Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Macadangdang, J., Lee, H. J., Carson, D., Jiao, A., Fugate, J., Pabon, L., Regnier, M., Murry, C., Kim, D. H. Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (88), e50039, doi:10.3791/50039 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kardiyovasküler hastalık, dünya çapında ölüm 1'in önde gelen nedenidir. Kardiyak doku mühendisliği kalp rejenerasyonu hem de in vitro tarama deneyleri için fonksiyonel doku geliştirme amaçları çığır açan tıbbi keşifler sunmak için çok umut vermektedir. Ancak kalp dokusunun yüksek sadakat modelleri oluşturmak için yeteneği zor kanıtlamıştır. Kalbin hücre dışı matris (ECM) nanometre ölçeğinde 2 mikro-değişen hem de biyokimyasal ve biyomekanik sinyallerin oluşan karmaşık bir yapıdır. Mekanik yükleme koşulları ve hücre-ECM etkileşimleri Yerel son zamanlarda kalp doku mühendisliği 3-5 hayati bileşenleri olarak kabul edilmiştir.

Kardiyak ECM büyük bir kısmı bir doku mimarisi ve elektrik kuplajı 2 etkiler nano ölçekli çapları ile uyumlu kolajen liflerinin oluşmaktadır. Ne yazık ki, birkaç yöntem have nanometre ölçeğinde aşağı ECM liflerin organizasyonunu taklit etmek mümkün olmuştur. Nano sentezleme teknikleri son gelişmeler, ancak, kalp 6-9 ECM'nin in vivo yapısal ve alt-tabaka sertliği ipuçları taklit ölçeklenebilir iskelelerinin tasarım ve imalat sağlamıştır.

Burada gelişimini mevcut iki tekrar üretilebilir, düşük maliyetli ve biyo uyumlu polimer, poli (laktid-ko-glikolid) (PLGA) 8 ve bir poliüretan (PU) bazlı bir polimer kullanılarak kalp hücrelerinin işlevsel uyum için ölçeklenebilir nanopatterning işlemleri. Bu izotropik nanofabricated katmanlarından (ANFS) iyi organize, hizalanmış dokuların yatan ECM taklit ve hücre morfolojisi ve fonksiyonu 10-14 nanotopography rolünü araştırmak için kullanılabilir.

Bir şablon olarak nano tel (NP) silikon ana kullanarak, poliüretanakrilat (PUA) kalıp imal edilir. Bu PUA kalıp daha sonra pa için kullanılırsırasıyla UV-destekli veya solvent-aracılı kılcal kuvvet litografi (CFL), 15,16 yoluyla PU veya PLGA hidrojel ttern. Kısaca, poliüretan ya da PLGA ön-polimer, bir cam lamel ve PUA kalıp üzerine yerleştirilir üzerine uygulanan damladır. UV destekli cfl için, PU sonra tedavi için UV radyasyonu (λ = 250-400 nm) maruz kalır. , Çözücünün aracılık ettiği cfl için, PLGA ısı (120 ° C) ve basınçta (100 kPa) ile kabartılır. Sertleştirme sonrası, PUA kalıp hücre kültürü için bir ANFS geride bırakarak sıyrılır. Bu tür neonatal sıçan ventriküler miyositlerde, hem de insan pluripotent kök hücre-türevi kardiyomiyositlerde Birincil hücreler, ANFS 2 üzerinde korunabilir.

Introduction

Kardiyovasküler hastalık dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir ve zaten gergin küresel sağlık sistemi, 1,17 üzerinde ağır bir sosyo-ekonomik yükü sunuyoruz. (1) iskemik hastalık veya kardiyomiyopati sonra hasarlı miyokard yeniden veya (2) in vitro ilaç taraması veya hastalık modelleme için kalbin yüksek bir sadakat modeli oluşturmak için: Kardiyak doku mühendisliği iki ayrı hedefleri var.

Kalp vücuda kan sağlamak için sürekli çalışmak gerekir karmaşık bir organdır. Kardiyomiyositlerde ve destekleyici dokuların yoğun şekilde paketlenmiş laminar yapılar kalp duvarı 18,19 boyunca sarmal şablonlara göre düzenlenir. Kalp, aynı zamanda etkin bir şekilde elektro gövdesi 21'e kanı çıkarmak için yüksek koordineli bir şekilde 20 bağlanmıştır. Doğanın karmaşık tasarım güvenilir vitro değinmeyecek önce birkaç önemli engeller, ancak, ele alınması gerekmektedir.Sağlam kardiyomyosit farklılaşma yöntemleri 22 geliştirilmeye devam ediyor olmasına rağmen ilk, hPSC-CMs hala oldukça olgunlaşmamış fenotipleri gösterirler. Onların elektromekanik özellikleri ve morfolojisi en yakından fetal seviyeleri 23 maç. Geleneksel kültür koşullarında muhafaza İkincisi, kök hücre-türevi ve primer kardiyomiyositlerde hem doğal, doku benzeri yapılar halinde birleştirmek için başarısız. Bunun yerine hücreler, rasgele yönelimli olmak ve yetişkin miyokard 24'ün bantlı çubuk-şekilli bir görünüm göstermezler.

Hücrelerin etkileşim ile hücre dışı matris (ECM) ortamında çok sayıda hücresel süreçleri 11,13,25 önemli bir rol oynamaktadır. ECM önemli hücre 6,26 yapısını ve işlevini etkileyen karmaşık, iyi tanımlanmış moleküler ve topografik ipuçlarının oluşur. Kalp içinde, hücresel hizalama yakından yatan nanometre ölçekli ECM lifleri 2. izler. Bu nanotopograph etkisihücre ve doku işlevini üzerinde iCal ipuçları, ancak, uzak tamamen anlaşılmış değil. Nanometre ölçekli hücre-biyomateryal etkileşimi ön çalışmalar, 27 sinyalizasyon hücre, yapışma 28-30, büyüme, 31 ve farklılaşma 32,33 sub-mikron topografik ipuçlarının potansiyel önemini ve etkisini gösterir. Ancak, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir nanofabricated substratlar gelişmekte zorluk, bu tür çalışmalar, in vivo ECM ortamda kompleksinin çok ölçekli hücresel etkilerini yeniden olamazdı. Bu protokol, doğal kardiyak ECM fiber hizalama taklit eden hücre kültür yapı iskelesi üretmek için basit ve düşük maliyetli bir teknik nanofabrication kardiyomiyosit-biyomalzeme etkileşimlerinin yeni araştırmalar geniş bir yelpazede sağlayan, tarif edilmektedir. Kardiyomiyositler nano ECM çevre ile etkileşim nasıl anlamak daha yakından taklit yerli doku fonksiyon hücresel davranışını kontrol yeteneği için izin verebilirtion. Bundan başka, hücre tekli-tabakaları 3D yapıları ile karşılaştırıldığında basitleştirilmiş bir deneysel sistem ama yine de anlaşılır araştırma ve fonksiyonel tarama 2,34-36 için karmaşık çok-hücresel davranışı sergiler. Son olarak, iskeleler rejeneratif amaçlı 37 için kalp içine implante zaman hücresel greft fonksiyonunu artırmak için kullanılan olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler, oda sıcaklığında (~ 23 ° C) gerçekleştirilir.

Silikon Master 1. Fabrikasyon

  1. O 2 / N 2 gaz altında% 100 etanol veya ksilen ve kuru temiz silikon gofret.
  2. Bir 0.3-0.5 mikron kalınlığında bir film üretmek için 2000-4000 rpm dönüş hızında spin-lak silikon gofret yerleştirin.
  3. Bir fotolitografi sistemi kullanılarak Pattern doğru boyutları ile filmin fotorezist
  4. Tam fotorezist geliştirme çözeltisinin uygun bir hacmi içinde desenli fotorezist kaplanmış silikon gofret bırakın.
  5. Iyonu giderilmiş su ile geliştirilmiş fotorezist kaplanmış silikon gofret durulayın.
  6. Yakın dikey yan duvarları, derin reaktif iyon etche bir aşındırma sistemini kullanarak maruz silikon ile alt-mikron ölçeği sırtlar dizileri oluştururlar.
  7. Bir plazma asher sisteminde silikon gofret yerleştirilerek kalan fotorezist çıkarın.
  8. W silikon Cutsonraki çoğaltma kalıplama için uygun büyüklükte silikon ustaları içine bir elmas uçlu kesici ile afers.

Silikon Master PUA Kalıp 2. Fabrikasyon

NOT: nano fabrikasyon için silikon ana eklenecek Volume poliüretan akrilat (PUA) çözeltisi viskozitesi gibi çoğaltılması için nano tel ana alanına bağlı olarak değişecektir.

  1. % 100 etanol ya da O 2 / N 2 gaz altında ksilen ve kuru temiz silikon ana yüzey.
  2. Bir Petri kabındaki silikon ana desen tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
  3. 2 cm x 2 cm yüzey model, model yüzeyine PUA pipetle 40 ul bir silikon ana için.
  4. 4 cm tevzi PUA üzerinde x 4 cm saydam polyester (PET) film, bir yaprak yerleştirin.
  5. Aşağı PET kağıda basın ve böylece (örneğin bir kart gibi) bir rulo veya düz kenarlı yüzey kullanarak desen yüzüne levha altında PUA yayıldı tümmodel PUA ön-polimer ile kaplıdır.
  6. 50 saniye boyunca yaklaşık olarak 10 cm bir 20 Watt (115 V) UV ışığına (λ = 365 nm) altında silikon ana, Prepolimeri ve PET yerleştirin. Etkili olabilmesi için, UV ışık dalga boyu 310-400 nm arasında herhangi bir yerde olabilir. Işığın yoğunluğu, substratın yüzeyinde 10-15 mW / cm 2 'dir.
  7. Sertleştikten sonra, forseps ile yavaşça PET filmi çıkarın. PUA silikon ana nanopattern bir negatifi ile PET film eklemek gerekir.
  8. Kullanımdan önce en az 12 saat boyunca UV altında PUA / PET nanopatterns Cure. Aşırı pozlama bir sorun değildir.
  9. Silikon ustaları temizlemek için, PUA ilavesi olmadan ana üstüne PET'in başka bir film yer ve 50 saniye boyunca UV ışığı (λ = 365 nm) maruz ve PET filmi çıkarın. Bu, herhangi bir reaksiyona girmemiş monomerler kaldırır.
  10. O 2 / N 2 gaz altında% 100 etanol veya ksilen ve kuru ile silikon ana durulayın.

3a. Poliüretan polimer Nanopatterning

  • 10 dakika boyunca, bir ozon işleme odası içinde yerleştirilmesi ile 25 mm çapında yuvarlak bir cam slaytlar hazırlayın.
  • Kolay kullanım için küçük PDMS blok üzerine ozon tedavi cam slaytlar yerleştirin.
  • Cam slaytlar fırça ile yüzeye yapışma yükseltici ince bir tabaka uygulayın. 30 dakika boyunca hava kuru bir cam kayar.
  • Yazıcı bir kağıt parçası üzerinde cam slayt yerleştirin.
  • Cam slayt merkezine pre-polimer (NOA 76) 10 ul poliüretan (PU) dağıtmak bırakın. Kabarcıklar ek sonra mevcut olduğundan emin olun.
  • Sıra PUA kalıp, desen cam slayt üzerine, yüzüstü. Muntazam PUA kalıp boyunca kauçuk bir silindir merdane yuvarlayarak cam slayt yüzeyine karşı PU dağıtılır. Yazıcı kağıt polimer taşma absorbe edecektir.
  • Watt UV lamba. PU polimerizasyon zamanı UV kaynağının gücüne bağlıdır.
  • UV ışık kaynağından gelen bir numune alın ve dikkatli bir PU kaplı cam slayttan PUA kalıp soyma. PU polimerizasyon c kabul ediliromplete uzak temiz numuneden PUA kalıp peeling ve PU cam slayt bir yanardöner bir görünüme sahip olduğunda.
  • Sürece bir ay olarak depolama için desikatörde tamamladı örnekleri yerleştirin.
  • 3b. Nanopatterning Poli (laktid-ko-glikolid) Hidrojel

    1. Kuvvetli bir 10:01 oranında silikon elastomer taban ve silikon elastomer sertleştirme ajanı karıştırılarak düz PDMS kalıp oluşturma.
    2. (PDMS 5 mm kalınlığında olacak şekilde yani) PDMS öncü yemeğin kenarından 5 mm kadar ulaşır, böylece karışık PDMS bir Petri kabı içine çözüm habercisidir dökün.
    3. Gaz çıkışı için 1 saat boyunca bir kurutucu içinde Petri çanağı ve PDMS öncü yerleştirin.
    4. Tedavi için en az 2 saat boyunca 65 ° C fırın içine Petri çanağı ve PDMS ön-hareket ettirin.
    5. PDMS tedavi edildikten sonra, 3 cm x 3 cm kare bölümler halinde düz PDMS kesmek için bir jilet kullanın. Bu desenleme işleminde sonra kullanılan düz PDMS kalıplar olacak.
    6. Pl tarafından temiz 25 mm çaplı yuvarlak cam slaytlarbir su sonikatöre 30 dakika boyunca, izopropil alkol içinde yüz oluşturma.
    7. O 2 / N 2 gazı altında kuru temizlenmiş cam slaytlar.
    8. Damla PLGA solüsyonu 100 ul dağıtılması cam slayt üzerine (% 15 w kloroform içerisinde PLGA v /).
    9. Çözücü emer ve düz bir PLGA yüzey elde etmek için satış makinası veya ATM PLGA üstüne düz bir PDMS kalıp yerleştirin. 5 dakika boyunca PDMS üstüne bir 200 g ağırlık yerleştirerek bir hafif bir basınç (~ 10 kPa) uygulanır.
    10. Yavaş yavaş düz PDMS kalıp soyma ve çözgen kalıntılarını uzaklaştırmak ve PLGA ve cam kapak arasındaki yapışmayı geliştirmek için, 5 dakika için önceden ısıtılmış bir plaka (120 ° C) üzerine cam kapak yerleştirin.
    11. Düz PLGA üstüne NP PUA kalıp yerleştirin ve PUA kalıp üstünde bir 1 kg ağırlık yerleştirerek sabit bir basıncı (~ 100 kPa) ve ısı (120 ° C) 15 dakika boyunca uygulanır ısıtma plakası üzerinde iken.
    12. PLGA kapak slayt ağırlık kaldırmak ve katmanlarından oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Katmanlarından kanıtlanıncaya kadar PUA kalıp çıkarmayınsoğutuldu.
    13. Katmanlarından yeterince soğutulduktan sonra, dikkatlice NP PLGA alt katmanı ortaya, NP PUA kalıp soymak. NP PLGA taban bir yanardöner bir görünüme sahip olmalıdır.
    14. Sürece bir ay olarak depolama için desikatörde tamamladı örnekleri yerleştirin.

    4. Hücre Tohum ve Kültür

    Not: Bu protokol, neonatal sıçan ventriküler miyositlerde (NRVMs) ve H7 insan embriyonik kök hücre türetilmiş kardiyomiyositler (HESC-cm), ancak diğer hücre kaynaklarına kültür açıklar kullanılabilmektedir.

    1. 35 mm doku kültürü polistiren çanak ANFS lamelleri (PU veya PLGA) takın. Tabağın tabanına ve yavaşça Norland Optik Yapıştırıcı (NOA83H) Pipet 20 ul NOA üstüne ANFS lamel yerleştirin. Tutkal yaymak ve tüm lamel alt kapağı için izin verin. 10 dakika boyunca UV çanak teşhir ederek NOA Cure.
    2. Iki kez, 5 dakika boyunca% 70 sulu etanol çözeltisi, 2 ml ile durulanarak ANFS sterilize edin. E çıkarmakaspirasyonu ile etano. İzin ANFS biyolojik güvenlik kabini UV sterilizasyon lambası (λ = 200-290 nm) altında ~ 1 saat boyunca tamamen hava kuru için.
    3. Hücre yapışma gece boyunca fibronektin içerisinde ANFS kaplanmasıyla geliştirilmiştir. 5 ug / ml DI su içinde fibronektin seyreltin. Çanak içine fibronektin çözeltisi pipetle 2 ml. 37 ° C'de inkübatör yerleştirin ve% 5 CO2, gece boyunca (en az 6 saat).
    4. Önceki protokollerle 22 göre NRVMs, HESC-CMS, ya da diğer ilgi kalp hücreleri elde.
    5. Hücreleri peletlemek için 3 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj hücre örneği.
    6. Dikkatle aspirasyon ile süpernatant kaldırmak. Pelet rahatsız değil emin olun.
    7. 4.6 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar, uygun bir kültür ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
    8. Dikkatle sterilize ANFS üzerine hücre süspansiyonu 200 ul pipet. Emin hücre süspansiyonu lamel kalır emin olun.
    9. 37 ° C ve% 5 inkübatörde hücreleri yerleştirinCO hücreleri ANFS takmak için izin 4 saat için 2.
    10. Aynı koşullar altında kuluçka makinesi içinde hücrelerin çanak ve değiştirmek için sıcak kültür ortamı içinde 2 ml ilave edilir.
    11. 24 saat sonra ortamını çıkarın ve fazla hücreleri çıkarmak için iki kez 2 ml DPBS ile yıkayın.
    12. Aynı koşullar altında kuluçka makinesi içinde hücrelerin çanak ve değiştirmek için sıcak kültür ortamı içinde 2 ml ilave edilir. Kültür hücreler çoğalmak üzere. Her gün medya değiştirin.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Şekil 1, bu iki üretim yöntemleri için üretim işleminin şematik bir bakıştır. Nedeniyle nano topografya kaynaklanan ışığın kırınımı ile, nanopatterning ANFS yanardöner bir yüzey ile sonuçlanmalıdır. 2 800 nm sırt ve yiv ile iyi desenli 25 mm NP-PU lamel (Şekil 2A) Bu yanardöner yüzey tasvir etmektedir Genişlik (Şekil 2B). ANFS ve yanardöner görünüm sırt ve oluk genişlikleri bağlı olarak biraz değişir.

    ANFS üzerine hücreleri tohumlama sonra, hücreler, substratın sırtlar ile paralel yönde hizalamak başlamalıdır. Hizalama tohumlama sonra ilk 24 saat içinde belirgin olmalıdır ve. 3 kültür 48 saat sonra kültür ve HESC-CMS 7 gün sonra NRVMs temsilcisi parlak alan görüntüleri göstermektedir kültür süresinin bütünlüğü için kalmalıdır. NRVMs birdesensiz yüzeylerde kardiyomiyositlerde rastgele (Şekiller 3A ve 3C) yönlendirilmiş olduğu, oysa nd HESC-CMs NP yüzeyleri üzerinde belirgin yapısal anizotropi ve hizalama (Şekiller 3B ve 3D) gösterir. Immünohistokimyasal analizi hücre sitoskeletal hizalama nanotopography etkisini vurgulamaktadır. Aktin mikrofilamanlar (F-aktin) ile nano-sırtlar boyunca hizalanmış ancak rastgele desensiz alt grupları ile ilgili hücreleri (Şekil 4) dağıtılan kalır hale ANFS üzerinde kültürlenmiş hücrelerde α-sarkomerik aktinin. Kalp hücreleri kültür 24-48 saat sonra kendiliğinden dayak sergiler.

    Şekil 1
    Şekil 1.   Nanofabrication şematik - iki Nanofabrikasyona Prosesus diyagramıesses. Çözücü-aracılı CFL tasvir (- B - D) (Y E) ise Tasvir, kılcal kuvvet litografi (CFL) UV-destekli. (A) PUA negatif bir silikon master yapılır. (B) ön-polimer, PU açılan tevzi bir cam slayt ve PUA kalıp üzerine üstüne yerleştirilir olduğunu. (C) Bir PUA kalıp ve PU lamel sonra PU tedavi için UV ışığına maruz kalmaktadır. (E) PLGA polimer çözeltisi damla çıkartılan bir cam slayt üzerine ve düz bir PDMS kalıp düz bir PLGA bir yüzey oluşturmak için kullanılır. (F) bir PUA kalıp düz PLGA üzerine yerleştirilir ve (G) sabit ısı ve basınç PLGA içine sıcak kabartma NP uygulanır. (D, H) PUA kalıp uzak soyulması sonra, NP-PU veya PLGA substrat geride. Kardiyak hücreler daha sonra hücrelerin hizalanmış diziler oluşturmak için bu NP yüzeyine numaralı seribaşı olabilir.


    Şekil 2.. NP-PU substrat. (A) büyük bir alan NP yüzeyi Fotoğraf. Lamel yanardöner görünüm nanotopography neden olur. Temel nanotopography enine kesitinin (B) SEM görüntüsü.

    Şekil 3,
    NRVMs Şekil 3.. Bağlantısızlar kardiyomiyositler. 10X parlak alan görüntüleri kültür 7 gün sonra (A, B) ve HESC-CMs kültürün 2 gün (C, D) sonra. NRVMs düz yüzeylerde PU (A) NRVMs rastgele hizalanmış ise (B) belirgin yapısal uyum sergileyen NP-PU yüzeylerde kültüre. (B) ve (D) 'de oklar NP anizotropi yönü gösterir. = 100 mikron ölçekli bar.

    Şekil 4,
    .. Şekil 4 Immunofluorescent konfokal görüntüleme Hücre sitoskeletal hizalama ve çizikleri; α-sarkomerik aktinin (kırmızı), hücre çekirdekleri (mavi), ve F-aktin (yeşil). Düz katmanlarından kültüre hücreleri rastgele lifleri odaklı iken NP yüzeylerde kültür hücreleri α-aktinin sarkomerik ve F-aktin lifleri uyumlu hale getirmiştir. Kırmızı α-aktinin sarkomerik kanalda vaziyettedir açıkça çizgili sarkomerlerin göstermektedir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Fonksiyonel olgun kardiyak dokular in vivo ve kardiyak doku mühendisliği in vitro uygulamalarda hem eksiktir. Burada anlatılan CFL Nanofabrikasyona yöntemler hücresel uyumun sağlanması nedeniyle sistemin ölçeklenebilirlik makroskopik doku işlevini etkilemek için güçlü teknikler vardır. Büyük alanlar kolayca desenli ve hücre kültürü için de kullanılabilir. Makroskopik hücresel hizalama biomimetic, o miyokardın 38 mekanik ve elektrik hem özelliklerini etkiler gibi fonksiyonel doku oluşturmak amacıyla kalp doku mühendisliği esastır.

    Buradaki yöntemler, kalp doku mühendisliği içinde geniş bir uygulama yelpazesi için uygulanabilir. Daha önce nano ölçekli ipuçları bir kardiyak kök hücre niş oluşturmak ve rejenerasyon 14 teşvik etmek için yardımcı olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle bu tür PLGA gibi biyolojik olarak parçalanabilen polimerler kullanarak, nano tel "yamalar" teşvik etmek için yapılabilirkardiyak ataktan sonra iyileşme. Alternatif olarak, doğal kalp gibi benzer elastik modülüne sahip hidrojeller ile, kardiyomiyosit-ECM etkileşimleri basitleştirilmiş yeniden üretilebilir sisteminde incelenebilir.

    Bu tür microcontact baskı, Elektrospinning ve microtopography gibi çeşitli diğer yöntemler, daha önce mikro 39-41 üzerinde işlenmiş kardiyak doku yapısını kontrol etmek için kullanılmıştır. Bu teknikler, hücre hizalama kazanma başarılı kanıtlamış olmakla birlikte, bu in vivo kalp dokusunun yapısı ve fonksiyonu, ECM'nin daha küçük, nanotopographical ipuçları ile yönetilir ve böylece bizim NP alt-tabaka avantajlı ispatlamalıdırlar olasıdır. Ayrıca, bu mikro desenlendirme teknikleri, izotropik nanofabricated yüzeylere nazaran doğasında dezavantajları var. Örneğin, bizim nanopatterning yöntem daha uygun maliyetli ve daha Elektrospinning kontrol edilebilir. Microcontact baskı, diğer taraftan, relyapısal anizotropiye kazanmak için belirli şeride yapışan hücreler üzerinde ies. Işlevsel bir tek tabaka oluşturmak için, hücreler, daha sonra prolifere gerekir ya da sıkı bağlantı yerleri meydana getirmek, bu şerit üzerinden geçirilir. Bu çok daha zor gibi neonatal kardiyomiyositlerin hiçbir çoğalma kapasitesi az olan hücreler içindir. Microtopography da sıkı bir şekilde bağlanmış hücre mono tabakaları oluşturmak için yetersizlik ile sınırlıdır. Nedeniyle microtopography ile karşılaştırıldığında hücrelerin ölçeğine hücreler, üstüne ya da içine microridges bulunur. Bu hücre-hücre etkileşim miktarını sınırlar ve hücre-hücre bağlanmasını azaltır. Bizim yöntemi ile, hücreler Biyolojik Tabanlı Akıllı nano-ölçekli topografya aracılığıyla uyumlu olmak ve özellik boyutları en az hücrelerin kendilerini daha küçük büyüklükte bir sipariş olarak serbestçe komşu hücreleri ile etkileşebilir. Bu sıkı bağlı hücre mono tabakaları oluşturulabilir, daha biomimetik sağlar.

    NP-PU ile optimum sonuçlar için şiddetle g uygulamanızı öneririzlass lamel ön arıtma adımlar. Bu adımlar, cam yüzeyine polimer yapışmasını artırır. Bu sadece imalat sırasında olacak PUA ustanın temiz uzaklaştırılmasında yardımcı değil, aynı zamanda deney sırasında cam ayırma gelen polimer desenli önler. Ön arıtma adımlarının etkinliğini test etmek için, su içinde bir NP-PU yerleştirilmesidir ve polimerin cama yapışık kalırsa görüyoruz.

    PLGA glikolik asit ve cihaz ve in vivo ilaç dağıtım hem de geliştirilmiştir laktik asidin bir ko-polimeridir. Bu nedenle, bu alt tabaka hücreleri için iyi, biyo-uyumlu bir ECM sağlar. PLGA sertliği, laktik asit ve glikolik asit oranı ayarlama ya da ya da kloroform içinde PLGA daralma değiştirilmesiyle modüle edilebilir.

    Çeşitli parametreler kolayca optimizasyonu veya araştırma amaçlı bu sistemde değişik ve ayarlanabilir. Çeşitli poliüretan esaslı polimerler, geniş bir aralık mevcutturmekanik özellikleri. Bu nedenle, farklı PU ön polimerleri kullanarak, çeşitli alt-tabaka katılıkları, aynı protokol ile imal edilebilir. Kullanıcı, aynı zamanda alt-tabaka topografya değiştirebilir. Substratın nanotopography silikon ana tasarımına bağlıdır. Bu nedenle, sırt ve oluk genişlikleri, yanı sıra çeşitli geometrilere, çeşitli özelliklerini karşılamak için silikon ana tasarımını değiştirerek desenli olabilir.

    Nano-nervürlerin boyutu, aynı zamanda hücre ve doku davranışını etkileyecektir. Daha küçük oluk genişlikleri oluklar içine daha az hücre penetrasyon için izin ve mühendislik nanotopography 2 ile hücrenin etkileşimi sınırlamak. Bu da kardiyak hücre mono tabakasının anizotropik davranışın ölçüde değiştirecektir. Buna ek olarak, sunulan protokol, iki boyutlu (2B), hücre kültürü ve hizalama ile sınırlıdır. Açıkçası, gerçekten biomimetik olduğu, mühendislik kalp dokusu 3D olması gerekir. Gelecekteki çalışmalar designin için gereklig yoğun ve uyumlu kalp dokusunu functional3D. Burada sunulan protokol, ancak, kalp hücre morfolojisi kontrolünü sunar ve nano ölçekli ipuçları dayalı makroskopik doku kalp fonksiyonunun kontrol sağlar.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin BD Biosciences 354008
    NOA 76 Norland Products, Inc. 7606B
    Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) Minuta Tech
    PUA Minuta Tech MINS-311RM
    Soft Rubber Roller Speedball
    Silicon Wafers NOVA Electronic Materials FA01-9900
    Photoresist Shipley SPRT510
    Photoresist Developer Shipley MF320
    Electron-Beam Lithography System JEOL JBX-9300FS
    Etching System Surface Technology Systems NP10 8UJ
    Plasma Asher System BMR Technology Co. DSF-200
    Ozone Cure System Minuta Tech MT-UV-O- 08
    Fusion Cure System Minuta Tech MT-UV-A 11
    NOA 83H Norland Products, Inc. 8301
    Spin Coater Laurel Technology WS-400-6NPP
    Skyrol PET Film SKC Co., Ltd. 23038-59-9
    25 mm Glass Slides Corning 2948
    Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 6/5/2553
    Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich P2191-1G
    Chloroform Sigma-Aldrich 372978-1L
    500 g Weights Global Insustrial T9FB503120
    Isopropyl Alcohol EMD Millipore PX1835-2
    Hot Plate Corning PC-420D
    Sonicator Branson B2510MTH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
    2. Kim, D. -H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
    3. Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
    4. Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
    5. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
    6. Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
    7. Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
    8. Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
    9. Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
    10. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
    11. Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
    12. Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
    13. Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
    14. Kim, D. -H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
    15. Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
    16. Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
    17. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
    18. Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
    19. Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
    20. Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
    21. Mohrman, D. E., Heller, L. J. Cardiovascular Physiology. McGraw Hill Medical. (2010).
    22. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
    23. Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
    24. Qian, J. -Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
    25. You, M. -H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
    26. Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
    27. Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
    28. Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
    29. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
    30. Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
    31. Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
    32. Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
    33. Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
    34. Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
    35. Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
    36. Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
    37. Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
    38. Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
    39. Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
    40. Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
    41. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics