Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

Biology

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Summary

El paquete de software 3DNA es un popular y versátil herramienta bioinformática con capacidades para analizar, construir y visualizar estructuras de ácidos nucleicos tridimensionales. En este artículo se presenta protocolos detallados para un subconjunto de nuevas y populares características disponibles en 3DNA, aplicables tanto a las estructuras individuales y conjuntos de estructuras relacionadas.

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Colasanti, A. V., Lu, X. J., Olson, W. K. Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA. J. Vis. Exp. (74), e4401, doi:10.3791/4401 (2013).

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Abstract

El paquete de software 3DNA es un popular y versátil herramienta bioinformática con capacidades para analizar, construir y visualizar estructuras de ácidos nucleicos tridimensionales. En este artículo se presenta protocolos detallados para un subconjunto de nuevas y populares características disponibles en 3DNA, aplicables tanto a las estructuras individuales y conjuntos de estructuras relacionadas. Protocolo 1 muestra el conjunto de instrucciones necesarias para descargar e instalar el software. Esto es seguido, en el Protocolo 2, por el análisis de la estructura del ácido nucleico, incluyendo la asignación de pares de bases y la determinación de los parámetros de cuerpo rígido que describen la estructura y, en el Protocolo 3, por una descripción de la reconstrucción de un atómica modelo de una estructura de sus parámetros de cuerpo rígido. La versión más reciente de 3DNA, versión 2.1, tiene nuevas características para el análisis y la manipulación de los conjuntos de estructuras, tales como los deducidos a partir de mediciones de resonancia magnética nuclear (RMN) y de dinámica molecular (MDSimulaciones); estas características se presentan en los Protocolos 4 y 5. Además del paquete de software independiente 3DNA, el servidor web w3DNA, ubicado en http://w3dna.rutgers.edu , proporciona una interfaz fácil de usar para las funciones seleccionadas del software. Protocolo 6 demuestra una nueva característica del sitio para la construcción de modelos de moléculas de ADN largos decorados con proteínas unidas en lugares especificados por el usuario.

Introduction

La comprensión de las estructuras tridimensionales de ADN, ARN, y sus complejos con proteínas, fármacos y otros ligandos, es crucial para descifrar sus diversas funciones biológicas, y para permitir que el diseño racional de la terapéutica. La exploración de este tipo de estructuras, implica tres componentes separados pero estrechamente relacionados: el análisis (para extraer patrones en formas e interacciones), modelos (para evaluar la energética y las dinámicas moleculares), y la visualización. Análisis estructural y la construcción de modelos son esencialmente dos caras de la misma moneda, y la visualización de complementos de ambos.

La suite 3DNA de programas de ordenador es un cada vez más popular juego de herramientas de bioinformática estructural con capacidades para analizar, construir y visualizar estructuras de ácidos nucleicos tridimensionales. Publicaciones anteriores describen las capacidades del software 1, siempre y recetas para llevar a cabo las tareas seleccionadas 2, introducido la interfaz basada en weba las características populares del software 3, se presentan las bases de datos de características estructurales obtenidos mediante 3DNA 4, 5 y se ilustra la utilidad del software en el análisis de ADN y ARN estructuras 6, 7.

El objetivo de este artículo es traer el kit de software 3DNA a los científicos de laboratorio y otras personas con intereses y / o necesidades para investigar el ADN y el ARN organización espacial con herramientas computacionales estado-of-the-art. Los protocolos presentados aquí incluyen instrucciones paso a paso (i) para descargar e instalar el software en un sistema Mac OS X, (ii-iii) para analizar y modificar las estructuras de ADN a nivel de los pasos de pares de bases que constituyen, ( iv-v) analizar y alinear conjuntos de estructuras de ADN relacionadas, y (vi) para la construcción de modelos de cadenas de ADN en proteínas condecorados con la interfaz web fácil de usar w3DNA. El software tiene la capacidad de analizar las estructuras individuales resolverse utilizando métodos cristalográficos de rayos X, así como granconjuntos de estructuras determinadas con métodos de resonancia magnética nuclear (RMN) o generados por técnicas de simulación por ordenador.

Las estructuras examinadas aquí incluyen (i) la estructura de cristal de alta resolución de ADN unido a la proteína de Borrelia burgdorferi Hbb 8 (la bacteria transmitida por garrapatas que causa la enfermedad de Lyme en seres humanos 9, 10), (ii) dos grandes conjuntos de forma secuencial moléculas de ADN relacionados, producidos con simulaciones moleculares 11 - 4500 instantáneas de d (GGCAAAATTTTGCC) 2 y d (CCGTTTTAAAACGG) 2 recogida en incrementos de 100-PSEC durante los cálculos, y (iii) un pequeño conjunto de estructuras basados ​​en RMN del operador de ADN O3 unido a los cascos de la coli proteína represora Lac Escherichia 12. Las instrucciones incluyen información sobre cómo acceder a los archivos de coordenadas atómicas asociadas con cada una de estas estructuras, así como el uso de 3DNA (se encuentra una copia de este archivoen el foro 3DNA en http://forum.x3dna.org/jove ) para examinar y modificar estas estructuras.

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Protocol

1. Instalación del paquete de software

  1. Conéctate a la página web 3DNA en http://x3dna.org y haga clic en el vínculo para el Foro 3DNA. En el Foro seleccione el enlace "Registro" y siga las instrucciones para crear una nueva cuenta.
  2. Las instrucciones de instalación detalle del software en un ordenador Macintosh OS X basado en shell 'bash' por defecto. El procedimiento para sistemas Linux o Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) con proyectiles utilizados (incluyendo "tcsh") se encuentra en el Foro 3DNA.
  3. Una vez que haya establecido un nombre de usuario y contraseña, entrar en el foro. Seleccione el vínculo "Descargas" en la sección de bienvenida y en la nueva página selecciona '3 DNA descarga. Esto le llevará a la página de descarga 3DNA en varias versiones del software se pueden descargar.
  4. Seleccione el enlace de Mac OS X Intel para descargar un archivo tarball (tar.gz) que contiene el software.
  5. Doble click en el archivo (tar.gz) para crear una carpeta con el nombre x3dna-v2.1. Esta carpeta, que contiene el paquete de software 3DNA, se puede mover a cualquier ubicación. A los efectos de esta receta, que arrastrarlo hacia el directorio 'Applications'. En esta etapa haya terminado con el archivo tar.gz y puede eliminarlo.
  6. Abre la aplicación Terminal, que se encuentran normalmente en "Utilidades" y cambie al directorio x3dna-v2.1 creado en el paso 5 con el siguiente comando (finalizado el aquí y en todas las instrucciones de abajo por un retorno de carro):
    cd / Applications/x3dna-v2.1
  7. Ejecute el script de configuración necesaria para 3DNA para funcionar correctamente tecleando:
    ./bin/x3dna_setup
  8. Copiar los ajustes de exportación de dos líneas impresas en el paso 7. Si el usuario ha colocado el software en el directorio 'Applications', las dos líneas deben aparecer de la siguiente manera:
    exportación X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    exportar PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
    Una palabra diferente, además de "Aplicaciones" se APPEar en el comando de exportación si el usuario ha optado por instalar el software en un directorio diferente. Este nombre de directorio alternativo reemplazará a 'Aplicaciones' en los dos comandos anteriores. Tenga en cuenta que si el shell por defecto es "tcsh 'en vez de' bash ', el contenido de las dos líneas sería: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 y setenv CAMINO / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
  9. Llegada 'Buscador' para ver si un archivo llamado '. Bashrc' ya existe en el equipo.
  10. Abra la aplicación TextEdit se encuentra en el directorio 'Aplicaciones' y seleccione "Convertir en texto normal 'en el menú' Formato '.
  11. Si existe el archivo '. Bashrc' desde el paso 9, abra el archivo en TextEdit y pegar los ajustes de exportación a partir del paso 8 al final del archivo. Si no '. Bashrc' archivo salidas, pegar los ajustes de exportación del paso 8 en un archivo en blanco y guárdelo con el nombre de archivo '. Bashrc' en su directorio personal. (El directorio principal se indica mediante un icono de la "casa" en el Macintosh.)
  12. Para que la nueva configuración a be disponible, debe ejecutar el archivo 'bashrc.' recién guardado mediante el siguiente comando en el programa de terminal:
    source ~ /. bashrc
  13. La suite 3DNA ya está instalado en su sistema y se puede llevar a cabo protocolos de 2-5 dentro del programa Terminal. Protocolo 6 se realiza mediante w3DNA, una interfaz web con las características seleccionadas del software 3DNA.

2. Análisis de una estructura de cristal

  1. Se ilustra el análisis de la estructura del ácido nucleico utilizando el ADN unido a la proteína de Borrelia burgdorferi Hbb 8. El archivo de coordenadas atómicas asociadas con esta estructura se puede encontrar en el Banco de Datos de Proteínas 13 (AP; http://www.rcsb.org ), donde se le asigna el identificador 2np2 estructural. Los acompañan los datos adicionales incluyen una copia de este archivo, que también se puede encontrar en el Foro 3DNA en http://forum.x3dna.org/jove.
  2. El primer paso en el análisis 3DNA de la estructura es la creación de un fichero que lista todos los pares de bases. Esto se realiza con el programa 'find_pair' escribiendo lo siguiente:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    Aquí 2np2.pdb es el archivo de entrada de las coordenadas atómicas descritas anteriormente y 2np2.bps es el archivo de texto de salida que contiene la información de apareamiento de bases. El archivo de base de par último puede ser examinado y editado por el usuario si fuera necesario.
  3. El siguiente paso en el análisis es determinar los parámetros geométricos que caracterizan la estructura. Estos incluyen ángulos de torsión químicos estándar 14, ángulos pseudorotation que describen el fruncimiento del anillo de azúcar 15, los parámetros de cuerpo rígido que especifican las modalidades de bases y pares de bases sucesivos 16, y otras medidas de estructura química tridimensional. El comando 'analizar' toma como entrada el archivo de base de par generado en el paso 2 y crea varios ouarchivos tput, que aparecen en el directorio de trabajo actual. Estos valores se calculan mediante el comando siguiente:
    analizar 2np2.bps
    Los archivos de salida se utilizan aquí incluyen 2np2.out, que contiene un resumen de los parámetros calculados y bp_step.par, que contiene una lista del cuerpo rígido parámetros descritos anteriormente. El último fichero puede ser leído fácilmente en un programa de hoja de cálculo para su posterior análisis y el trazado. Ver resultados representativos (Figura 1) para obtener un ejemplo.

3. La construcción de una estructura de ADN a partir de los parámetros de cuerpo rígido

  1. Además del análisis de una estructura de ácido nucleico, el software 3DNA proporciona la capacidad de construir un modelo estructural de los parámetros de cuerpo rígido usando el comando 'reconstrucción'. En este Protocolo se muestra cómo construir dos modelos helicoidales de ADN, primero con los parámetros de cuerpo rígido del complejo Hbb-DNA como se calcula en el Protocolo 2, y luego con un conjunto modificado de parámetros which ángulos de balanceo seleccionados se cambian. El ángulo de balanceo mide el grado de flexión de pares de bases sucesivas en las ranuras de la ADN 16. Los valores positivos de rodillo están asociados con el estrechamiento del surco mayor y los valores negativos con el estrechamiento de la surco menor. El marco de referencia estándar 17 aprobada por el software de análisis de ácidos nucleicos populares 3DNA y otras, por ejemplo las curvas + 18, asegura la consistencia numérica de los parámetros calculados de pares de bases de Watson-Crick.
  2. De forma predeterminada, la función 3DNA 'Reconstrucción' creará modelos atómicos exactos que sólo contienen las coordenadas de los átomos en las bases nitrogenadas. Con el fin de crear un modelo atómico aproximado, que incluye las coordenadas de los dos átomos de columna vertebral y de base, escriba el siguiente comando:
    x3dna_utils cp_std bADN
    Este comando indica 3DNA para introducir una conformación de columna-B de ADN estándar en la construcción de modelos a partir de los parámetros de cuerpo rígido.
  3. Para build un modelo de doble hélice con los parámetros de cuerpo rígido que se encuentran en la estructura Hbb-DNA, escriba lo siguiente:
    reconstruir-atómico bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    Aquí-atómico 'especifica la construcción de un modelo todo-átomo con las coordenadas atómicas de todos los átomos pesados ​​(que no son hidrógeno),' bp_step.par 'es el archivo generado en el paso 3 del Protocolo n º 2, que contiene los parámetros de cuerpo rígido introducidos y '2 np2_rbld_org.pdb 'es el archivo de salida con las coordenadas atómicas de la estructura creada. Este último archivo tiene el formato de acuerdo con las especificaciones de la AP y por lo tanto termina con ". Pdb '.
  4. El archivo 'bp_step.par' se puede editar para generar una estructura modificada. En un Macintosh, los cambios se pueden realizar mediante la aplicación de edición de textos tal como se describe en el Protocolo 1 Paso 10.
  5. Aquí modificamos los ángulos de balanceo extremos formados en los dos sitios de mayor flexión. Los valores, que se expresan en grados, se cambian a cero de los valores de 64,95 en la línea 17 y 600,93 en la línea 26. Guardamos el archivo modificado con un nuevo nombre, 'bp_step_roll0.par', y cerramos el programa de edición de textos.
  6. Construimos la estructura, como en el paso 3, con el conjunto de modificaciones de los parámetros de paso que el de entrada, escribiendo:
    reconstruir-atómico bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. Los dos modelos se pueden ver en un visor molecular estándar, como PyMOL ( www.pymol.org ), utilizando los archivos de coordenadas generadas (. pdb) como entrada. Ver resultados representativos (Figura 2) para las imágenes de las estructuras reconstruidas.

4. Análisis de los archivos de estructura multi-modelo

  1. En contraste con el Protocolo 2, en el que se analiza una sola estructura de ácido nucleico que contiene, aquí se muestra cómo analizar un gran conjunto de estructuras. Examinamos la variación en el tiempo de los parámetros de cuerpo rígido a lo largo de una serie de 14 pares de base de las cadenas de ADN obtenido a partir de dinámica molecular (MD) simulaciones 11 http://forum.x3dna.org/jove .
  2. El primer paso en el análisis es el mismo que el realizado en el Protocolo 2, la identificación de los pares de bases mediante la ejecución del programa de 'find_pair'. Dado que todo el conjunto de estructuras comparte el mismo esquema de apareamiento de bases uno necesita para funcionar 'find_pair' sólo una vez en un archivo de representante. Aquí elegimos la estructura 1001a en la simulación de las cadenas de ADN que contienen una central de paso, con el nombre de archivo md_AT_set1.pdb.1001. La siguiente instrucción génerosTes la información de apareamiento de bases y la almacena en los md_AT_set1.bps archivo:
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    El usuario puede examinar la base identificada pelar y hacer cambios manuales en el archivo basándose en el conocimiento de la estructura.
  3. El siguiente paso es determinar los parámetros geométricos de todo el conjunto de estructuras utilizando el 'x3dna_ensemble analizar' comando. El programa utiliza como entrada el archivo de base de par generado en el Paso 2 (md_AT_set1.bps), así como un archivo que contiene una lista de las estructuras a ser analizados. Este último archivo, aquí se llama md_AT_set1.list, contiene los archivos de 4500 a analizar, con los nombres de los archivos en sus propias líneas individuales en el orden generada por la simulación MD. Una copia de este archivo se incluye en el material complementario y también se ofreció en el Foro 3DNA. El usuario debe ser advertido, debido a la gran cantidad de archivos, que el tiempo de cálculo puede ser largo (~ 20 min por cada 1.000 archivos en un procesador AMD Phenom II X4 965). Thcomandos e se ejecuta escribiendo lo siguiente:
    x3dna_ensemble analizar md_AT_set1.bps-b-l-o md_AT_set1.list md_AT_set1.out
    En el ejemplo anterior '-b' se refiere al archivo de base-pair creado en el paso 2, '-l' especifica que se da una lista de archivos, y '-o' permite al usuario asignar un nombre al archivo de salida. Hay muchas opciones que se pueden utilizar en combinación con el comando 'x3dna_ensemble analizar', como la selección de los modelos específicos. El usuario puede escribir 'x3dna_ensemble analizar-h' para obtener más información sobre estas opciones.
  4. El siguiente paso consiste en extraer los parámetros de cuerpo rígido deseados desde el archivo de salida visión general, md_AT_set1.out, generado en el paso 3. Esto se realiza mediante el comando 'extracto x3dna_ensemble'. Un listado de los parámetros geométricos disponibles se puede encontrar tecleando 'x3dna_ensemble extracto-l'. Aquí extraemos los ángulos de balanceo y crear un archivo de texto separado por comas (CSV) de los ángulos de balanceo con el siguiente comando:
    x3dna_ensemble extracto de p-roll-s,-f md_AT_set1.out-o md_AT_set1_roll.csv
    El roll-p "en este comando especifica el parámetro a extraer, la"-s ", significa un archivo separado por comas, el '-f' indica el archivo de salida obtenido del conjunto de comandos analizar, y el"-o 'permite al usuario nombrar el archivo de salida CSV de ángulos de balanceo a lo largo del ADN en todas las estructuras analizadas. Este archivo se puede leer en otros programas para su posterior análisis y trazado. Ver resultados representativos (Figura 3) para el análisis de la variación de rollo en los dos conjuntos de datos MD generados anteriormente descritos y el Foro 3DNA para el script MATLAB utilizado para generar estas imágenes.

5. Superposición de estructuras de varios modelos en un marco de referencia común

  1. La versión más reciente de 3DNA (versión 2.1) tiene una nueva característica que permite al usuario buscar en múltiples estructuras desde una perspectiva común. El comando 'x3dna_ensemble reorientar' superpone una colección de estructuración relacionadoses en un par de base común o paso de pares de bases. El siguiente protocolo se aplica esta capacidad a las estructuras de RMN-derivados del operador O3 ADN unido a las piezas de cabeza de la proteína de represor Lac 12. Estas estructuras se almacenan en el AP en la 2kek identificador en un archivo estructural multi-modelo, que contiene todos los modelos de estructura en un único archivo, en contraposición a los archivos separados como los que se utilizan para cada uno de los modelos de 4500 en Protocolo 4. Los acompañan los datos adicionales incluyen una copia de este archivo, que también se puede encontrar en el Foro 3DNA en http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Al igual que en los protocolos anteriores, el primer paso es calcular el apareamiento de bases del ADN con el programa de la 'find_pair'. En este caso se utiliza como entrada el fichero '2 kek.pdb 'y escriba lo siguiente:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    La base de sincronización se genera con el primer modelo en el archivo pdb. Correcciones manuales del b outputtedarchivo ase-pair, '2 'kek.bps, puede hacerse con base en el conocimiento de la estructura.
  3. El programa 'x3dna_ensemble reorientar' se alinearán los modelos individuales en una estructura de múltiples modelo en un marco de referencia común. Este programa requiere que tanto el archivo pdb y el archivo de pares de bases del paso anterior como entrada y se ejecuta con el siguiente comando:
    x3dna_ensemble reorientar-b 2kek.bps-f 1-e 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
    Aquí la opción '-b' especifica el archivo de apareamiento de bases, la '-f 1' denota el par de bases en la que están alineadas todas las estructuras, en este caso el par de bases 1 en el extremo 5 'de la hebra secuencia-cojinete, la '-e' especifica el archivo de conjunto de entrada, y la '-o' permite que el usuario proporcione un nombre de archivo de salida, en este caso kek_fr1.pdb '2 '. Más información sobre opciones de comando se puede obtener escribiendo 'x3dna_ensemble reorientar-h'. Ver resultados representativos (Figura 4) para la discusión de las estructuras alineadas.

6. Construcción de una proteína-decorada molécula de ADN

  1. La interfaz web w3DNA incluye algunas de las características populares del software 3DNA. Aquí llamamos la atención sobre la capacidad para construir modelos tridimensionales de proteína-ADN decorada con el servidor web. Los fragmentos de ADN unidas adoptan los parámetros de cuerpo rígido de los complejos de proteínas de ADN seleccionados, en este caso los valores del ADN unido a la proteína Hbb analizado en el Protocolo 2. Las regiones no unidas de ADN pueden adoptar una de tres formas helicoidales seleccionadas por el usuario (A, B, o C). El A, B, y C se refieren a tres modelos canónicos de ADN, obtenidos a partir de los primeros experimentos de difracción de fibra, con, respectivamente, 11, 10, y 9 pares de bases por vuelta de la doble hélice 19-21.
  2. El primer paso en la construcción de un decorado proteína modelo de ADN es visitar la página web w3DNA ubicado en http://w3dna.rutgers.edu . La selección de "reconstrucción" en el menú en la parte superior izquierda de la página actiVates las capacidades de construcción de modelos en línea.
  3. El siguiente paso es seleccionar el enlace 'plantilla proteína-DNA Bound' que se encuentra en la caja ligera sombra en medio de la nueva página. Esta selección se activará un menú desplegable, que permite al usuario especificar el número de proteínas unidas. Hemos destacado dos proteínas unidas y hacemos clic en el botón "Continuar". Tenga en cuenta que los modelos están limitados en tamaño a 1.000 pares de bases, o 2000 nucleótidos, y treinta proteínas enlazadas.
  4. La selección de la cantidad de proteínas unidas conduce a una página de especificación similar a la mostrada en la Figura 5. Esta página permite al usuario especificar la secuencia de ADN, la forma helicoidal del ADN no unido, y la identidad y la ubicación de las proteínas unidas.
  5. El usuario o pastas en la secuencia deseada en el cuadro de texto en el medio de la página de especificaciones (Figura 5, Label 1). Tenga en cuenta únicamente los residuos estándar - A, T, C, G y U - se aceptan. Aquí entramos en un 81 hom pares de basesopolymer, compuesto en su totalidad de los pares A · T con la A de la secuencia de la hebra de soporte.
  6. Hay un menú desplegable (Figura 5, Etiqueta 2), por debajo del cuadro de texto para seleccionar la conformación helicoidal de las regiones no unidas de ADN. En este ejemplo hemos elegido la forma B conformación.
  7. Hay un cuadro de texto en la parte inferior de la página de especificaciones para entrar en la posición de encuadernado (s) y nombre de archivo (s) de la proteína unida (s) (Figura 5, Etiqueta 3). La posición de enlace especifica la ubicación del centro del fragmento unido a proteínas en la secuencia de ADN. Si el ADN unido contiene un número impar de pares de bases, como en la estructura Hbb-ADN, la posición de unión indica la localización de la base de par medio del fragmento. En el caso de ADN Hbb-enlazado, esta base es un medio par T · T mispair. En este ejemplo, donde nos atamos a dos copias de la proteína Hbb a la plantilla de ADN, la T · T par se coloca en las posiciones 20 y 63 de los 81 pares de bases de ADN SEcuencia. Tenga en cuenta que la secuencia del fragmento de la envolvente no tiene que coincidir con que entró en el Paso 5. Si la región unida a proteínas contiene un número par de pares de bases, la posición de unión indica la localización de la etapa de pares de bases del medio en el ADN. Es decir, se coloca el paso de pares de bases del fragmento central de la envolvente entre los pares de bases n y n +1, donde n es el número especificado a lo largo del segmento. También tenga en cuenta que el usuario puede decorar el ADN con cualquier proteína, siempre que la estructura de su complejo con ADN se conoce y se almacena en formato PDB estándar 13.
  8. En la parte inferior de la página de especificaciones hay una casilla que permite al usuario generar una vista previa de la DNA a proteínas (Figura 5, Etiqueta 4). Aquí comprobamos que el cuadro y haga clic en el botón "Continuar". Esta acción genera una página de revisión de una lista de los parámetros seleccionados, así como los errores que se puedan haber surgido a partir de la superposición de los sitios de unión seleccionados. El usuario puede en sínar el botón "Atrás" si los cambios tienen que ser en el botón 'Build' para proceder hecho o.
  9. La siguiente página muestra una imagen estática del complejo ADN-proteína en su disposición más extendida y permite on-line a través de la visualización interactiva Jmol y Webmol. El usuario también puede descargar un archivo de coordenadas (. Pdb) que tiene el formato de acuerdo con las especificaciones de la AP. Esto se realiza mediante la selección de la "Descargar el archivo pdb reconstruida" eslabón debajo de la imagen generada. El último fichero puede ser leído fácilmente en un programa de gráficos moleculares para su posterior visualización. Ver resultados representativos (Figura 6) para los ejemplos de la DNA Hbb decorados descritos anteriormente y una cadena un poco más largo (86 pares de bases) con el Hbb centrado en las posiciones 20 y 67.

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Representative Results

Las herramientas de software 3DNA se utilizan rutinariamente para analizar estructuras de ácidos nucleicos. Por ejemplo, las identidades de pares de bases y los parámetros de cuerpo rígido que caracterizan a los arreglos de bases en fragmentos de doble hélice del ADN y estructuras de ARN se calculan automáticamente y se almacenan para cada nueva entrada en la base de datos de ácido nucleico 22, un repositorio de todo el mundo información estructural de ácido nucleico. Los valores de los parámetros de cuerpo rígido determinados con el Protocolo 2 fácilmente revelan distorsiones en la estructura tridimensional, tales como los dos sitios de ADN extrema de flexión en el surco mayor, con grandes ángulos de balanceo positivos (64.95 ° y 60.93 °), que se encuentra en AT · AT pasos 13 y 22 en el complejo de cristal con la proteína Hbb Borrelia burgdorferi 8 (Figura 1).

La capacidad del software para reconstruir las estructuras de estas cantidades con el Protocolo n º 3 permite determinar la forma ende base individual y medidas de pares de bases contribuyen al redil molecular global. Como se ilustra en la Figura 2, la curvatura global del ADN inducida por Hbb refleja más de las dos distorsiones rollo extremos se señaló anteriormente. Es decir, el ADN sigue siendo altamente curvada cuando reconstruido con estos pasos de pares de bases enderezado, es decir, con ángulos de balanceo nulos en los dos sitios. La misma técnica se ha revelado previamente las contribuciones de los pasos y las deformaciones de pares de bases específicas a superhelical el terreno de juego de la ADN envuelto en la superficie de la partícula de núcleo nucleosoma 6 y a la anchura del surco menor del ADN unido a la bacteriana nucleoide- asociada a la proteína Fis 23.

La nueva capacidad en 3DNA, se describe en el Protocolo 4, para examinar un gran número de estructuras relacionadas hace que sea posible extraer tanto la secuencia-y patrones dependientes del tiempo en las disposiciones espaciales de ADN simulado y moléculas de ARN. Por ejemplo, el (amarillo) colo-codificación de los ángulos de balanceo entre pares de bases sucesivas en dos grandes conjuntos de estructuras de ADN simulados 11 revela la flexión preferencial de estas moléculas en pirimidina-purina pasos de pares de bases (Figura 3). Los valores más altos de rollo, representados en rojo, que persisten por períodos cortos en los extremos del ADN son indicativos de fusión localizada y reasociación de la estructura de doble hélice. Los patrones variacionales de otros parámetros rígida del cuerpo, como los ángulos y las distancias entre las bases complementarias, pueden ayudar a descifrar las distorsiones estructurales precisas.

La capacidad del software 3DNA, presentado en el Protocolo 5, reorientar moléculas relacionadas en un marco de referencia común, revela características de la estructura general ocultas en muchos de los archivos almacenados en el AP. Por ejemplo, la alineación convencional de estructuras relacionadas sobre la base de un ajuste raíz cuadrada de la media de los átomos correspondientes produce una serie de vías espaciales similares tsombrero superponer aproximadamente unos sobre otros, aquí los diez modelos basados ​​en RMN del operador DNA O3 ligados a los cascos de la proteína represora Lac 12 (Figura 4 a la izquierda). La superposición de las mismas estructuras en un marco de coordenadas común en el par de bases 5'-terminal de cada dúplex revela distorsiones considerables de la estructura global, en el que las moléculas flexionan en apreciablemente diferentes direcciones (Figura 4 a la derecha). La variabilidad estructural puede influir en la facilidad con la que la proteína de represor Lac de Escherichia coli se une O3 e induce un bucle entre O3 y operadores secuencialmente distantes en el operón lac 24.

Los pasos descritos en el Protocolo 6, para la construcción de modelos de fragmentos largos de ADN decoradas en sitios arbitrarios con proteínas y otros ligandos, añade una nueva perspectiva sobre la organización de asambleas macromoleculares grandes. Estos modelos ayudan a entender cómo los complejos multi-molecularesinteractuar durante el procesamiento biológico. Como se ilustra en la Figura 6, la colocación precisa de una proteína arquitectónico como Hbb puede tener un efecto dramático sobre el plegamiento global de ADN. Si dos copias de la estructura de alta resolución conocida 8 están separados por 43 pares de bases, un fragmento de ADN de 81 pares de bases se cierra en una configuración apretada, casi cerrada. Si las dos proteínas se separan por un cinco pares de bases adicionales, el ADN sigue una, vía serpenteante abierto. Los muy diferentes disposiciones de la proteína-decorado espectáculo dúplex cómo el espaciamiento de las proteínas arquitectónicos pueden afectar la ciclación o bucle de ADN 25, 26.

Figura 1
Figura 1. Variación del ángulo de balanceo entre sucesivos pares de bases (ver inserto de representación visual) a lo largo de la cha ADNen une a la proteína Hbb de Borrelia burgdorferi 8. Los valores obtenidos a través del "análisis" de comandos de 3DNA y los datos estructurales descritos en el Protocolo 2. Tenga en cuenta los valores extremos del rollo en el AT pasos que enmarquen solamente el tercio central de la estructura.

La figura 2
Figura 2. Modelos atómicos aproximados de ADN construida utilizando la función 'reconstrucción' de 3DNA y rendido en PyMOL con átomos con código de color (C-cian, N-azul, rojo-O, P-oro). Los modelos basados ​​en (izquierda) los parámetros de pasos de cuerpo rígido de la proteína Hbb y (derecha) un conjunto modificado de parámetros de pasos, donde los dos mayores valores de rol han sido puestos a cero. Ver el Protocolo no 3 para obtener instrucciones paso a paso . Tenga en cuenta el desarrollo de DNA inducida por los cambios impuestos en rollo.


Figura 3. Mosaico de imágenes de los ángulos de balanceo a lo largo del ADN en dos conjuntos de estructuras simuladas 11. Valores de rollo, extraídos mediante el Protocolo 4, son un código de colores de azul a rojo en el intervalo [-5 °, 20 °]. Tenga en cuenta el orden inverso de las bases y los grandes valores del rollo, destacado por columnas amarillas / rojas, que se producen en las etapas pirimidina-purina en las dos secuencias de 14 pares de bases auto-complementarios.

Figura 4
La Figura 4. Imágenes de la historieta de los modelos de ADN que se encuentran en las estructuras de RMN derivados del operador DNA O3 con el represor lac tocados proteína 12 ilustrativos de las capacidadesde las imágenes 'x3dna_ensemble reorientar' comando. prestados en PyMOL (backbones muestran como tubos de oro y bases como barras azules) y alineados utilizando (a la izquierda) las coordenadas en la entrada PDB (2kek) y (derecha) la superposición estructural presentada en el Protocolo 5 . Tenga en cuenta las grandes diferencias entre las estructuras cuando se coloca en un marco de referencia común en el par de bases 5'-terminal.

La figura 5
Figura 5. Captura de pantalla del servidor web w3DNA especificaciones ilustran de la secuencia de ADN (Label 1), la forma helicoidal del ADN no unido (etiqueta 2), las posiciones e identidades de las proteínas (Label 3), y la casilla de verificación imagen de previsualización (Label 4) definido en el Protocolo 6. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 6
La Figura 6. Modelos atómicos aproximados de dos proteínas HBB 8 unido a un fragmento de ADN de largo. Estructuras creadas con el servidor web w3DNA como se describe en el Protocolo 6 y rendida en PyMOL. Las cadenas de proteínas se muestran como cintas de color violeta, mientras que el ADN es de color-codificados según el tipo de átomo (C-cian, N-azul, rojo-O, P-oro). La base par central de cada sitio de unión a proteínas se encuentra en las posiciones (izquierda), 20 y 62 a lo largo de la cadena de ADN de pares de bases 81 y (derecha) 20 y 67 a lo largo de la cadena de ADN de 86 pares de bases. Tenga en cuenta el cambio más importante en el plegamiento de las estructuras asociadas con el aumento de la (cinco pares de base) de desplazamiento de las dos proteínas.

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Discussion

El conjunto de protocolos que se presentan en este artículo sólo afectan a las capacidades de la suite 3DNA de los programas. Las herramientas se pueden aplicar a estructuras de ARN para identificar pares de bases no canónicos, para determinar los contextos estructurales secundarias en las que se produce tal emparejamiento, para cuantificar la disposición espacial de los fragmentos helicoidales, para medir la superposición de bases a lo largo de la columna vertebral de la cadena, etc El comando de reconstrucción permite al usuario construir representaciones de bloques simples e informativo de las bases y pares de bases, como la que se muestra en el recuadro a la Figura 1. Las herramientas de construcción también incluyen características a "hilo" diferentes secuencias sobre una plantilla estructural dado, para generar modelos de numerosas estructuras de ADN de doble, triple, y de cuatro cadenas, a los modelos de orientar en una dirección específica, etc Por último, 3DNA tiene desempeñado un papel importante en una serie de otros proyectos, tales como: el servicio web solvatación SwS de ácidos nucleicos 27, el servidor web de ARTEalineación de ARN estructuras terciarias 28, la herramienta basada en la web MDDNA para el análisis de los resultados de dinámica molecular y la estructura de predicción 29, el abadejo impulsada por la información método de acoplamiento proteína-DNA 30, el servidor de SARA para la anotación de la función de las estructuras de ARN 31, el 3D- estructura de servidor de modelado de ADN DART 32; la base de datos 3D-huella para el análisis estructural de los complejos de proteína-ADN 33; la base de datos ARN FRABASE 2,0 para la identificación de fragmentos de tres dimensiones dentro de las estructuras de ARN 34, y el servidor web ORGANISMO para la comparación por pares de estructuras de ARN 35. A lo mejor de nuestro conocimiento, no existe actualmente ningún otro paquete de software de la estructura de ácido nucleico con una gran combinación de características y el historial sólido rendimiento de 3DNA comparable.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Estamos muy agradecidos a Patrocinador Jiří para compartir las coordenadas de dobles hélices de ADN generados en simulaciones de dinámica molecular. También reconocemos Nada Špačková de ayuda en la descarga de estas estructuras. Apoyo de este trabajo a través de becas de investigación USPHS Se agradece GM34809 y GM096889.

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