2-Gefäßverschluss / Hypotonie: Eine Ratte Modell der globalen Hirnischämie

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Summary

Bilaterale Carotisokklusion mit systemischer Hypotonie gekoppelt produziert globales Gehirn Ischämie bei der Ratte, was zu einer Beschädigung des Hippocampus mit reproduzierbaren Schwere. Tier Probanden mit vorhersagbaren Mustern der Hirnschädigung beeinträchtigt sind, erholen sie zweckmäßig und Mortalitätsraten sind vergleichsweise gering.

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Sanderson, T. H., Wider, J. M. 2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia. J. Vis. Exp. (76), e50173, doi:10.3791/50173 (2013).

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Abstract

Herzstillstand nach Reanimation folgte oft zu dramatischen Hirnschäden durch Ischämie und anschließende Reperfusion des Gehirns verursacht. Globale Hirnischämie produziert Schäden an bestimmten Gehirnregionen gezeigt werden, sehr empfindlich auf Ischämie 1. Hippocampusneuronen höhere Empfindlichkeit gegenüber ischämischen Insulten Vergleich zu anderen Zellpopulationen, und zwar ist der CA1-Region des Hippocampus besonders anfällig für Ischämie / Reperfusion 2.

Das Design von therapeutischen Eingriffen oder Analyse von Mechanismen in Hirnschädigung beteiligt, erfordert ein Modell, das ähnliche Schädigungen der klinische Zustand und in reproduzierbarer Weise erzeugt. Bilaterale carotis Gefäßverschluss mit Hypotonie (2VOH) ist ein Modell, das reversible Vorderhirn Ischämie erzeugt, emuliert die zerebrale Ereignisse, die während Herzstillstand und Reanimation auftreten können. Wir beschreiben ein Modell von Smith et al modifiziert. (1984) 2Als erster in seiner jetzigen Form in Sanderson et al. (2008) 3, die reproduzierbare Verletzungen produziert, um selektiv anfällig Hirnregionen 3-6 vorgestellt. Die Zuverlässigkeit dieses Modells wird durch eine präzise Steuerung der systemischen Blutdrucks während angewandt Hypotonie, die Dauer der Ischämie, genaue Temperaturregelung, einem bestimmten Regime Anästhesie und fleißig post-operative Betreuung diktiert. Eine 8-minütige ischämischen Insult produziert Zelltod von Neuronen im Hippocampus CA1, die im Laufe von 6 bis 24 h Reperfusion fortschreitet, während weniger anfällig Hirnregionen verschont werden. Diese progressive Zelltod leicht nach 7-14 Tagen von Reperfusion quantifiziert, wie ein nahezu vollständigen Verlust der CA1-Neuronen ist zu dieser Zeit zeigt.

Zusätzlich zu dieser Hirnverletzung Modell präsentieren wir eine Methode zur Quantifizierung CA1 Schaden mit einem einfachen, aber dennoch gründliche, Methodik. Wichtig ist, dass die Quantifizierung unter Verwendung einer einfachen Kamera angebrachten Mikroskop werden, einda freie ImageJ (NIH) Software-Plugin, wodurch die Notwendigkeit für kostspielig stereology Software-Programme und eine motorisierte mikroskopischen Bühne für Schadensgutachten.

Introduction

Hirnschäden als Folge von Herzstillstand und Schlaganfall ist eine der häufigsten Ursachen für Tod und langfristige Behinderung. Während Reanimation für Opfer von Herzstillstand erfolgreich bei der Wiederherstellung der spontanen Zirkulation in etwa 70.000 Patienten pro Jahr in den USA 7,8 mindestens 60% dieser Patienten wurden anschließend im Krankenhaus sterben als Folge der umfangreichen Hirnschäden und nur 3-10% von wiederbelebt Patienten können wieder ihre frühere Lebensweise 9,10. Klar, das Verständnis der Mechanismen, die zu Hirnschäden führen folgende globale Gehirn Ischämie und Gestaltung therapeutische Interventionen zur neurologischen Trauma minimieren ist von entscheidender Bedeutung.

Hirnischämie modelliert Verwendung mehrerer Methoden werden. Am häufigsten wird Hirnischämie in das Nagetier durch Verschließen eines großen Blutgefäßes im Gehirn, der mittleren Hirnarterie produziert, wodurch eine fokale ischämische Schlaganfall 11,12. Während klinisch wichtig,Schwerpunkte Hirnischämie ist nicht eine genaue Methode, um Hirnschäden durch Herzstillstand / Wiederbelebung produziert studieren. Um dieses klinische Paradigma modellieren das gesamte Gehirn muss gefolgt von ischämischen Wiedereinführung des Blutflusses werden. Um genau imitieren diese klinische Präsentation, Ermittler experimentell induzieren Herzstillstand durch Reanimation mit CPR und Defibrillation 13,14 gefolgt. Dieses Modell ist klinisch relevant, können aber unberechenbar Reanimation mal erhöhen Variabilität und kann machen Datenanalyse schwer zu interpretieren. Darüber hinaus ist dieses Modell mit einer hohen Sterblichkeitsrate verbunden, eine weitere Erhöhung Tierzahl notwendig, um eine Hypothese zu testen. Untersuchung der zerebralen Reaktion auf die globale Ischämie und / oder Reperfusion in einer reproduzierbaren, konsistente und überlebensfähig Beleidigung bevorzugt werden.

Globale Ischämie im Gehirn induziert werden unter Beibehaltung einige Blutfluss systemisch. Dies senkt die Mortalität, während es investigation der Mechanismen von Gewebeschäden im Gehirn 2. Um globale Hirnischämie erzeugen, ist es notwendig, zu unterbrechen oder zu stark einschränken fließen in alle vier Schiffe, die das Gehirn, die internen Halsschlagader und Vertebralarterien liefern. Diese Gefäße versorgen das Gehirn mit der Blutfluss durch eine vaskuläre Struktur namens Circle of Willis, der eine Schleife bildet Anastomosen. Diese Architektur ermöglicht vaskulären das Gehirn, um die Perfusion bei proximalen Gefäßverschluss behalten. Daher müssen, um eine vollständige Ischämie des Gehirns, den Blutfluss durch alle beitragsfreien Schiffe induzieren auftreten. Halsschlagader Okklusion kann unter Verwendung eines minimal-invasiven ventralen Hals abgespeckte und Anwendung von Aneurysma-Clips für einen gewünschten Zeitraum werden. Unterbrechung des Blutflusses über die Vertebralarterien kann schwierig sein, da sie in der Querrichtung Foramina der Wirbelsäule sind incased. Forscher haben dies durch die electrocauterizing Vertebralarterien 24-48 hr adressiert vor carotisOkklusion und Hirnischämie (4VO Modell) 15. Im Gegensatz zu diesem Ansatz entwickelten Smith et al. Ein Verfahren zur Induktion der globalen Gehirn Ischämie durch eine Verringerung des mittleren arteriellen Blutdrucks (MAP) systemisch zu 40 mmHg, um die Perfusion durch die Vertebralarterien reduzieren bis zu einem Punkt, wo die Durchblutung verloren oder stark reduziert 2 . Wenn mit Carotisokklusion gekoppelt ist, erzeugt dieses Verfahren Ischämie gesamten Vorderhirn, was zu einem Muster von Hirnschäden, die eng ahmt die Herzstillstand Überlebenden. In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens, so verlangt das Modell präsentieren wir hier fest MAP Regulierung bei 30 mmHg ± 1mHg während der gesamten 8 min der Ischämie. Wir fanden diese Änderung verbessert die Reproduzierbarkeit der Hirnschädigung durch dieses Modell induziert und gleichzeitig die niedrige Mortalitätsrate der ursprünglichen Technik, die von Smith et al konzipiert.

Die genaue Phänotyp von Zelltod und Gesamtausmaß von Gewebeschäden verursacht durchdas hier vorgestellte Modell sind direkt abhängig von ischämischen Dauer 16. Nach 8 min der Ischämie weisen CA1 Neuronen verzögert Zelltod, was darauf hindeutet, dass es eine zeitliche Fenster für eine therapeutische Intervention während der Reperfusionsphase 15,17. Zu Beginn der Reperfusion Neuronen schnell wieder Funktion und keine unmittelbare Zelltod nachweisbar ist 18. Doch diese Beleidigung verursacht Induktion des Zelltods Kaskaden (Apoptose), die ihren Höhepunkt in der Veröffentlichung apoptogene Proteine ​​aus den Mitochondrien, einschließlich Cytochrom c, zwischen 4-6 h Reperfusion 3,19. Zwischen 6 und 24 h Reperfusion wurden Neuronen des Hippocampus CA1 zu Zelltod begangen, und die Apoptose-Programm 19 ausgeführt. Es sollte angemerkt werden, dass der Zelltod-Phänotyp verantwortlich für ischämische Schädigung höchst umstritten ist werden. Frühe Studien haben vorgeschlagen, Nekrose ist die primäre Zelltod Phänotyp 20,21, während andere andere apopt berichtenosis als wichtigste Mechanismus 22,23. Insgesamt deuten aktuelle Hinweise, dass die Zellen von einem Spektrum von Zelltod Phänotypen von der klassischen Apoptose zur Nekrose sterben. Die spezifische Art des Zelltods ist von vielen Faktoren abhängig, wobei der Wert des Beitrags der einzelnen Phänotyp in Abhängigkeit von der Schwere der Insult, neben anderen Faktoren 24,25. Nach 24 Stunden der Reperfusion, besitzen sterbenden Zellen pyknotische Kerne, Kondensmilch Cytosol mit klaren Beweisen von aggregierten zellulären Inhalte und Verlust der funktionellen mitochondrialen Morphologie. Tote Zellen werden weiter abgebaut, verschlungen von Immunzellen wie Makrophagen und / oder Mikroglia und gelöscht aus der CA1 Region des Hippocampus. Nach 4-7 Tagen der Reperfusion, werden abgestorbene Hautzellen entfernt und alles, was bleibt sind Entzündungszellen und aktiviert Gliazellen 17,26. Somit stellt 7 Tagen nach Reperfusion eine optimale Zeit, in hippocampalen CA1 neuronalen Tod quantifiziert mit einfachen, nicht-spezifische Zelle in Flecken werdeneinschließlich Kresylviolett oder Hämotoxylin-Eosin und gezählt basierend auf morphologischen Einschlusskriterien. Verbleibenden Zellen zu dieser späten Reperfusion Intervall kann überlebenden Zellen gezählt werden, wodurch ein Index von Hirnschäden.

Wenn dieses Modell genutzt werden, um therapeutische Interventionen zu testen, wird vorgeschlagen, dass das experimentelle Design STAIR Kriterien (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) 27 folgen. Diese Richtlinien befolgt werden sollten bei der Konzeption und Durchführung einer Studie, werden jedoch hier nicht diskutiert.

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Protocol

1. Vorbereitung

Alle Tierversuche müssen die institutionellen Richtlinien entsprechen und erhalten Genehmigung durch einen entsprechenden Tierpflege Ausschuss vor Beginn. Alle hier vorgestellten Verfahren wurden von der Wayne State University Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Ausschuss und befolgen Sie die Anweisungen auf die ethische Behandlung von Tieren, wie in dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und an die US-Regierung Grundsätze für die Put- Nutzung und Pflege der Wirbeltiere in Testing, Forschung, Aus-und Weiterbildung eingesetzt. Vor Beginn der Operation vorzubereiten erforderlich chirurgisches Material und eine Operation Erholung Käfig. Dieses Verfahren ist ein Überleben der Operation, und es ist daher notwendig, sterile Technik zu üben.

  1. Um eine Gefäßkatheter machen, schneiden Sie ein 8-Zoll-Länge von 50 Polyethylen (PE50) Schlauch und legen Sie eine abgestumpfte 23-Gauge-Nadel in ein Ende. Katheter können einzeln erworben werden vorsterilisiert oder gekauft in bulk und dann mit Ethylenglykol sterilisiert nach Bedarf.
  2. Sichern Sie diese Nadel auf einem Port eines Drei-Wege-Hahn und legen Sie eine weitere Drei-Wege-Hahn auf der gegenüberliegenden Port. Heparinisierung die Hähne und Katheter durch Ausführen Heparin Salzlösung durch. Schließen Sie eine 10 ml Spritze Kochsalzlösung auf den Hahn senkrecht und distal des Katheters. Schließen Sie den Hahn distal des Katheters mit dem Druckwandler Rohr, füllen Sie das System mit Kochsalzlösung und entfernen Sie alle Luftblasen.
  3. Richten Sie den Käfig Erholung im Einklang mit Tiernutzung Vorschriften. Der Aufwachraum sollte ruhig und haben wenig Verkehr. WICHTIG Schalten Sie den Absaugtisch oder ähnliche Gasspülmittel System vor Beginn der Operation, um verdampft Isofluran filtern.

2. Chirurgische Vorbereitung

Sprague-Dawley-Ratten (300-350 g) werden in der 2VOH Modell der globalen Vorderhirn Ischämie. Anästhesie induziert wird und mit Isofluran aufrechterhalten und unterstütztErgänzt mit einem Sub-dissoziativen Dosis von Ketamin. Wir haben beobachtet, dass Narkose durch Isofluran allein gepflegt ein erhöhtes Auftreten von Krampfanfällen während der post-op Erholung verursacht. Anfälle können zu Nervenschäden und Mortalität, die die Reproduzierbarkeit dieses Modells auswirken beitragen wird. Ergänzend Anästhesie mit Ketamin ermöglicht eine viel geringere Dosis von Isofluran ein chirurgischer Qualität der Anästhesie zu erreichen. Mit einem homöostatischen Wärmedecke ermöglicht strenge Regulierung der Kerntemperatur. Der chirurgische Eingriff birgt Halsschlagader cut-down und Isolation und Arteria femoralis cut-down und Kanülen.

HINWEIS Es ist wichtig, detaillierte Aufzeichnungen während jeder einzelnen chirurgischen Eingriff zu halten. Änderungen der Kerntemperatur, Blutdruck, oder andere physiologische Variablen, die vor oder während der Operation auftreten kann drastisch verändern Ergebnisse und Aufzeichnungen analysiert werden, um sicherzustellen, dass prozedurale Konsistenz zwischen Individuen und Gruppen werden. Konsistenzin den physiologischen Parameter des Tieres durch Fasten die Tiere vor der Operation verbessert werden. Experimentatoren sind aufgefordert, die Methode, die in der beständigsten pre-betriebenen Hämodynamik und Serumglukosekonzentration für ihre Studien Ergebnisse zu ermitteln.

  1. Induce Anästhesie, indem die Ratte in einer Induktion Kammer füllen und mit einer 30% oxygen/70% Lachgas Gemisch bei 5% Isofluran. Intubate mit einer 12-Gauge-Katheter mit einem Nagetier Laryngoskop und lüften mit 30% oxygen/70% Lachgas Gemisch mit 2,5% Isofluran. Ventilation Rate sollte 80 Atemzüge pro Minute bei 2,5 ml pro Atemzug.
  2. Geben Sie ein intraperitonealen Injektion von Ketamin (20 mg / kg) in Kochsalzlösung und reduzieren Isofluran auf 1,5%. WICHTIG Es ist zwingend notwendig, um das Niveau der Anästhesie während des gesamten Verfahrens zu überwachen, um eine angemessene chirurgische Ebene der Anästhesie zu gewährleisten. Um Narkosetiefe, Prise zwischen Hinterbeinen Extremitäten Ziffern zu überprüfen, während der Überwachung Pedal Reflex. Wenn der Reflex istvorhanden ist, ist die Anästhesie ausreichend. Nach Punktion der Arteria femoralis, den Blutdruck als Indikator für Anästhesie Ebene verwendet werden. Halten Sie die Dosis von Isofluran so niedrig wie möglich, während eines chirurgischen Ebene der Anästhesie, das Potenzial der post-ischämische Anfälle zu minimieren.
  3. Einschnitte wird am Hals und im Bereich des Beckens erfolgen. Shave den Hals und die rechte Becken, wo die Oberschenkel trifft den Bauch. Orient die Ratte in Rückenlage auf dem homöostatischen thermo-Decke und legen Sie die Verwendung von chirurgischen Rektalthermometer Schmiermittel. Bewerben Schutzbrille Schmiermittel. Eine 60-Watt-Glühbirne kann helfen, regulieren Temperatur. Die Lampe sollte nie näher als 8 Zoll von dem Tier. WICHTIG Temperaturen über oder unter normalen physiologischen Temperatur (37 ° C) stark beeinflussen können endgültige neurologische Schäden. Pflegen Kerntemperatur bei 37 ° C ± 0,5 ° C.
  4. Scrub die Bereiche Schnitt mit betadine und spülen mit 70% Ethanol. Wiederholen Sie diesen two weitere Male. Legen Sie eine OP-Feld über die Ratte, und schneiden Löcher, um die Schnitt freizulegen. WICHTIG carotis und femoralis, ohne dass eine Traumatisierung des umgebenden Muskulatur, die Erholung und minimiert spätere Notwendigkeit zur postoperativen Analgesie verbessern isoliert werden können.
  5. Bis eine adäquate Anästhesie, verwenden Sie ein Skalpell Nr. 10 einen Einschnitt an der Mittellinie entlang des Halses zu machen, dann mit hemostats unverblümt zwischen den Speicheldrüsen sezieren bis zum Erreichen des M. sternohyoideus, dem prominenten Mittellinie Muskelgruppe Abdecken der Luftröhre. Wieder mit vorsichtig stumpf Technik, trennen Sie die großen Muskelgruppen des M. sternohyoideus vom M. sternocleidomastoideus, bilateral. Diese beiden Muskelgruppen bilden eine dreieckige Vertiefung, die als Wahrzeichen verwendet werden kann, um die Gefäßnervenbündel, die Halsschlagader enthält lokalisieren. Die Arteria carotis Verzweigungen in die innere und äußere Halsschlagader. Isolieren Sie die Arteria carotis communis proximal der biFurkation.
  6. Vorsichtig trennen diese beiden Muskeln und suchen Sie die Halsschlagader. Um bei der Ermittlung des Schiffes Look für einen Puls. Isolierung der Halsschlagader auf beiden Seiten, indem ein ~ 5 cm Länge 3-0 Seidenfaden unter dem Schiff. Wegzuräumen Faszie aus den Gefäßen. VORSICHT Der Vagusnerv und sympathischen Ketten im zervikalen Gefäßnervenbündel enthalten sind und darauf zu achten, um zu vermeiden, was zu Schäden an, wenn die Isolierung des Halsschlagader werden.
  7. Mit einer Schere, um einen zweiten Einschnitt an der Leiste zu machen, entlang der Vertiefung, wo Hinterbeine Extremität Oberschenkelmuskulatur trifft den Bauch. Präparieren Sie unterhalb der Bauchmuskulatur, entlang der Oberschenkel-Muskulatur, bis Sie die Leistenbandes erreichen. Dies legt die femorale Gefäßnervenbündel. Sorgfältig isolieren die Arteria femoralis, indem ein ~ 5 Zoll Länge 3-0 Seidenfaden unter dem Schiff. Wegzuräumen Faszie verlassen 5-7 mm exponierter Behälter.
  8. Tie ein dauerhafter Knoten an dem distalen Ende des freigelegten Arterie.
  9. Anwenden Zug auf das Nahtmaterial an dem proximalen Ende der Arterie, um den Blutfluss zu verschließen, indem die Nähte gelehrt. Machen Sie einen kleinen Schnitt am oberen Rand des Gefäßes mit ophthalmologischen Schere. Unzureichende Traktion auf dem Schiff wird eine Blutung zur Folge, die durch die Anwendung schwerer Traktion gestoppt werden. Schließen Sie den Katheter an den Hahn.
  10. Mit Gefäßeinführungshülle, den Katheter-Schlauch in den Behälter, 7-9 mm über dem Gefäß Einschnitt und in Richtung der Mittellinie. Sobald der Katheter in der gewünschten Entfernung platziert wird, binden die lockeren Knoten rund um das Schiff und Katheter, um es zu sichern. Entfernen Traktion aus dem Behälter und lassen Sie es natürlich liegen.
  11. Verwalten 0,3 ml Heparin (100U/ml in Kochsalzlösung), intravenös. Spülen Sie jedeBlut aus dem Katheter mit einer kleinen Menge von Salz zu verhindern Blutgerinnung. Schalten Sie den Monitor und Druck Kalibrierung der Ausrüstung. Öffnen Sie die Hähne, damit der Wandler, um den Blutdruck zu erfassen. Um präzise Messungen des Blutdrucks zu erhalten, sollte die Positionierung des Systems nach der Kalibrierung nicht verändert werden.
  12. Isofluran Dosierung sollte so eingestellt werden, um einen mittleren arteriellen Blutdrucks (MAP) von 110 mmHg auf 130 mmHg ergeben. Das MAP sollte ein Hinweis auf angemessene chirurgische Ebene der Anästhesie.

3. Ischämie-Protokoll

Wie bereits erwähnt, liefert vier Gefäße Durchblutung des Gehirns. Proximale Okklusion der beiden Halsschlagadern nicht in Gehirn Ischämie führen, weil die Vertebralarterien durch den Kreis von Willis kompensieren. Es hat sich gezeigt, dass Carotisokklusion mit induzierten systemischen Hypotonie gekoppelt ist, wird durch die Perfusion Vertebralarterien was Hirnischämie begrenzen. Hier haben wir DESCRIBE das Protokoll für die Entnahme von Blut zu Hypotonie produzieren und Spannen der Halsschlagadern, um eine kontrollierte, reversible Ischämie zu erzeugen. Siehe Abbildung 1.

Blut-Sauerstoff und Kohlendioxid, Glucose-und pH-Wert kann zwischen Individuen in der Probe Gruppe variieren und verursachen Schwankungen in der Verletzung. Die Überwachung dieser physiologischen Variablen reduzieren Variabilität des Infarkts. Wie erwähnt, ist ein anderer Parameter Temperatur, die wichtig ist, um zu regeln, jedoch Hirntemperatur nicht auf Kerntemperatur entsprechen, wie stark Perfusion bei experimenteller Ischämie 28 beschränkt. Unsere spezifischen chirurgischen Einrichtung führt Temperaturänderungen im Gehirn, die Spiegel Änderungen der Kerntemperatur während der Ischämie. Jedoch ist es für den Experimentator diese empirisch durch Überwachen Gehirn Temperaturmessung mit Thermoelementen oder durch andere Mittel, um die Standardisierung des Verfahrens bestimmen wichtig. Wenn Kerntemperatur nicht spiegeln Gehirn temTemperatur, ist es wichtig, zur Aufrechterhaltung der Temperatur normothermic Gehirn während des gesamten Verfahrens, unabhängig von Kerntemperatur.

Randomisierung schreibt vor, dass der Chirurg das Tier randomisiert Ischämie oder Sham-Kontrollgruppe an dieser Stelle. Sham Operation folgen alle Verfahren genau das gleiche wie ischämischen Tieren ohne jede Senkung des Blutdrucks und der Halsschlagader Okklusion. Es ist wichtig, dass die Sham-Kontrollen im Rahmen der gleichen Dosis der Narkose für eine Dauer, die der ischämischen Tieren entspricht. Wenn es eine Behandlung Gruppe enthalten, die Anästhesie erfordert vor oder nach Ischämie, sollte Schein und unbehandelten Ischämie Gruppen entsprechen der Anästhesie Dosis und Dauer der Behandlung Gruppe.

  1. Bereit blutstillende Clips und Clip-Applikator. Clips sollte vollständig verschließen den Behälter, ohne irgendeine Trauma. Ischämie induziert werden können, wenn Hämodynamik geworden in Einklang gebracht werden. Schließen Sie ein 10 ml Heparin syringe auf den Hahn, senkrecht und proximal zu dem Katheter. Es sollte 0,3 ml (30 Einheiten) heparinisierter Kochsalzlösung in der Spritze, um die Koagulation des entnommenen Blutes zu verhindern.
  2. Stellen Sie einen Timer für 1 min und öffnen Sie den Hahn auf dem Heparin Spritze, so dass das Blut entnommen werden kann.
  3. Blutentnahme durch Ziehen am Kolben der Spritze. Wenn zu viel Sog angelegt wird, wird das Schiff zusammenbrechen oder Abdichtung gegen das Katheteröffnung und kein Blut gezogen werden. Es sollte möglich sein, 7-9 ml Blut in 1 min zu entfernen. Ist dies nicht der Fall ist, den Katheter vorgeschoben weiter in die Arterie und wiederholen. Wir finden, dass 7-9 ml Blut entfernt werden müssen, um die in der Nähe von MAP 30 mmHg, die angestrebte Blutdrucksenkung zu erreichen Ischämie zu reduzieren. WICHTIG Sicherstellen, dass das entnommene Blut bei 37 ° C gehalten wird, um die Kühlung während Blutreinfusion vermeiden.
  4. Nach dem 1 Minute Blutentnahme (7-9 ml Blut entnommen werden sollte) gelten blutstillende Clips zu den Halsschlagadern und beginnen einTimer für 8 min. Kontrollieren Sie sofort den Blutdruck. Wenn die Karte nicht bei 30 mmHg, Infusion oder Blutentnahme langsam auf 30 mmHg ± 1 mmHg erreichen. Setzen Sie diese Praxis während Ischämie zu MAP von 30 mmHg zu halten. WICHTIG Rekord Blutdruck während des gesamten Ischämie-Protokoll. Failure, um den Blutdruck zu 30 mmHg senken kann begrenzen Ischämie. Überwachung der Kern und / oder Gehirn eng Temperatur während Reinfusions als Erhöhungen oder Verminderungen der Temperatur beeinflussen können Hirnschäden.
  5. Am Ende 8 min, beginnen Reperfusion durch Entfernen der hämostatischen Klemmen und Reinfusion das Blut langsam 2 ml pro Minute.
  6. Wenn das Blut infundiert wurde die Kanüle aus der Arteria femoralis entfernt werden. Um jegliche Blutungen während der post-op, sicher zwei separate Knoten proximal der Einschnitt auf der Arterie zu vermeiden.
  7. Naht die Einschnitte mit einem diskontinuierlichen Muster unter Verwendung einer inversen Schneidnadel, mit 5-0 VICRYL Naht. Dieser Faden wird sich auflösen, so wird es nicht rEntfernung notwendig machen. HINWEIS Während des Verfahrens, wenn eine ausreichende Anästhesie kann nicht mit den unteren Ebenen von Isofluran erreicht werden, zu verwalten, eine zusätzliche Dosis von Ketamin.

4. Analgesie und Wiederherstellung

Tierschutz ist die Priorität während der Erholung sowie des chirurgischen Eingriffs. Post-operative Betreuung sollte den konkreten Vorgaben der Institution. Tiere, die globale Hirnischämie unterziehen sind anfällig für Anfälle. Um Beschlagnahme Auftreten minimieren, ist es wichtig, dass der Aufwachraum minimal Stimulation, dh Geräusche und Sehstörungen haben. Unter Verwendung unserer tierischen Protokoll, haus wir postoperativen Tiere für 72 Stunden in einem abgelegenen Raum für diesen Zweck.

  1. Nachdem die Einschnitte vernäht wurde die Ratte kann Entwöhnung vom Beatmungsgerät. Schalten Sie die Isofluran und weiterhin Belüftung bei 30% oxygen/70% Lachgas bis die Ratte beginnt, gegen das Beatmungsgerät zu atmen.
  2. Verwalten 0,5 mg / kg butorphanol in 5 ml Kochsalzlösung subkutan zwischen den Schulterblättern.
  3. Schnell Reinfundieren Blut erhöhen rechten Ventrikels Vorspannung. Dies erhöht Lungenkreislauf Druck und konnte Lungenödem verursachen. Zeichen hierfür sind erschwerte Atmung und knackende Geräusche während der Atmung. Anwenden positive endexspiratorischer Druck wird dazu beitragen, Lungenödem.
  4. Wenn freiwillige Kontrolle der Atmung wiedererlangt wird, extubieren, entfernen Sie das Thermometer und schalten Sie den Heizdecke. An diesem Punkt kann das Tier in eine Erholungskäfig platziert werden. Die Erholung Käfig sollte so positioniert Hälfte des Käfigs ist auf der Spitze eines zirkulierenden Wassers Decke (34 ° C) für die ersten 24 Stunden der Reperfusion werden. Legen Sie das Tier auf dem Teil des Käfigs Boden über die Heizdecke in Temperatur Wartung unterstützen. Sobald das Tier beginnt, aus der Narkose und Analgesie erholen, wird es um den Käfig zu bewegen, um sich thermoregulate. Die Tiere werden einzeln in post-op untergebracht werden.
  5. Das Tier sollte haben unbegrenzten Zugang zu Wasser. Für zwei Tage post-op, sollte dieses Wasser enthält 4 mg / kg Flüssigkeit Tylenol Lösung. Neben Nagetierfutter wird gesüßte Frühstücksflocken in den Käfig zu stimulieren essen und zu verhindern, Gewichtsverlust vorgesehen.
  6. Titelbild Hälfte der Käfig mit einem Tuch und genau beobachten, postoperative Genesung.
  7. Als das Tier aus der Narkose erholt ist es wichtig, für die Anzeichen von Leiden zu überwachen. Erschwerte Atmung oder inkonsistente kann ein Zeichen von Verzweiflung, möglicherweise durch Lungenödem oder Reizung der Atemwege während der Intubation verursacht werden. Butorphenol wird das Tier beruhigen, reduzierende Aktivität, jedoch mild Aktivität sollte innerhalb 1 Stunde wiederhergestellt werden. Wir finden Tiere beginnen zu essen und zu trinken Leckereien innerhalb von 4 h Extubation. Nach 12 Stunden, sollten ein normales Verhalten und Fütterung Aktivität wieder aufgenommen werden. Ein weiteres Zeichen der Not ist der Gewichtsverlust, ein Tier sollte nicht mehr als 20% des ursprünglichen Körpergewichts in einem 48-Stunden-Zeitspanne zu verlieren, wenn übermäßiger Gewichtsverlust is beobachtet das Tier eingeschläfert werden sollte.
  8. Humane Intervention ist notwendig, wenn Anfälle auftreten. Diese Art von epileptischer Aktivität ist in der Regel 24 bis 48 Stunden nach der Reperfusion gesehen. Anfälle können erhöht Hirnschäden, die unabhängig von dem ischämischen Insult per se verursachen, sollten also Anfallsaktivität ein Ausschlusskriterium in Kraft gesetzt vor Beginn der Studie 29 berücksichtigt werden. Anfälle können auftreten, wenn niemand anwesend ist, so ist es wichtig, die Zeichen zu erkennen. Bettwäsche wird gestört und vertrieben möglicherweise aus dem Käfig. Ein postiktalen Ratte haben eine matte Disposition mit schnellen, Atemnot und / oder haben eine Prellung oder Blutungen Nase.

Beachten Sie irgendwelche Anzeichen von Schmerzen oder Leiden werden sofort mit Schmerzmitteln gelindert. Wenn sympotoms nicht mit einer Dosis von Schmerzmitteln gelindert werden oder bleiben nach dem vierten aufeinanderfolgenden Dosis von Analgesie, wird das Tier eingeschläfert werden und ausgeschlossen aus der Studie. Chirurgische wounds sollten für die richtige Heilung für acht Tage post-op inspiziert werden.

5. Tissue Erhebung und Verarbeitung

Das Gehirn wird durch transkardialer Infusion von Paraformaldehyd fixiert. Nach groben Schnitte und Kryokonservierung, schnappen wir frieren das Gehirn und Abschnitt auf einem Kryostaten. Diese Abschnitte werden mit Gehirn Kresylviolett gefärbt und abgebildet auf einem Lichtmikroskop.

  1. Induce Anästhesie, indem das Tier in der Induktion Kammer und Füllen mit 30% Sauerstoff / 70% Lachgas mit 5% Isofluran. Intubate das Tier und lüften bei 30% Sauerstoff / 70% Lachgas mit 5% Isofluran.
  2. Bereiten Sie das Material für die Perfusion. Füllen ein Becherglas mit 100 ml 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° C und einem Becher mit 100 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 ° C. Das Gehirn wird mit PBS gespült, gefolgt von PFA, durch eine Perfusionspumpe. Schläuche werden in jedem Becher platziert und verbunden durch eine Drei-Wege-Hahn einllow einen reibungslosen Übergang von PBS zu PFA Perfusion. Legen Sie einen abgestumpften 18-Gauge-Nadel auf den Schlauch und füllen Sie die Zeile mit PBS. Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen in der Nadel und Schlauch als Luft bilden eine Embolie, die Durchblutung behindern könnten. Auch bereit einem kleinen Behälter mit PFA zum Eintauchen Fixierung des Gehirns.
  3. Verwenden Sie eine Flüssigkeit Auffangwanne, mit genügend Kapazität, um mindestens 200 ml Flüssigkeit zu halten. An diesem Punkt sollte das Tier mit Isofluran wurden lange genug (mindestens 3 min) zu erreichen tiefer Narkose beatmet.
  4. WICHTIG Vergewissern chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht wird.
  5. Gehen Sie durch einen Einschnitt, um die Brusthöhle durch den Bauch zugreifen. Klemmen Sie die absteigende Aorta. Wenn das Herz freigelegt wurde, legen die stumpfe Nadel 18 durch die Herzspitze in die Aorta. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof, damit Perfusat, um das Tier zu verlassen.
  6. Einschalten der Pumpe bei 50 ml / min, beginnend mit PBS. Nach pumping 100 ml PBS, schalten Sie den Hahn zu 100 ml PFA perfundieren.
  7. Entfernen Sie das Gehirn, kümmert sich nicht um das Gewebe zu beschädigen.
  8. Legen Sie das Gehirn in einer Gewebe-Matrix und schnitt zwischen dem Kleinhirn und Großhirn. Abschnitt das Vorderhirn; ~ 3 mm von der Vorderseite und der Rückseite der Großhirnrinde. Dies wird drei Sektionen produzieren, wird der mittlere Abschnitt enthält den Hippocampus.
  9. Legen Sie die Teile des Gehirns in einem Glas mit PFA genug für ein vollständiges Eintauchen. Immersion beheben das Gehirn für genau 2 Stunden.
  10. Um das Gewebe vor Schäden durch Frost zu schützen, wird das Gehirn durch den Austausch des PFA mit 30% Saccharose in PBS cryoproteced. Kryokonservierung ist komplett mit die Gewebeproben in der Saccharose-Lösung (~ 24-48 h) sinken.
  11. Um schnappen einfrieren Gehirn Abschnitte, legen Sie ein Becherglas in Trockeneis und füllen mit 2-methylbutanol für zehn Minuten. Legen Sie die Scheiben in das Gehirn methylbutanol für 5 min, dann in einen verschließbaren Behälter und bei -80 ° C zu übertragen, bis cryostSchneiden an.
  12. Kryostat Abschnitt das Gehirn bei 20 um, sammeln Sie mindestens 3 Abschnitte bei 3 Hirnatlas Koordinaten (Gehirn der Ratte in stereotaktischen Koordinaten. Paxinos und Watson, Platte § § 29, 31, 33 oder Bregma -2.8 mm, -3.3 mm und -3.8 mm). Die Schnitte werden auf geladene Objektträger gegeben und vor der Lagerung bei -80 ° C trocknen
  13. Kresylviolett (0,1% bei pH 3,5) Fleck 9 Gehirn Abschnitte, 3 an jedem Hirnatlas Koordinate.
  14. Bild der CA1 Region des Hippocampus bei 40x mit einem Mikroskop montierten Kamera und legen Sie eine 300 um Maßstab parallel mit der neuronalen Ebene CA1. Speichern Sie Bilder als TIFF-Dateien.

6. Brain Damage Quantifizierung

ImageJ, ein kostenloses Programm, durch das National Institute of Health angeboten werden, können verwendet werden, um zu zählen und zu quantifizieren, die lebensfähigen Neuronen, die das Ausmaß der Hirnschäden vertreten werden.

  1. Offene Mikroskop TIFF-Bilder mit dem 'Zellzähler' plugin von ImageJ. Wählen Sie einKennzeichnung Farbe und Anzahl Neuronen innerhalb der Grenzen der Maßstab. Neuronen basieren auf einfachen Einschlusskriterien auf neuronale Morphologie (groß, Pyramidenform) oder Ausschlusskriterien für Mikroglia / Astrozytenmorphologie (kleine, runde oder lange Röhrenform) basiert gezählt.
    WICHTIG Einklang mit Inklusion / Exklusion Kriterien zwischen den Folien und Einzelpersonen beim Zählen Neuronen.
  2. Nimm Neuron zählt und speichern Sie die Zelle Zähler Fenster.
  3. Neuron zählt sollte durch zwei getrennte Personen abgeschlossen werden, um konsistente, präzise Neuron zählt zu erreichen.
  4. Der Mittelwert aller 9 Bilder von jedem Tier wird eine einzige mittlere "Neuron count", das die quantitative Messung der CA1 Hippokampusschädigung um in der statistischen Analyse verwendet werden soll. Gruppen können statisch im Vergleich mit einem one-way ANOVA von HSD Test eines Tukey post hoc Analyse für, oder, wo Normalität Test fehl, ein Kruskal-Wallis-ANOVA auf den Rängen von Dunns po gefolgt werdenst-hoc-Analyse, um statistisch auswerten Unterschiede zwischen den Gruppen. Spezielle statistische Analyse der einzelnen Studiendesigns sollte vorgeschrieben werden, kann das hier vorgestellte nicht geeignet für die spezifischen Hypothesen getestet.

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Representative Results

Die 2VOH Modell der globalen Gehirn Ischämie / Reperfusion verursacht neuronalen Tod in der CA1-Region des Hippocampus. Abbildung 2 stellt die Verletzung von 8 min der globalen Gehirn Ischämie, 14 Tage nach der Reperfusion verarbeitet produziert. 2A und 2B vergleichen die hippocampi von Schein-und post-ischämische Hirn, mit Kresylviolett gefärbt. 2A zeigt eine Hippocampus von einer Schein-operierten Ratten, die normale Morphologie aufweist, einschließlich einer intakten CA1. 2B zeigt den Hippocampus unter Ischämie / Reperfusion, wo der Gyrus dentatus, CA2 und CA3 haben minimal Morphologie betroffen. Die selektiv anfällig Neuronen des Hippocampus CA1 nicht überleben Ischämie / Reperfusion und nur vereinzelte Neuronen bleiben. Allerdings sind dramatische Steigerung der infiltrierenden Makrophagen und / oder Mikroglia (Iba-1-positive Zellen) und reaktiven Astrozyten (GFAP-positive Zellen) in der CA1 h offensichtlichippocampal Feld. Spezifische Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Neuronen mit NeuN, Makrophagen / Mikroglia Kennzeichnung mit Iba-1 und Astrozyten Kennzeichnung mit GFAP bestätigen diese Erkenntnisse.

2C zeigt Probe Neuron Zählfenstern für Mikroskop-Bilder der CA1 bei 40-facher Vergrößerung. Das obere Feld zeigt CA1 aus einer Sham-Kontrolle und die untere Graphik zeigt die CA1 folgenden Ischämie / Reperfusion. Der Geschädigte CA1 zeigt eine Färbung, die Mikroglia und Astrozyten, die kleine und Rohr-oder tropfenförmige erscheinen umfasst. Diese können von Neuronen, die durch ihre Form unterscheiden. Intact Hippocampusneuronen, ob im Gyrus dentatus sind CA2 oder CA1, groß mit einem runden oder Pyramidenform.

2D ist eine grafische Analyse der 2VOH induzierte Schädigung neuronaler CA1 zählt quantifiziert. Daraus kann geschlossen werden, dass 8 min der Ischämie durch die 2VOH Modell hergestellt werden kann eine konsistente und reproducible Verletzung, die sich in erster Linie auf die CA1 Hippocampus isoliert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Experimentelle Timeline. Die experimentelle Timeline ist eine Darstellung der chirurgischen Schritte und Gewebe Verarbeitung.

Abbildung 2
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse. Hippokampusschädigung in einer unbehandelten Ratte I / R (B) im Vergleich zu einer Sham-Ratten-(A) unterzogen. Kresylviolett gefärbten Hippocampus (10X) [Surround] 40x Vergrößerungen der CA1, CA2, CA3, Hilus und DG (oben Lefta Uhrzeigersinn). (B) Schäden an den CA1 hippoc lokalisiertampus. (C) Repräsentative Zählfenstern für Neuron Zählen und Schäden Quantifizierung in einer Schein-operierten Kontrolltieren (oben, Kontrolle) und ein Tier ausgesetzt globale Gehirn Ischämie (unten, I / R). (D) Repräsentative Quantifizierung von CA1 Hippocampus zählt von einer unveröffentlichten Studie (Mittelwert + Standardabweichung, n = 8, p <0,05).

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Discussion

Das hier beschriebene Modell erzeugt einen ischämischen Insult an das Gehirn, die als Folge von Herzstillstand und Reanimation auftreten kann, wodurch eine Verletzung ähnlich wie beim Menschen. Das Verfahren zur Herstellung globalen Hirnischämie eines von mehreren Protokollen. Wir nutzen dieses Protokoll vor allem für seine vergleichsweise niedrige Mortalitätsrate, eine schnelle Heilung und reproduzierbare Ergebnisse. Der Herzstillstand / Wiederbelebung Modell ist wohl die klinisch relevanten Modell ist jedoch technisch am schwierigsten zu ständig reproduzieren. Die 4VO Modell der globalen Hirnischämie ist ein weiteres häufig verwendetes Protokoll, wertvoll in der Tatsache, dass alle vier Schiffe einen Beitrag während der Ischämie sind verschlossen. Dieses Modell hat auch Nachteile, die mehrere Operationen und die Möglichkeit der neuroprotektive Vorkonditionierung gehören. Die 4VO Modell angepasst wurde, so dass transiente Okklusion aller vier Schiffe während eines Verfahrens zur Ischämie produzieren, aber die Operation bleibt technischely anspruchsvolle 30.

Variationen über 2VOH haben gezeigt, dass eine Reihe von Ergebnissen 31,32 erzeugen. Dauer der Ischämie und der Grad der Hypotonie sind die wichtigsten Variablen, die das Ergebnis beeinflussen können. Berichte haben gezeigt, dass, wenn der Blutdruck nicht ausreichend gesenkt wird die Verletzung produziert kann inkonsistent oder unilateral in Ratten 30. Wir haben 30 mmHg festgestellt, dass ein optimales Maß an Hypotonie sein, weil es zuverlässig Ischämie erzeugt, ohne dass nennenswerte peripheren Verletzung. Dieses Paradigma produziert Ischämie als schwer gekennzeichnet, aber nach unserem Protokoll wird die ansonsten erhöhte Wahrscheinlichkeit von Komplikationen zu reduzieren. Die schwere Art der Beleidigung kann der Grund leichte Variation in physiologischen Parametern zwischen Tieren in der Regel nicht beeinflusst Verletzungen Konsistenz sein.

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Disclosures

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting Ethicon J391H
Scalpel, No.10 Swann-Morton 6601
Gauze Sponges Fisher 22-362-178
18G x 1 ½ in needle BD 305201
23G x 1 in needle BD 305145
26 G x 3/8 in needle BD 305110
18 G x 1 ¼ catheter EXEL 26735
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
60 ml syringe BD 309653
Surgilube Henry Schein 1152666
.9% Saline, plastic IV bag Henry Schein 1537468
Suture 3-0 Silk Henry Schein 1007842
Puralube Ophthalmic Ointment Henry Schein 3390017
Betadine Henry Schein 6903564
Sterile Towel Drape Moore Medical 14170
Polyethylene Tubing, 50 Intramedic 427411
Stopcock, 3 way Smiths medical MX9311L
Drug Name
AERRANE (isoflurane) Henry Schein 2091966
Mapap Liquid (Tylenol) Major Pharmaceuticals 1556
Kedavet (ketamine) Ketathesia Butney NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol) Lloyd Labs 4881
Heparin APP Pharmaceuticals 504011
Chemical Name
Paraformaldehyde prills Elecron Microscopy Sci. 19202
2-methylbutane Sigma 270342
Cresyl Violet Acetate Sigma C5042
Sucrose Sigma S9378
Software
ImageJ NIH

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