심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Macadangdang, J., Lee, H. J., Carson, D., Jiao, A., Fugate, J., Pabon, L., Regnier, M., Murry, C., Kim, D. H. Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (88), e50039, doi:10.3791/50039 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

심혈관 질환은 전세계 사망 1의 주요 원인이 남아있다. 심장 조직 공학 심장 재생뿐만 아니라 체외 심사 분석을위한 기능적인 조직 개발의 목표와 혁신적인 의료 발견을 제공하기 위해 많은 약속을 보유하고 있습니다. 그러나, 심장 조직의 충실도가 높은 모델을 만들 수있는 능력이 어려운 입증했다. 심장의 세포 외 기질 (ECM)는에서 나노 미터 규모의 2 마이크로에 이르기까지 모두 생화학 및 생 역학적 인 신호로 구성된 복잡한 구조입니다. 기계적 하중 조건과 세포 - ECM 상호 작용 지역은 최근 심장 조직 공학 3-5의 중요한 구성 요소로 인식되고있다.

심장 ECM의 많은 부분이 크게 조직 구조 및 전기 기계 결합이 영향을 나노 스케일 직경 정렬 콜라겐 섬유로 구성된다. 불행하게도, 몇 가지 방법이 근래전자 나노 미터 크기까지 ECM 섬유의 조직을 모방 할 수있게되었습니다. 나노 제조 기술의 최근 발전은, 그러나, 심장 6-9에서 ECM의 생체 구조 및 기판 강성 큐들을 모방 확장 발판의 설계 및 제조를 사용할 수있다.

여기에서 우리는의 발전을 제시이 재현성, 경제적, 및 생체 적합성 중합체, 폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 라이드) (PLGA) (8) 및 폴리 우레탄 (PU) 계 중합체를 사용하여 심장 세포의 기능적 정렬을위한 확장 가능한 나노 패터닝 공정. 이러한 이방를 nanofabricated 하층 (ANFS는) 잘 조직 된, 정렬 조직의 기본 ECM을 모방하고 세포 형태 및 기능을 10 ~ 14에 나노 형상의 역할을 조사 할 수 있습니다.

주형으로 나노 패턴 (NP) 실리콘 마스터를 사용하여, 폴리 우레탄 아크릴 레이트 (PUA) 금형을 제작한다. 이 PUA 몰드는 다음 파에 사용된다각각 UV-지원 또는 용매 매개 모세관 력 리소그래피 (CFL), 15, 16을 통해 PU 또는 PLGA 하이드로 겔을 ttern. 간단히, PU 또는 PLGA 예비 중합체는 유리 커버 슬립하고 PUA 금형이 상부에 배치되어 상으로 분배 된 드롭이다. UV 보조 CFL 들어, PU는 후 경화 UV 방사선 (λ = 250-400 NM)에 노출된다. 용매 매개 CFL의 경우, PLGA는 열 (120 ° C) 및 압력 (100 kPa의)를 사용하여 양각되어있다. 경화 후, PUA 몰드는 세포 배양을위한 ANFS 남기고 박리된다. 이러한 신생아 래트 심실 근세포뿐만 아니라 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 같은 일차 전지는, ANFS 2에 유지 될 수있다.

Introduction

심혈관 질환은 세계에서 사망률 및 사망의 주요 원인이며, 이미 변형 된 세계 보건 시스템 1,17에 무거운 사회 경제적 부담을 제시한다. (1) 허혈성 질환이나 심근 병증 후 손상된 심근을 재생하거나 (2) 생체 외 약물 검사 또는 질병 모델링을위한 마음의 고 충실도 모델을 만드는 : 심장 조직 공학은 두 가지 목표를 가지고 있습니다.

심장은 몸에 혈액을 공급하기 위해 지속적으로 작동해야합니다 복잡한 기관이다. 심근 및 지원 조직의 밀집 층 구조는 심장 벽 (18, 19)에 걸쳐 나선형 패턴으로 배치되어있다. 심장은 전기 기계적 효율적으로 본체 (21)에 혈액을 배출 할 수있는 고도의 조정 방식으로 20에 연결된다. 자연의 아야 신뢰성 시험 관내에서 효과적으로 요약 될 수 있기 전에 여러 주요 장애물은, 그러나, 해결되어야 남아있다.강력한 심근 분화 방법 (22)을 개발하기 위해 계속하지만, 첫째, hPSC-CMS는 여전히 다소 미숙 표현형을 나타낸다. 자신의 전기 특성과 형태에 가장 가까운 태아의 수준 23 일치. 전통 문화의 조건에서 보관하는 경우 둘째, 줄기 세포 유래 및 기본 심근 모두 기본, 조직과 같은 구조로 조립하는 데 실패합니다. 오히려 세포가 무작위로 지향되고 성숙한 심근 (24)의 줄무늬 막대 모양의 외관을 지원하지 않는 경우가 있습니다.

세포가 상호 작용과 세포 외 기질 (ECM) 환경은 많은 세포 과정 11,13,25에 중요한 역할을한다. ECM은 크게 6,26 세포의 구조 및 기능에 영향을 미치는 복합, 잘 정의 된 분자 및 지형 큐들로 구성된다. 심장 내에서 세포 정렬 밀접 기본 나노 미터 규모의 ECM 섬유 2를 다음과 같습니다. 이러한 nanotopograph의 영향세포와 조직의 기능에 iCal의 단서는, 그러나, 지금까지 완전히 이해에 있습니다. 나노 미터 크기의 세포 - 생체 적합 물질의 상호 작용의 예비 연구 (27) 세포 신호 전달, 접착 28-30, 성장 31, 32, 33 및 차별화를위한 서브 마이크론 지형 신호의 잠재적 인 중요성과 효과를 나타냅니다. 그러나, 재현과 확장 성 나노 제조 기판 개발에 어려움에, 이러한 연구는 생체 내 ECM 환경에서 복잡한 멀티 스케일 휴대 효과를 재현 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 네이티브 심장 ECM 섬유 배향을 흉내 낸 세포 배양 지지체를 생성하는 간단하고 비용 효과적인 나노 제조 기술은 심근 세포 - 생체 물질의 상호 작용의 신규 한 조사 광범위한 있도록 설명한다. 심근은 나노 ECM 환경과 상호 작용하는 방식을 이해하는 것은 더 가깝게 모방 기본 조직의 기능에 휴대 동작을 제어 할 수있는 능력을 허용 할 수기. 또한, 세포 단일 층은 3 차원 구조에 비해 단순화 된 실험 시스템입니다 만, 여전히 통찰력 조사와 기능 검사 2,34-36 복잡한 다세포 동작을 나타냅니다. 마지막으로, 지지체 (37)는 재생 목적을 위해 심장에 이식 할 때 셀룰러 그래프트 기능을 향상시키기 위해 사용될 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

별도의 표시가없는 한, 모든 절차는 실온 (~ 23 ° C)에서 실시하고 있습니다.

실리콘 마스터 1. 제작

  1. O 2 / N 2 가스에서 100 % 에탄올, 자일 렌 및 건조와 깨끗한 실리콘 웨이퍼.
  2. 0.3 ~ 0.5 μm의 두께 필름을 생산하기 위해 2,000-4,000 RPM의 회전 속도로 스핀 코터 실리콘 웨이퍼를 놓습니다.
  3. 포토 리소그래피 시스템을 사용하여 패턴 정확한 치수를 갖는 포토 레지스트 막을
  4. 완전 포토 레지스트 개발 솔루션의 적절한 볼륨의 패턴 화 된 포토 레지스트 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 체험.
  5. 탈 이온수로 개발 된 포토 레지스트 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 씻어.
  6. 근처 수직 측벽, 깊은 반응성 이온 식각 에칭 시스템을 사용하여 노출 된 실리콘과 함께 서브 마이크론 치수 능선 어레이를 형성한다.
  7. 플라즈마 애셔 시스템에서 실리콘 웨이퍼를 배치하여 남은 포토 레지스트를 제거한다.
  8. 승 실리콘을 잘라이후의 복제 성형에 대한 적절한 크기의 실리콘 마스터에 다이아몬드 팁 커터 AFERS.

실리콘 마스터에서 PUA 몰드 2. 제작

주 : 나노 제조를위한 실리콘 마스터에 추가 할 양이 우레탄 아크릴 레이트 (PUA) 용액의 점도뿐만 아니라 복제 될 나노 패턴 마스터의 면적에 따라 달라질 것이다.

  1. 100 % 에탄올 또는 O 2 / N 2 가스에서 자일 렌 및 건조와 깨끗한 실리콘 마스터면.
  2. 페트리 접시에 실리콘 마스터 패턴 측면을 놓습니다.
  3. 2cm X 2cm 표면 패턴, 패턴의 표면에 PUA의 피펫 40 μL와 실리콘 마스터하십시오.
  4. 4cm 분배 PUA에 대한 X 4cm 투명한 폴리 에스테르 (PET) 필름의 시트를 놓습니다.
  5. 아래로 PET 시트에 눌러 수 있도록 (예 : 카드 등) 롤러 또는 평면 가장자리가 표면을 사용하여 패턴면에서 시트 아래에 PUA 확산 전체패턴 PUA 프리폴리머에 의해 덮여있다.
  6. 50 초 동안 약 10cm 20 와트 (115 V) 자외선 (λ = 365 nm의) 아래의 실리콘 마스터, 예비 및 PET를 놓습니다. 효과가, 자외선 파장은 310-400 nm의 사이에 어디 에나있을 수 있습니다. 빛의 세기는 상기 기판의 표면에서 10 ~ 15 mW의 / cm 2이다.
  7. 경화 후, 집게 천천히 PET 필름을 제거합니다. PUA는 실리콘 마스터 나노 패턴의 음과 PET 필름에 부착해야한다.
  8. 사용하기 전에 최소 12 시간 동안 UV에서 PUA / PET의 나노 패턴을 치료. 과다 노출은 문제가되지 않습니다.
  9. 실리콘 마스터를 청소하려면, PUA의 추가없이 마스터 위에 PET의 또 다른 필름을 배치하고 50 초 동안 자외선 (λ = 365 nm의)에 노출 및 PET 필름을 제거합니다. 이것은 미 반응 모노머를 제거합니다.
  10. O 2 / N 2 가스에서 100 % 에탄올, 자일 렌 및 건조와 실리콘 마스터를 씻어.

3A. 나노 패터닝 폴리 우레탄 폴리머

  • 10 분간 오존 처리 챔버 내에 배치하여 25mm 지름의 원형 유리 슬라이드를 준비한다.
  • 쉬운 취급을위한 작은 PDMS 블록에 오존 처리 된 유리 슬라이드를 놓습니다.
  • 유리 슬라이드에 페인트 브러시와 표면 접착 촉진제의 얇은 층을 적용하십시오. 30 분 동안 공기 건조 유리 슬라이드.
  • 프린터 종이에 유리 슬라이드를 놓습니다.
  • 유리 슬라이드의 중심에 사전 폴리머 (NOA 76) 폴리 우레탄 10 μL (PU)을 분배 삭제합니다. 기포가 첨가 한 후 존재하지 않는 확인하십시오.
  • 장소 PUA 금형, 패턴 유리 슬라이드에, 얼굴을 아래로. 균일 PUA 몰드 따라 실린더 고무 롤러를 회전함에 따라 유리 슬라이드의 표면에 걸쳐 PU를 분산. 프린터 용지 폴리머 오버 플로우를 흡수 할 것이다.
  • 와트 UV 램프. PU의 중합 시간은 UV 소스의 힘에 의존한다.
  • UV 광원으로부터 샘플을 제거하고주의 깊게 PU 코팅 된 유리 슬라이드에서 PUA 몰드 껍질. PU의 중합 C로 간주됩니다omplete 완전히 떨어져 샘플에서 PUA 몰드 껍질과 PU 유리 슬라이드 무지개 빛깔의 외관이 때.
  • 한 달에 스토리지를위한 데시 케이 터에서 완성 샘플을 놓습니다.
  • (b). 나노 패터닝 폴리 (락 타이드 - 코 - 글리콜 라이드) 히드로 겔

    1. 적극적으로 10:1의 비율로 실리콘 엘라스토머 기지와 실리콘 엘라스토머 경화제를 혼합하여 평면 PDMS 몰드를 만듭니다.
    2. (PDMS 5 ㎜ 두께가되도록, 즉) PDMS 전구체 접시의 가장자리를 5mm까지 도달하도록 혼합 PDMS가 페트리 디쉬에 액을 전구체 붓는다.
    3. 가스를 제거하는 1 시간 동안 건조기에 페트리 접시와 PDMS 전구체를 놓습니다.
    4. 치료하기 위해 적어도 2 시간 동안 65 ° C의 오븐에 페트리 접시와 PDMS 전구체를 이동합니다.
    5. PDMS는 치료 후 3cm × 3 인치의 정사각형 섹션으로 평면 PDMS를 잘라 면도기를 사용합니다. 이러한 패터닝 공정에서 나중에 사용 평 PDMS 몰드 것이다.
    6. PL 청결한 지름 25mm 원형 유리 슬라이드물을 초음파 처리기에 30 분 동안 이소 프로필 알콜로 acing.
    7. O 2 / N 2 가스 하에서 드라이 세정 된 유리 슬라이드.
    8. 드롭 PLGA 용액 100 μl를 분배 유리 슬라이드에 (15 % w 클로로포름 PLGA V /).
    9. 용매를 흡수하고 평평한 PLGA 표면을 얻기 위해 분배 된 PLGA 위에 평평한 PDMS 몰드를 놓습니다. 5 분 동안 PDMS 위에 200g의 중량을 배치하여 가벼운 압력 (~ 10 kPa의)을 적용한다.
    10. 서서히 평 PDMS 몰드를 박리하고 잔류 용매를 제거하고 PLGA와 커버 글라스 사이의 밀착성을 증가시키기 위해 5 분 동안 예열 플레이트 (120 ℃)​​에 커버 글라스를 배치.
    11. 플랫 PLGA 위에 NP PUA 몰드를 놓고 PUA 몰드의 상단에 1 kg 무게를 배치하여 일정한 압력 (~ 100 kPa의)과 열 (120 ° C)를 적용 15 분 동안 가열 접시에있다.
    12. PLGA 커버 슬라이드에서 무게를 제거하고 하층은 실온으로 냉각시킨다. 하층이 될 때까지 PUA 몰드를 제거하지 마십시오냉각.
    13. 하층가 충분히 냉각 한 후, 조심스럽게 NP PLGA의 기질을 드러내는, NP PUA 몰드를 벗겨. NP PLGA의 토대는 무지개 빛깔의 모습이 있어야합니다.
    14. 한 달에 스토리지를위한 데시 케이 터에서 완성 샘플을 놓습니다.

    4. 셀 시드와 문화

    참고 :이 프로토콜은 신생아 쥐의 심실 근육 세포 (NRVMs)과 H7 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 (hESC의-CMS)하지만 다른 세포 소스의 문화를 설명 사용할 수있다.

    1. 35mm 조직 문화 폴리스티렌 접시에 ANFS의 커버 슬립 (PU 또는 PLGA)를 연결합니다. 접시의 바닥에 조심스럽게 놀 랜드 광학 접착제 (NOA83H)의 피펫 20 μL는 NOA의 상단에 ANFS coverslip에 배치합니다. 접착제가 퍼져 전체 coverslip에 바닥을 커버 할 수 있습니다. 10 분 동안 UV에 요리를 노출하여 NOA 치료.
    2. 회, 5 분 동안 70 % 에탄올 수용액 2 ㎖로 세정하여 ANFS 살균. 전자를 제거흡인 thanol. 허용 ANFS 생물 안전 캐비닛의 UV 살균 램프 (λ = 200-290 nm의)에서 ~ 1 시간 동안 완전히 건조 공기.
    3. 세포 접착 밤새 피브로넥틴에 ANFS 코팅에 의해 강화된다. 5 ㎍ / ml로 DI 물에 피브로넥틴을 희석. 접시에 피브로넥틴 솔루션의 피펫 2 ㎖. 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하고 5 % CO 2 밤새 (최소 6 시간).
    4. 이전 프로토콜 22에 따라 NRVMs, hESC의 CMS가, 또는 관심의 다른 심장 세포를 얻습니다.
    5. 펠릿 세포에 3 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기 세포 샘플.
    6. 흡인에 의해 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오.
    7. 4.6 × 106 세포 / ml의 농도로 적절한 배양 배지에서 세포를 재현 탁.
    8. 조심스럽게 살균 ANFS에 세포 현탁액 200 μl를 피펫. 확인 세포 현탁액은 커버 슬립에 남아합니다.
    9. 37 ° C와 5 % 배양기에서 세포를 배치CO 세포가 ANFS에 부착 할 수 있도록 4 시간 2.
    10. 동일한 조건에서 배양기에서 세포를 접시 및 교체 따뜻한 배지 2 ㎖를 추가합니다.
    11. 24 시간 후, 미디어를 제거하고 여분의 세포를 제거하기 위해 두 번 DPBS 2 ㎖로 씻는다.
    12. 동일한 조건에서 배양기에서 세포를 접시 및 교체 따뜻한 배지 2 ㎖를 추가합니다. 문화 세포가 합류합니다. 매일 미디어를 교체합니다.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    도 1은이 제조 방법에 대한 제조 공정의 개략도이다. 때문에 나노 지형에 의한 빛의 회절, 나노 패터닝은 ANFS에 무지개 빛깔의 표면에 발생한다. 2는 800 nm의 능선과 홈에 잘 패턴 25mm NP-PU coverslip에 (그림 2A)에서이 무지개 빛깔의 표면을 묘사 그림(그림 2B). ANF​​S의 무지개 빛깔의 외관은 능선과 홈의 폭에 따라 다소 차이가 있습니다.

    ANF​​S에 세포를 파종 한 후, 셀은 기판의 홈에 평행 한 방향으로 정렬되기 시작한다. 정렬은 파종 후 첫 24 시간 내에 명확하게해야합니다. (3) 문화의 48 시간 후 문화의 hESC-CM을 7 일 이후에 NRVMs 대표 시야의 이미지를 보여줍니다 배양 기간의 전체에 대한 유지해야한다. NRVMs패터닝되지 않은 표면에 심근 무작위 (그림 3A3C) 지향하는 반면, 차의 hESC-CM을 NP 표면에 분명 구조 이방성 및 정렬 (그림 3B3D)를 보여줍니다. 면역 조직 화학적 분석은 세포 골격의 배향에 나노 형상의 영향을 강조한다. 액틴 미세 섬유 (F-액틴) 및 나노 능선을 따라 정렬하지만 무작위로 패턴 화되지 않은 하층에 세포 (그림 4)에 분산 된 상태로 유지 될 ANFS에서 배양 세포에서 α-sarcomeric 티닌. 심장 세포는 문화의 48 시간 후 자연 박동을 나타낸다.

    그림 1
    그림 1.   나노 제조 설계도 - 두 개의 나노 제조 PROC의 다이어그램esses. 용매 매개 CFL 묘사 (B - - D) (H E)를 묘사하면서, 모세관 력 리소그래피 (CFL)을 UV-지원. (A) PUA의 부정은 실리콘 마스터에서 이루어집니다. (B) PU 예비 중합체는 드롭 분배 유리 슬라이드와 PUA 몰드에이 상단에 배치되어 있습니다. (C) PUA 몰드 및 PU coverslip에이어서 PU를 경화 UV 광에 노출된다. (E) PLGA 중합체 용액을 드롭 분배 된 유리 슬라이드 상이며 편평한 PDMS 몰드가 편평한 PLGA 표면을 생성하기 위해 사용된다. (F) PUA 몰드 플랫 PLGA의 상단에 배치하고 (G) 일정한 열과 압력은 PLGA에 핫 엠 보스 NP에 적용됩니다. (D, H) PUA 몰드를 벗겨 후, NP-PU 또는 PLGA 기판은 남아있다. 심장 세포는 세포의 정렬 된 배열을 만들려면이 NP 표면에 접종 할 수 있습니다.


    그림 2. NP-PU 기판. (A) 넓은 지역 NP 표면의 사진. 커버 슬립의 무지개 빛깔의 모양은 나노 형상에 의해 발생합니다. 내부 나노 형상의 단면 (B) SEM 이미지.

    그림 3
    NRVMs의 그림 3. 정렬 된 심근. 배 시야의 영상 문화의 7 일 후 (A, B)과의 hESC-CM을 문화의 2 일 (C, D) 후. NRVMs 평면 PU 기판 (A)에 NRVMs 무작위로 정렬 된 상태 (B) 확실한 구조 조정을 전시 NP-PU 기판에 배양. (B)(D)의 화살 NP 이방성의 방향을 나타낸다. = 100 μm의 스케일 바.

    그림 4
    .. 그림 4 면역 공 촛점 이미징 세포 골격의 정렬 및 강선; α-sarcomeric 티닌 (적색), 세포 핵 (파란색), 그리고 F-액틴 (녹색). 평면 하층에 배양 된 세포가 무작위로 섬유를 지향 반면 순이익 기판에서 배양 세포는 α-sarcomeric 티닌 및 F-액틴 섬유를 정렬했다. 빨간색 α-sarcomeric 티닌 채널에 삽입 명확하게 줄이있는 sarcomeres을 보여줍니다.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    기능적으로 성숙한 심장 조직은 생체 내에서와 심장 조직 공학 생체 응용 프로그램에서 모두 부족하다. 여기에 설명 CFL의 나노 제조 방법은 셀룰러 정렬을 달성 인해 시스템의 확장 성으로 거시적 조직 기능을 좌우위한 견고한 기술이다. 큰 영역은 쉽게 패턴과 세포 배양에 사용할 수 있습니다. 매크로 셀 정렬은 생체 모방, 그것은 심근 (38)의 기계 및 전기 두 속성에 영향을 미치는 등 기능적인 조직을 만들기 위해 심장 조직 공학에서 필수적이다.

    여기의 방법은 심장 조직 공학 내의 다양한 애플리케이션에 적용될 수있다. 그것은 이전에 나노 큐가 심장 줄기 세포 틈새 시장을 생성하고 재생 (14)를 홍보하는 데 도움이 시연되었다. 이와 같은 PLGA와 같은 생분해 성 고분자를 이용하여 나노 패턴 "패치"촉진 할 수 있었다심장 모욕 후 치유. 대안 적으로, 네이티브 심장 유사한 탄성률과 하이드로 겔을 사용하여, 심근 세포-ECM 상호 작용 간략화 재현 시스템에서 연구 될 수있다.

    이러한 마이크로 콘택트 프린팅, 전기 방사 및 microtopography 같이, 다양한 다른 방법은, 이전에 설계된 마이크로 39-41 심장 조직의 구조를 제어하기 위해 사용되어왔다. 이러한 기술은 셀룰러 배향을 얻는 데 성공 증명하였으나, 생체 심장 조직의 구조와 기능이 ECM의 훨씬 작은, nanotopographical 큐에 의해 관리되며, 따라서 우리 NP 기판 유익한 증명한다고 보인다. 또한, 이러한 마이크로 패터닝 기술은 우리의 이방성를 nanofabricated 기판에 비해 고유의 단점이있다. 예를 들어, 우리의 나노 패터닝 방법은,보다 비용 효과적이고 전기 방사보다 제어 가능하다. 마이크로 콘택트 프린팅, 반면에, REL구조 이방성을 얻기 위해 특정 차선을 준수하는 세포에 이거. 기능 단일 층을 생성하기 위해, 세포는 증식해야하거나 꽉 접합을 형성하기 위해 이러한 차선 밖으로 이동한다. 이것은 훨씬 더 어려운 등 신생아 심근는 어떠한 증식 능력이 거의 셀 수 있습니다. Microtopography도 밀접하게 결합 된 세포 단일 층을 생성하는 무능력에 의해 제한됩니다. 인해 microtopography에 비해 세포의 비율로, 세포의 위에 또는 내부에 상주 microridges. 이것은 세포 - 세포 상호 작용의 양을 제한하고, 세포 - 세포 결합을 감소시킨다. 우리의 방법으로, 세포는 bioinspired 나노 스케일 지형을 통해 정렬되고 피처 크기는 적어도 세포 자체보다 작은 크기의 순서만큼 자유롭게 인접 셀과 상호 작용할 수있다. 이 밀접하게 결합 된 세포 단일 층이 생성 될, 더 많은 생체 모방 할 수 있습니다.

    NP-PU 최적의 결과를 우리는 강력를 들면 다음과 같은 제안아가씨 coverslip에 전처리 단계. 이러한 단계는 유리 표면에 폴리머의 밀착성을 증가시킬 것이다. 이뿐만 아니라 의지 제작 중에 PUA 마스터의 깨끗한 제거에 도움뿐만 아니라, 실험 중에 유리에서 분리에서 패턴 화 된 폴리머를 방지합니다. 전처리 단계의 효과를 시험하기 위해, 물에 한 NP-PU 기판을 배치하고 중합체는 유리에 부착 남아 있으면 관찰.

    PLGA는 글리콜 산 및 장치 및 생체 내 약물 전달 모두를 위해 개발 된 젖산의 공중 합체이다. 따라서,이 기질은 세포에 대한 좋은, 생체 적합성 ECM을 제공합니다. PLGA의 강성 락트산으로 글리콜 산의 비율을 조정하거나 또는 클로로포름 PLGA의 수축을 변경함으로써 조절 될 수있다.

    다양한 파라미터를 쉽게 최적화 또는 연구 목적을위한 이러한 시스템에서 다양하고 조정할 수있다. 각종 PU 계 폴리머는 넓은 범위에서 사용할 수 있습니다기계적 성질. 따라서 다른 PU의 예비 중합체를 사용함으로써, 다양한 기판 강성은 동일한 프로토콜에 의해 제조 될 수있다. 사용자는 또한, 기판 지형을 바꿀 수있다. 기판의 나노 형상 실리콘 마스터의 디자인에 따라 달라집니다. 따라서, 릿지 및 그루브의 폭뿐만 아니라, 다양한 형상의 다양한 사양을 충족하는 실리콘 마스터 설계를 변경하여 패터닝 할 수있다.

    나노 릿지의 크기는 또한 세포 및 조직의 행동에 영향을 미칠 것이다. 작은 홈의 폭은 홈에 작은 세포 침투 허용과 엔지니어링 나노 형상 2 세포의 상호 작용을 제한 할 수 있습니다. 이것은 차례로 심장 세포 단층의 이방성 행동의 정도를 변경한다. 또한, 제시된 프로토콜은 이차원 (2D) 세포 배양 및 정렬에 한정된다. 물론, 진정한 생체 모방 수, 엔지니어링 심장 조직은 3D가 될 필요가있다. 미래의 작업은 designin 필요합니다G 짙고 정렬 심장 조직을 functional3D. 여기에 제시된 프로토콜은, 그러나, 심장 세포 형태의 뛰어난 제어를 제공하며, 나노 큐를 기반으로 거시적 인 심장 조직의 기능을 제어 할 수 있습니다.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin BD Biosciences 354008
    NOA 76 Norland Products, Inc. 7606B
    Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) Minuta Tech
    PUA Minuta Tech MINS-311RM
    Soft Rubber Roller Speedball
    Silicon Wafers NOVA Electronic Materials FA01-9900
    Photoresist Shipley SPRT510
    Photoresist Developer Shipley MF320
    Electron-Beam Lithography System JEOL JBX-9300FS
    Etching System Surface Technology Systems NP10 8UJ
    Plasma Asher System BMR Technology Co. DSF-200
    Ozone Cure System Minuta Tech MT-UV-O- 08
    Fusion Cure System Minuta Tech MT-UV-A 11
    NOA 83H Norland Products, Inc. 8301
    Spin Coater Laurel Technology WS-400-6NPP
    Skyrol PET Film SKC Co., Ltd. 23038-59-9
    25 mm Glass Slides Corning 2948
    Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 6/5/2553
    Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich P2191-1G
    Chloroform Sigma-Aldrich 372978-1L
    500 g Weights Global Insustrial T9FB503120
    Isopropyl Alcohol EMD Millipore PX1835-2
    Hot Plate Corning PC-420D
    Sonicator Branson B2510MTH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
    2. Kim, D. -H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
    3. Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
    4. Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
    5. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
    6. Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
    7. Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
    8. Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
    9. Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
    10. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
    11. Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
    12. Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
    13. Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
    14. Kim, D. -H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
    15. Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
    16. Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
    17. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
    18. Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
    19. Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
    20. Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
    21. Mohrman, D. E., Heller, L. J. Cardiovascular Physiology. McGraw Hill Medical. (2010).
    22. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
    23. Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
    24. Qian, J. -Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
    25. You, M. -H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
    26. Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
    27. Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
    28. Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
    29. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
    30. Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
    31. Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
    32. Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
    33. Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
    34. Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
    35. Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
    36. Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
    37. Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
    38. Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
    39. Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
    40. Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
    41. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics