Analyse Murine Schwann Cell udvikling langs Voksende Axoner

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Her beskriver vi en Schwann celle (SC) migration assay, hvor SCs er i stand til at udvikle sig strækker axoner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Heermann, S., Krieglstein, K. Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons. J. Vis. Exp. (69), e50016, doi:10.3791/50016 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Udviklingen af ​​perifere nerver er en spændende proces. Neuroner sender axoner til innerverer specifikke mål, som hos mennesker ofte er mere end 100 cm væk fra soma i neuronet. Neuronal overlevelse under udvikling afhænger af target-afledte vækstfaktorer, men også på understøtningen af ​​Schwann-celler (SCS). Med henblik herpå SC ensheath axoner fra området af den neuronale soma (eller overgangen fra den centrale til perifere nervesystem) til synapsen eller neuromuskulære forbindelsespunkt. Schwann-celler er derivater af crista neuralis og migrere som forstadier langs nye axoner indtil hele axon er dækket med SCs. Dette viser betydningen af ​​SC migration for udviklingen af ​​det perifere nervesystem og understreger nødvendigheden af ​​at undersøge denne proces. For at analysere SC udvikling, en opsætning nødvendig som ved siden af ​​SCs også omfatter deres fysiologiske substrat for migration, axon. På grund af intrauterin udvikling (Mus musculus). For at omgå dette, har vi tilpassede det superiore cervicale ganglion (SCG) eksplantat teknik. Ved behandling med nervevækstfaktor (NGF) SCG eksplantater strækker axoner, efterfulgt af SC precursorer migrerer langs axonerne fra ganglion til periferien. Det gode ved denne ordning er, at SC er afledt fra en pulje af endogen SC, og at de trækker langs deres egne fysiologiske axoner, som vokser på samme tid. Dette system er især spændende, fordi SC udvikling langs axoner kan analyseres ved time-lapse imaging, åbner nye muligheder for at få indblik i SC migration.

Protocol

1. Fremstilling af kollagengeler

  1. Udarbejde en bestand medium, indeholdende 455 pi 10x MEM, 112 pi 7,5% NaHCO3, 50 pi glutamin og NaOH. Koncentrationen og mængden af ​​NaOH afhænger af rotte-hale collagen præparat (se 1.2), det endelige volumen af ​​bestanden medium er 1.000 pi.
  2. Forbered rotte-hale collagen ifølge Ebendal (1). Opbevares kollagenopløsningen ved 4 ° C. En nedbrydning af kollagenopløsningen kunne ikke observeres. Efter udarbejdelsen af ​​et nyt parti, estimere NaOH-koncentration er nødvendig for bestanden medium (se 1,1). Brug pH-indikator for medium til titrering af mængden og koncentrationen af ​​NaOH. 800 ul sure rotte-hale collagen nødt til at vende en nuance af rød, når det blandes med 210 ul af bestanden medium. Hvis koncentrationen af ​​NaOH er for lav kollagenopløsningen bliver gul, på grund af den pH-indikator mediet. Føj kollagen til mediet og bland uden producing bobler. Udfør disse trin på is. Polymerisationen sker inden for 2 timer efter, at kollagenopløsningen og bestanden medium er blevet blandet, og den nye opløsningen inkuberes ved 37 ° C. Test dette før du starter et eksperiment. 1.3) Bland 800 gl af kollagenopløsning med 210 pi stock medium (se 1.2). Anbringes 100 ul af denne opløsning i brønde i en 8 godt kammer slide. Glassene inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 og fugtige betingelser i en cellekultur inkubator. Forberede kollagengeler under en cellekultur bænk og sterile betingelser. Den collagen gelatinerer indenfor 2 timer.

2. Dissektion af Embryoniske SCGs

  1. Harvest embryoner af tid gravide mus (E16-18) fra livmoderen og opbevar dem i PBS indtil videre behov.
  2. Dissekere et embryon fra amnion. Halshugge embryonet caudale af clavicula niveau. Fastgør hovedet på en silicium bund fad med "insekt-nåle". Den ventrale side af hovedet står over for dig enD Du er nødt til at se den submandibulære region. Fikseringen muliggør lettere fremstilling.
  3. Fjerne huden af ​​den submandibulære region venstre og højre og dermed subkutane bindevæv.
  4. Fjern de submandibulære spytkirtlerne fra deres placering at rydde visning på hyoid, de infrahyoidal muskler og musculus sternocleidomastoideus.
  5. Fjern disse muskler forsigtigt at rydde visning på strubehovedet og luftrøret. Fjern luftrøret og strubehovedet. Carotidarterierne er så synligt på begge sider på de prevertebral muskler. SCG ligger i forgreningen af ​​carotidarterierne, og har en oval form. Fjern forsigtigt ganglier og placere dem i PBS. Fjern ganglia forsigtigt fra Dissektionsværktøj hvis de holde sig til dem. Det er fordelagtigt at anvende pincet og en nåleholder er monteret med en "insekt kanyle" til SCG fjernelse.
  6. Én gang i PBS, opbevares ganglia ved stuetemperatur i PBS indtil du dissekeret enough ganglier. Rengør derefter ganglier fra blodkar og bindevæv. Udføre SCG dissektion og rensning under et dissektionsmikroskop anbragt under en laminar strømning bænk.
  7. Endelig placeres det eksplanterede ganglier på de gelatinerede kollagengeler ved hjælp af injektionsnåle er monteret på en sprøjte for nemmere håndtering.
  8. Inkubér SCG-eksplantater på den gelatinerede collagen i en cellekultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og fugtige betingelser.

3. Behandling af SCG Eksplantater

  1. Efter 1-2 timer inkubation dække SCG eksplantatet indeholdende collagen med 100 ul Neurobasal cellekulturmedium indeholdende B27 supplement, glutamin og antibiotika. Nu brøndene i kammeret objektglas indeholder et volumen på 200 ul (100 pi gel og 100 pi medium). Tilføje endnu 200 ul af mediet, men nu indeholder NGF (60 ng / ml) for at lette axonal vækst. Følgelig den endelige NGF koncentration er 30 ng / ml.
    1. For at undersøge udbrud af SC migration, tilføje yderligere faktorer direkte på dag in vitro 0 (DIV0). Opløs faktorer i NGF medium i dobbelt nødvendige koncentration (2).
    2. For at analysere virkningen på SCS, der allerede begyndte at migrere langs axoner, tilføje yderligere faktorer ved DIV3 indtil DIV4 (potentiel stop af forsøget). Med henblik herpå fjernes forsigtigt 180 ul af opløsningen, ved DIV3, og der tilsættes 200 gl nye medium indeholdende NGF og de ​​yderligere faktorer af interesse ved den dobbelte koncentration (2).

4. Time-lapse Imaging

Brug et inverteret mikroskop for analyser. Forskellige mål kan anvendes, definerer synsfeltet og forstørrelse. Et vigtigt aspekt er imidlertid, arbejdsafstanden af ​​det anvendte mål, som billeddannelse af SCG-eksplantater udføres gennem objektglas og collagenetgel. Optagelsen frame rate af 1/10-30 minutter viste gode resultater (2). Men dette aspekt skal tilpasses den videnskabelige spørgsmål. En normal CCD-kamera kan bruges til billedoptagelse. For tiden lapse imaging en cellekultur rugekammeret skal fastgøres til den fase af mikroskopet. Inkubere vævet under billeddannelse ved 37 ° C med 5% CO2 og fugtige betingelser. Start inkubationssystemet en time før starten af ​​billeddannelse. Dette gør det muligt mikroskop dele (f.eks mål), herunder kammeret slide til at tilpasse sig den temperatur og forhindrer temperatur inducerede driver. Definer bestemte områder af analyser (indenfor på eksplantat og mellem forskellige eksplantater) med hjælp af mikroskopet software og en software-styret motoriseret stadie (multiposition setup) for samtidige analyser af forskellige anvendte betingelser til SCG eksplantater. For time-lapse imaging vildtype væv og væv fra transgene dyr kan anvendesmarkerer SCS (S100B: GFP) (3). For billeddannelsesprodukter fluorophorer en fluorescerende lyskilde skal gennemføres i micropscope setup. Brug standard filtre.

5. Kvantificering af SC migration afstande

  1. Ved slutpunktet (DIV4 f.eks), fastsætte kollagengeler med 4% PFA i kammeret glider i 3-4 timer. Fortløbende vaske kollagengeler 5 gange i 10 minutter med PBS. Anvende Standardprotokollerne for immuncytokemi (2). Hvis du er ny til fremstilling af SCGs, bekræfte identiteten af ​​ganglion som et sympatisk ganglion ved immunhistokemi mod tyrosinhydroxylase (TH) en fælles markør for catecholaminerge celler. Under immunhistokemi (efter det primære antistof), overføres eksplantatet holdige kollagengeler til 24 brønd plader, som har et større volumen, hvilket er til gavn for vask af gelerne.
  2. Efter immunhistokemi, placere nøje kollagengeler på objektglas. Omhyggeligtfjerne den resterende opløsning og lad kollagen tørre / skrumpe til to dimensioner. Dette tillader let måling af afstande (2). Efter dette, montere prøverne.
  3. Endelig, måle migrationen afstande ved hjælp af Fiji (NIH) software. Ingen specielle plugins er brug for dette formål. For at muliggøre korrekte målinger i um, kontrollere den korrekte billedbehandling metadata og indstillingerne under Fiji, image og skala. Brug Fiji også for kvantificering af celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Axonal vækst fremmes i SCG eksplantater efter behandling med NGF (4) (film ordning S1 Figur 1 ordning). Denne proces er let synlige ved enhver omvendt mikroskop, og kan efterfølges af time-lapse imaging (film S2). Hvis en forsker er ny for dissekere SCG fra museembryoer vi anbefaler en validering af teknikken ved en simpel anti-tyrosinhydroxylase (TH) immunhistokemi. TH er en fælles markør for catecholaminerge neuroner (i dette tilfælde sympatiske neuroner) og ikke også label axoner (fig. 2B). På denne måde axonale længder kan analyseres i dette system (2).

Vigtigere, efter axonal vækst er blevet induceret, kan en bølge af migrerende celler iagttages (film S2 og S3). Migrerende celler blev valideret som S100 immuno positiv SC (2). Desuden en transgen mus linie, hvor GFP er under kontrol af den humane S100B promotorfragment (3) kan anvendes til direkte at analysere det mærkede SC population (2) (film S4 og S5). Ved hjælp af den transgene linje disse eksperimenter kan også udføres med konfokal-eller lyspladen mikroskopi (ikke udføres her).

For analyser af SC i træktiden, anbefaler vi et område af analyse med en lav axonal densitet (figur 1 close-up DIV3 og DIV4) og dermed en lille population af SC per område analyse. Dette letter bedste muligheder for at se cellemorfologi og cellulær adfærd (film S3).

SC migration afstande kan måles ved afslutningen af et eksperiment (f.eks DIV4). Til dette formål DAPI nuklear mærkning kan udføres på fast væv og afstande fra den førende SC kerner til grænsen af eksplantatet kan måles ved hjælp af Fiji (NIH software) (figur 2 ordning og DAPI mærkning) (2).Desuden også SC proliferation eller SC død kan analyseres. Til dette formål immunohistokemi for pHH3 eller for aktiveret caspase-3 kan udføres for eksempel identifikation af mitotiske eller apoptotiske celler henholdsvis (2).

Figur 1
Figur 1 A:. Scheme viser axonal vækst fra en eksplanteret SCG over tid (DIV0-DIV4). B / C: brightfield billeder, der er taget under time-lapse imaging viser nærbilleder af en region i en SCG explant ved DIV3 (B) og DIV4 (C) (skala-bar = 100 um).

Figur 2
Figur 2 A:. Scheme viser SC (blå) langs udvidede axoner (grå), vokset fra en eksplanteret SCG (lyseblå) på DIV3 og DIV4. Migration afstande kan måles på DAPI atomkraft-mærkede prøver ved at måle afstanden fra kernen af ​​den førende SC til grænsen af ​​det eksplanterede SCG på flere steder (C). TH immunhistokemi (DIV4) bør foretages, hvis en videnskabsmand er ny for SCG dissektion. En positiv mærkning klart identificerer eksplanterede ganglion som et sympatisk ganglion (B). TH immunohistokemi muliggør også analyse af axoner dyrket fra eksplanterede SCGs.

Film S1. Ordningen viser axonal vækst fra en eksplanteret SCG over flere dage in vitro. Klik her for at se film .

Film S2. Axonal vækst og SC migration fra en NGF behandlet SCG eksplantation. Imaging startede DIV2. Optagelse frame rate var 1/30 min. Scale-bar = 100 um. Klik her for at se film .

ntent "> Film S3. Nærbillede af et perifert område af en SCG eksplantation. På grund af en lav axonal tæthed enkelt SC let kan analyseres. Imaging start var DIV3. Optagelse frame rate var 1/10 min. Scale-bar = 100 um . Klik her for at se film .

Film S4. Kombinationen af brightfield-og fluorescens muliggør visualisering af S100 GFP-positive SCs og axoner. Optagelse frame rate var 1/10 min. Scale-bar = 100 um. Klik her for at se film .

Movie S5. SC migration ved grænsen af en SCG eksplantation. Her er kun fluorescens kanal vises muliggøre lettere fortolkning af S100 GFP-positive SCs. Optagelse frame rate var 1/10 min. Scale-bar = 100 um./ 50016/50016movieS5.avi "target =" _blank "> Klik her for at se film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udviklingen af ​​det perifere nervesystem er en spændende proces. Når udviklingen er afsluttet, axoner ensheathed af SCs langs hele længden, hvilket kan, hos mennesker, ofte over 100 cm. Til dette formål det korrekte antal af de krævede SCs der skal etableres under udvikling og SCS også nødt til at bevæge sig langs strækker axoner til periferien for at sikre den fuldstændige axonal dækning. Dette gælder for myelinerede men også for unmeylinated axoner. I begge tilfælde alle axoner er i kontakt med SCs og afhænger af deres støtte. At studere SC udvikling, er assays behov, som tager den axonale rum i betragtning og dermed efterligne in vivo-udvikling til en bedre grad end scratch assays (5), kan Boyden assays (6) eller kammer assays do. I nogle assays det axonal rum blev taget hensyn til allerede. For eksempel dele af ischiadicus nerver blev anvendt som ruter for SCS at migrerelangs (7, 8), eller SCs blev co-dyrket med neuroner langs hvilke axoner de blev observeret at migrere (9).

SCG explant SC migration assay har imidlertid endnu flere fordele. Det er især interessant, fordi SCs udvikler langs deres egne fysiologiske axoner, og disse er selv stadig voksende. Endvidere er teknikken let at lære og kræver kun lidt af tekniske dissektion færdigheder og ikke kræver en kompleks co-dyrkningssystem af neuroner og SCS. Et ganske lignende konfiguration, men ikke ved hjælp SCGs men snarere DRG, blev foreslået af Gumy og kolleger (10). Imidlertid at udnytte alle mulighederne for en sådan assay er et omvendt mikroskop setup nødvendig muliggør time-lapse billeddannelse. Det er vigtigt at have mulighed for at gøre "multi-position eksperimenter", for at kunne analysere differentielt behandlede SCG-eksplantater, der ligger i et kammer objektglas på sammetid, således at arbejde med optimal kontrol side om side med de faktorer af interesse (2). For analyserer vi kun brugt konventionel lys-og konventionel fluorescens (for transgen S100B: GFP mus) mikroskopi. Teknikken kan imidlertid også let anvendes med konfokal-eller lyspladen mikroskopi (ikke udføres her). Time-lapse optagelser kan anvendes til at identificere specifikke cellulære egenskaber / adfærd under migration. Indtil nu har kun vildtype og transgene mus er blevet anvendt (2). Imidlertid bør transfektion af SCS og dermed prisændringer veje med RNAi for eksempel være mulig. Med denne teknik kan det endda være muligt at analysere SC-axon samspillet mellem normal og ændrede SC på samme eller nærliggende Axon. Hvad angår migration afstande, SC spredning og SC overlevelse, kan slutpunkt analyser let udføres ved immunohistokemi med DAPI nuklear mærkning og Fiji (NIH) software. Men i sidste ende endog liv-reporter for proliferation (11) og celledød (12, 13) kan anvendes, hvorved der opnås en direkte udlæsning under billedbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Urmas Arumae til deling et kollagen-protokol og Jutta Fey og Ursula Hinz for fremragende teknisk bistand. Desuden vil vi gerne takke Christian F. Ackermann, Ulrike Engel og Nikon Imaging Center ved University of Heidelberg og også Joachim Kirsch for venlig hjælp til video shoting. Arbejdet blev delvist finansieret gennem Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x MEM Gibco 21430
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080
Glutamine Gibco 25030
NaOH Merck 109137
NGF Roche 1058231 R&D#556-NG-100
Neurobasal Medium Gibco 21103
B27 Supplement Gibco 17504
antibiotics Gibco 15640
d-PBS Gibco 14040
insect needles FST 26002-20
syringe needle Braun BD # 300013
8 well chamber slide Lab tek 177402

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6, (12), e28692 (2011).
  3. Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24, (49), 10999-11009 (2004).
  4. Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46, (3), 373-384 (1960).
  5. Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34, (1), 39-51 (2001).
  6. Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181, (2), 351-365 (2008).
  7. Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (7), 2795-2799 (1994).
  8. Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16, (15), 4673-4683 (1996).
  9. Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (23), 8774-8779 (2004).
  10. Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37, (2), 298-311 (2008).
  11. Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, (3), 487-498 (2008).
  12. Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133, (9), 2832-2835 (2011).
  13. Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).

Comments

2 Comments

  1. There's a problem with recommending this page, please help. Thanx

    Reply
    Posted by: Muhammed A.
    November 26, 2012 - 2:49 AM
  2. Dear Muhammed,
    sorry, but I do not exactly get what you mean by recommending. Are you not able to see the content?
    best, Stephan

    Reply
    Posted by: stephan h.
    November 30, 2012 - 4:24 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics