמודים = "תמיד"> איור 3
איור 3. תמונות פסיפס של זוויות הגלגול לאורך הדנ"א בשתי קבוצות של מבנים מדומים 11. ערכים של רול, המופקים באמצעות פרוטוקול 4, מסומנות בצבעים מכחולים לאדום על פני הטווח [-5 °, 20 °]. שים לב להיפוך סדר של בסיסים וערכים גדולים של גליל, מודגש על ידי עמודות צהובות / אדומים, אשר מתרחשות בשלבי פירימידין-purine בשני רצפי 14 עצמי המשלימים זוג הבסיס.

איור 4
איור 4. תמונות קריקטורה של דגמי ה-DNA שנמצאו במבני תמ"ג הנגזרות של מפעיל ה-DNA O3 עם Lac headpieces חלבוני מדכאי 12 המחשה של היכולותמהתמונות "x3dna_ensemble כיוון מחדש" הפקודה. שניתנו בPyMOL (עמוד השדרה להראות כמו צינורות זהב ובסיסים כמו מקלות כחולים) ומיושרת באמצעות (משמאל) את הקואורדינטות בכניסת PDB (2kek) ו( מימין) סופרפוזיציה המבנית שהוצגה בפרוטוקול 5 . שימו לב להבדלים הגדולים בין המבנים כאשר הניח במסגרת התייחסות משותפת על בסיס זוג 5'-המסוף.

איור 5
איור 5. צילום מסך מהשרת האינטרנט w3DNA מפרטים הממחישים של רצף ה-DNA (תווית 1), צורת הסליל של ה-DNA לא מאוגד (תווית 2), העמדות וזהויות של חלבונים (תווית 3), ואת תיבת סימון התצוגה מקדימה (תווית 4) מתואר בפרוטוקול 6. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 6
איור 6. מודלים משוערים אטומיים של שני חלבוני HBB 8 מאוגדים קטע DNA ארוך. מבנים שנוצרו עם שרת האינטרנט w3DNA כפי שמתואר בפרוטוקול 6 ו שניתנו בPyMOL. את שרשרות החלבון הן תכנית כסרטים סגולים ואילו את ה-DNA היא בצבע מקודד על ידי אטום סוג (C-ציאן, N-כחול; O-אדום, P-זהב). זוג הבסיס המרכזי של כל חלבון מחייבים אתרים מוגדר בעמדות (משמאל) 20 ו -62 לאורך שרשרת ה-DNA בסיס זוג 81 ו( מימין) 20 ו -67 לאורך שרשרת ה-DNA בסיס הזוג 86. שים לב לשינוי המשמעותי בקיפול של המבנים הקשורים לעקירה (חמישה בסיס זוג) המוגברת של שני החלבונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקבוצה של פרוטוקולים שהוצגו במאמר זה נגע רק על היכולות של חבילת 3DNA של תוכניות. ניתן ליישם את הכלים RNA מבנים לזהות זוגות בסיסים שאינם קנוניים, על מנת לקבוע את ההקשרים המבניים משניים שבזיווג כזה מתרחש, לכמת את הנטייה שברי מרחבי של סליל, כדי למדוד את החפיפה של בסיסים לאורך עמוד השדרה השרשרת, וכו ' הפקודה מאפשרת למשתמש לבנות מחדש לבנות ייצוגים לחסום פשוטים ואינפורמטיבי של הבסיסים וזוגות בסיסים כמו שמוצג בהבלעה באיור 1. הכלים לבנייה כוללים גם תכונות לרצפים שונים "חוט" על תבנית מבנית נתון, כדי ליצור מודלים של מבני הדנ"א כפול, משולש, וארבע תקועים רבים, לדגמים לכוון בכיוון מסוים, ולבסוף, יש עוד 3DNA שיחק תפקיד משמעותי במספר פרויקטים אחרים, כגון: שירות SWS solvation האינטרנט עבור חומצות גרעין 27; שרת האינטרנט לאמנותיישור RNA מבני יישונים 28; כלי MDDNA מבוסס אינטרנט לניתוח התוצאות של דינאמיקה מולקולארית וחיזוי מבנה 29; שיטת עגינה חלבון ה-DNA החמור ים המידע מונחה 30; שרת שרה ליאור פונקציה של RNA מבנים 31; 3D- שרת DART-DNA מבנה דוגמנות 32; מסד הנתונים 3D-טביעת הרגל לניתוח מבנים של קומפלקסים-DNA חלבון 33; מסד 2.0 FRABASE RNA לזיהוי שברים תלת ממדיים בתוך מבני RNA 34; ושרת האינטרנט סטר להשוואת pairwise של RNA מבנים 35. למיטב ידיעתנו, אין כיום חבילת תוכנת מבנה חומצת גרעין אחרת עם שילוב רחב של תכונות והשוואת שיא ביצועים חזקים של 3DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה לŠponer Jiří לשיתוף הקואורדינטות של סלילים כפולים דנ"א שנוצרו בהדמיות של דינאמיקה מולקולארית. כמו כן, אנו מכירים בנדא Spackova לסיוע בהורדת מבנים אלה. תמיכה בעבודה זו באמצעות מענקי מחקר USPHS GM34809 וGM096889 הוא הודה בהכרת תודה.

References

  1. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic acid structures. Nucleic Acids Res. 31, 5108-5121 (2003).
  2. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a versatile, integrated software system for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nature Protocols. 3, 1213-1227 (2008).
  3. Zheng, G., Lu, X. -J., Olson, W. K. Web 3DNA-a web server for the analysis, reconstruction, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nucleic Acids. Res. 37, W240-W246 (2009).
  4. Xin, Y., Olson, W. K. BPS: a database of RNA base-pair structures. Nucleic Acids Res. 37, D83-D88 (2009).
  5. Zheng, G., Colasanti, A. V., Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNALandscapes: a database for exploring the conformational features of DNA. Nucleic Acids Res. 38, 267-274 (2010).
  6. Tolstorukov, M. Y., Colasanti, A. V., McCandlish, D., Olson, W. K., Zhurkin, V. B. A novel 'roll-and-slide' mechanism of DNA folding in chromatin. Implications for nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 371, 725-738 (2007).
  7. Lu, X. -J., Olson, W. K., Bussemaker, H. J. The RNA backbone plays a crucial role in mediating the intrinsic stability of the GpU dinucleotide platform and the GpUpA/GpA miniduplex. Nucleic Acids Res. 38, 4868-4876 (2010).
  8. Mouw, K. W., Rice, P. A. Shaping the Borrelia burgdorferi genome: crystal structure and binding properties of the DNA-bending protein Hbb. Mol. Microbiol. 63, 1319-1339 (2007).
  9. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J. P. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis? Science. 216, 1317-1319 (1982).
  10. Benach, J. L., Bosler, E. M., Hanrahan, J. P., Coleman, J. L., Habicht, G. S., Bast, T. F., Cameron, D. J., Ziegler, J. L., Barbour, A. G. Spirochetes isolated from the blood of two patients with Lyme disease. N. Engl. J. Med. 308, 740-742 (1983).
  11. Lankaš, F., Špačková, N., Moakher, M., Enkhbayar, P., Šponer, J. A measure of bending in nucleic acids structures applied to A-tract DNA. Nucleic Acids Res. 38, 3414-3422 (2010).
  12. Romanuka, J., Folkers, G. E., Biris, N., Tishchenko, E., Wienk, H., Bonvin, A. M. J. J., Kaptein, R., Boelens, R. Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes. J. Mol. Biol. 390, 478-489 (2009).
  13. Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Weissig, H., Shindyalov, I. N., Bourne, P. E. The Protein Data Bank. Nucleic Acids. Res. 28, 235-242 (2000).
  14. Joint, I. U. P. A. C. -I. U. B. Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Eur. J. Biochem. 131, 9-15 (1983).
  15. Altona, C., Sundaralingam, M. Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides. A new description using the concept of pseudorotation. J. Am. Chem. Soc. 94, 8205-8212 (1972).
  16. Dickerson, R. E., Bansal, M., Calladine, C. R., Diekmann, S., Hunter, W. N., Kennard, O., von Kitzing, E., Lavery, R., Nelson, H. C. M., Olson, W. K., et al. Definitions and nomenclature of nucleic acid structure parameters. J. Mol. Biol. 205, 787-791 (1989).
  17. Olson, W. K., Bansal, M., Burley, S. K., Dickerson, R. E., Gerstein, M., Harvey, S. C., Heinemann, U., Lu, X. -J., Neidle, S., Shakked, Z., et al. A standard reference frame for the description of nucleic acid base-pair geometry. J. Mol. Biol. 313, 229-237 (2001).
  18. Lavery, R., Moakher, M., Maddocks, J. H., Petkeviciute, D., Zakrzewska, K. Conformational analysis of nucleic acids revisited: Curves+. Nucleic Acids Res. 37, 5917-5929 (2009).
  19. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  20. Watson, J. D., Crick, F. H. C. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
  21. Marvin, D. A., Spencer, M., Wilkins, M. H. F., Hamilton, L. D. A new configuration of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, 387-388 (1958).
  22. Berman, H. M., Olson, W. K., Beveridge, D. L., Westbrook, J., Gelbin, A., Demeny, T., Hsieh, S. -H., Srinivasan, A. R., Schneider, B. The Nucleic Acid Database: a comprehensive relational database of three-dimensional structures of nucleic acids. Biophys. J. 63, 751-759 (1992).
  23. Stella, S., Cascio, D., Johnson, R. C. The shape of the DNA minor groove directs binding by the DNA-bending protein Fis. Genes Dev. 24, 814-826 (2010).
  24. Swigon, D., Coleman, B. D., Olson, W. K. Modeling the Lac repressor-operator assembly: the influence of DNA looping on Lac repressor conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 9879-9884 (2006).
  25. Czapla, L., Swigon, D., Olson, W. K. Effects of the nucleoid protein HU on the structure, flexibility, and ring-closure properties of DNA deduced from Monte-Carlo simulations. J. Mol. Biol. 382, 353-370 (2008).
  26. Czapla, L., Peters, J. P., Rueter, E. M., Olson, W. K., Maher, L. J. 3rd Understanding apparent DNA flexibility enhancement by HU and HMGB proteins: experiment and simulation. J. Mol. Biol. 409, 278-289 (2011).
  27. Auffinger, P., Hashem, Y. SwS: a solvation web service for nucleic acids. Bioinformatics. 23, 1035-1037 (2007).
  28. Dror, O., Nussinov, R., Wolfson, H. J. The ARTS web server for aligning RNA tertiary structures. Nucleic Acids Res. 34, 412-415 (2006).
  29. Dixit, S. B., Beveridge, D. L. Structural bioinformatics of DNA: a web-based tool for the analysis of molecular dynamics results and structure prediction. Bioinformatics. 22, 1007-1009 (2006).
  30. de Vries, S. J., van Dijk, M., Bonvin, A. M. The HADDOCK web server for data-driven biomolecular docking. Nat. Protoc. 5, 883-897 (2010).
  31. Capriotti, E., Marti-Renom, M. A. SARA: a server for function annotation of RNA structures. Nucleic Acids Res. 37, 260-265 (2009).
  32. van Dijk, M., Bonvin, A. M. 3D-DART: a DNA structure modelling server. Nucleic Acids Res. 37, W235-W239 (2009).
  33. Contreras-Moreira, B. 3D-footprint: a database for the structural analysis of protein-DNA complexes. Nucleic Acids Res. 38, D91-D97 (2010).
  34. Popenda, M., Szachniuk, M., Blazewicz, M., Wasik, S., Burke, E. K., Blazewicz, J., Adamiak, R. W. RNA FRABASE 2.0: an advanced web-accessible database with the capacity to search the three-dimensional fragments within RNA structures. BMC Bioinformatics. 11, 231 (2010).
  35. Čech, P., Svozil, D., Hoksza, D. SETTER: web server for RNA structure comparison. Nucleic Acids Res. (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics